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    氯普魯卡因通過調(diào)控長(zhǎng)鏈非編碼RNA TTN?AS1表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響

    2021-10-30 05:52:26彭湃楊軍邱勇
    安徽醫(yī)藥 2021年11期

    彭湃,楊軍,邱勇

    膠質(zhì)瘤是常見的原發(fā)性腦腫瘤,其呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng),易轉(zhuǎn)移,其治療方式仍以手術(shù)切除為主,同時(shí)輔以放、化療,然而目前膠質(zhì)瘤的治療效果還不盡如人意。研究表明很多腫瘤病人在術(shù)后腫瘤易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,影響病人生存率,而麻醉藥可影響腫瘤的微轉(zhuǎn)移。氯普魯卡因(chloroprocaine,CP)是一類新型的酯類高效局麻藥,其起效快、效果確切、不良反應(yīng)小、麻醉效應(yīng)強(qiáng),麻醉后恢復(fù)快的優(yōu)點(diǎn)。研究報(bào)道CP可抑制人宮頸癌細(xì)胞HeLa和CaSki增殖,誘導(dǎo)抑癌基因上皮型鈣黏蛋白1(epithelial cadherin 1,CDH1)、結(jié)腸腺瘤性息肉病基因(adenomatous polyp?osis coli,APC)及P16啟動(dòng)子去甲基化。CP可抑制乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞活力和遷移。Titin 反義RNA 1(titin antisense RNA 1,TTN-AS1)在肺腺癌的組織和細(xì)胞中上調(diào),并與較差的總體生存率相關(guān),TTN-AS1 可促進(jìn)肺癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。TTN-AS1 在食管鱗狀細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中高表達(dá),并促進(jìn)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。TTN-AS1 通過miR-573/E2F 轉(zhuǎn)錄因子3(E2F3)促進(jìn)宮頸癌中的細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。以上研究表明CP 具有一定的抑癌作用,TTN-AS1也與癌癥的增殖、轉(zhuǎn)移相關(guān),然而CP和長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)TTN-AS1 對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響還尚未可知。因此,本實(shí)驗(yàn)自2019 年6—11 月研究氯普魯卡是否通過調(diào)控TTNAS1表達(dá)影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞與主要試劑

    膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251 購(gòu)自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自上海浩然生物技術(shù)有限公司;鹽酸氯普魯卡因購(gòu)自上海廣銳生物科技有限公司;噻唑蘭(MTT)試劑盒、RIPA 蛋白裂解液購(gòu)自美國(guó)Sigma;Transwell 小室、Matrigel、熒光定量PCR 試劑盒購(gòu)于上海研卉生物科技有限公司。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

    U251 細(xì)胞用RPMI-1640 培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,分別用濃度為1 mmol/L、3 mmol/L、9 mmol/L 的CP 培養(yǎng)細(xì)胞作為CP低、中、高濃度組;未經(jīng)任何處理的細(xì)胞作為對(duì)照組。將si-NC、si-TTN-AS1 轉(zhuǎn)染至U251 細(xì)胞中,記為si-NC組、si-TTN-AS1組;將pcDNA、pcDNA-TTN-AS1轉(zhuǎn)染至U251 細(xì)胞中再用9 mmol/L 的CP 培養(yǎng),記為CP+pcDNA組、CP+pcDNA-TTN-AS1組。

    1.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率

    細(xì)胞培養(yǎng)48 h,按試劑盒說明書操作,最后檢測(cè)490 nm 處吸光度(OD)值;計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(%)。

    1.4 蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)法檢測(cè)蛋白表達(dá)

    提取各組細(xì)胞總蛋白,進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜、封閉,加入細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A(p21)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)等一抗(1∶1 000)4 ℃孵育過夜,再加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h,顯影后分析蛋白條帶的灰度值。

    1.5 Transwell 檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲

    遷移:將100 μL 細(xì)胞懸液加入Transwell 小室上室,培 養(yǎng)24 h,多聚甲醛固定,結(jié)晶紫染色,顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。侵襲:用Matrigel 包被Transwell 小室上室,然后與遷移操作一樣。

    1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)lncRNA TTN-AS1表達(dá)水平

    提取各組細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,按照試劑盒說明以GAPDH 為內(nèi)參進(jìn)行擴(kuò)增,相對(duì)表達(dá)量用2法計(jì)算。

    2 結(jié)果

    2.1 CP 對(duì)膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞增殖的影響

    相較于對(duì)照組,低、中、高濃度CP 處理可提高U251 細(xì)胞增殖抑制率和p21 表達(dá)水平,降低CyclinD1 表達(dá)水平,且呈濃度依賴性(

    P

    <0.05)。見圖1、表1。

    圖1 氯普魯卡因(CP)對(duì)增殖相關(guān)蛋白的影響

    表1 氯普魯卡因(CP)對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖的影響/± s

    2.2 CP 對(duì)膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞遷移侵襲的影響

    相較于對(duì)照組,低、中、高濃度CP處理可降低遷移侵襲數(shù)及MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平,呈濃度依賴性(

    P

    <0.05)見圖2、表2。

    圖2 氯普魯卡因(CP)對(duì)基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)蛋白表達(dá)的影響

    表2 氯普魯卡因(CP)對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞遷移侵襲的影響/± s

    2.3 CP 對(duì)膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞中l(wèi)ncRNA TTN-AS1表達(dá)的影響

    相較于對(duì)照組(1.00±0.09),低(0.78±0.07)、中(0.65±0.06)、高(0.52±0.05)濃度CP 處理可降低TTN-AS1 表達(dá)水平,呈濃度依賴性(

    F

    =78.958,

    P

    =0.000)。

    2.4 干擾lncRNA TTN-AS1表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響

    相較于si-NC 組,干擾ln?cRNA TTN-AS1 可提高細(xì)胞增殖抑制率和p21 表達(dá)水平,減少細(xì)胞遷移侵襲數(shù),且降低CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平(

    P

    <0.05)。見圖3,表3。

    表3 干擾lncRNA TTN-AS1表達(dá)對(duì)U251細(xì)胞增殖和遷移侵襲的影響/± s

    圖3 干擾lncRNA TTN-AS1表達(dá)對(duì)細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A(p21)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)蛋白表達(dá)的影響

    2.5 lncRNA TTN-AS1 過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了CP(9 mmol/L)對(duì)膠質(zhì)瘤U251 細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用

    相較于CP+pcDNA 組,CP+pcDNA-TTN-AS1 組細(xì)胞增殖抑制率和p21 表達(dá)水平降低,而遷移侵襲細(xì)胞數(shù)以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9 表達(dá)水平升高(

    P

    <0.05)。見圖4,表4。

    圖4 細(xì)胞周期蛋白D1(CyclinD1)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A(p21)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)蛋白的表達(dá)

    表4 lncRNA TTN-AS1過表達(dá)逆轉(zhuǎn)了氯普魯卡因(CP)(9 mmol/L)對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用/± s

    3 討論

    復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是目前腫瘤治療的難點(diǎn),手術(shù)是腫瘤治療的基礎(chǔ)和主要方式,研究表明局部麻醉藥可影響某些腫瘤細(xì)胞的凋亡、增殖、轉(zhuǎn)移。且研究報(bào)道麻醉藥也可影響膠質(zhì)瘤,研究麻醉藥對(duì)膠質(zhì)瘤侵襲遷移影響,可為圍手術(shù)期合理應(yīng)用麻醉藥及改善病人預(yù)后提供新思路。有研究表明,普魯卡因可抑制膀胱癌細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,將腫瘤細(xì)胞阻滯于G0/G1期。羅哌卡因能抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和結(jié)腸癌皮下瘤的生長(zhǎng)。利多卡因可抑制乳腺癌和前列腺癌細(xì)胞侵襲、遷移。以上研究表明,不同麻醉藥均有一定的抑癌作用。本實(shí)驗(yàn)用不同濃度的CP 處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 后,U251 細(xì)胞增殖抑制率升高,細(xì)胞遷移侵襲數(shù)減少;表明氯普魯卡可抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

    研究表明lncRNA 也參與調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究報(bào)道lncRNA TTN-AS1 在甲狀腺乳頭狀癌組織和細(xì)胞中高表達(dá),其表達(dá)水平與淋巴轉(zhuǎn)移、TNM 分期和病人的整體生存率有關(guān),抑制TTN-AS1表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖,遷移,侵襲和EMT。TTNAS1 高表達(dá)與肺腺癌病人的TNM 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和術(shù)后預(yù)后差也有關(guān),敲除TTN-AS1 可抑制肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲。沉默TNN-AS1 明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。沉默TTN-AS1 通過上調(diào)miR-1271 抑制前列腺癌的增殖和遷移。以上研究表明TNN-AS1 參與多種腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移等過程,還與病人的生存及預(yù)后有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)抑制TN-AS1抑制可提高細(xì)胞增殖抑制,降低細(xì)胞遷移侵襲數(shù);說明抑制TTN-AS1 表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。用不同濃度的CP處理膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 后,TTN-AS1 表達(dá)水平顯著降低;而過表達(dá)TTN-AS1 逆轉(zhuǎn)了CP 對(duì)U251 細(xì)胞的作用。以上研究表明,CP 可能通過調(diào)控TTN-AS1 影響膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

    綜上所述,CP 通過下調(diào)lncRNA TTN-AS1 表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。

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