重組人干擾素γ對(duì)變應(yīng)性鼻炎大鼠Toll樣受體4/核因子-B信號(hào)通路及血清炎癥因子的影響

陸智蕓，許水森，農(nóng)應(yīng)全

變應(yīng)性鼻炎（AR）是變應(yīng)原吸入機(jī)體后造成T淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤，免疫球蛋白E（IgE）所介導(dǎo)免疫細(xì)胞將化學(xué)遞質(zhì)釋放后引發(fā)的變態(tài)反應(yīng)炎性疾病，臨床表現(xiàn)噴嚏、鼻黏膜腫脹及鼻癢等。相關(guān)流行病學(xué)研究顯示，國內(nèi)AR發(fā)病率逐年升高，已是臨床主要呼吸道疾病之一。當(dāng)前，臨床對(duì)AR 治療主要為白三烯受體拮抗劑、抗組胺類及糖皮質(zhì)激素等藥物，關(guān)于重組人干擾素γ（IFN-γ）對(duì)AR治療機(jī)制研究較少。在AR致敏與激發(fā)階段中IgE有重要影響，有報(bào)道稱，AR 疾病嚴(yán)重程度和IgE 含量呈正相關(guān)。IFN-γ 作為巨噬細(xì)胞活化因子，由活化Th1細(xì)胞所分泌，可對(duì)IgE所介導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)拮抗，有免疫調(diào)節(jié)作用。Toll樣受體（TLRs）為主要免疫受體，對(duì)不同病原體識(shí)別并啟動(dòng)不同信號(hào)傳導(dǎo)通路，在機(jī)體獲得性與先天性免疫中有重要影響。NF-B在幾乎所有細(xì)胞內(nèi)均存在，對(duì)細(xì)胞生長發(fā)育及機(jī)體的免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)可起到重要作用，在變應(yīng)性疾病中，核因子- B（NF-B）參與嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤、遷移和生長等，并使相關(guān)細(xì)胞因子激活，對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞凋亡抑制；還可加速白細(xì)胞介素-5（IL-5）、IL-4等Th2相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)，抑制IFN-γ等Th1相關(guān)細(xì)胞表達(dá)，對(duì)Th1/Th2平衡影響。因此，本研究自2019年5―11月分析重組人干擾素γ對(duì)AR大鼠TLR4/NF-B信號(hào)通路及炎癥因子影響，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)大鼠

SPF級(jí)雄性大鼠60只，6周齡，購自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，許可證號(hào)：SCXK（川）：2019-29，體質(zhì)量（106.17±8.52）g，范圍為90～120g。常規(guī)飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。本研究中對(duì)于大鼠的處理符合動(dòng)物倫理學(xué)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物、試劑與儀器

藥物、試劑：注射用重組人IFN-γ（規(guī)格：50 萬IU/瓶子，麗珠生物工程制藥公司），4% 多聚甲醛（北京索萊寶科技公司），雞卵清蛋白Ⅴ級(jí)（美國Sigma-Aldrich 公司），PCR 試劑盒（日本Takara 公司），IFN-γ、IgE、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、IL-4、IL-6 及IL-10（欣博盛生物科技公司），RNA 提取試劑盒（美國Invitrogen 公司），NF-B、TLR4 抗體（美國Cell signling 公司）。儀器：雙垂直電泳槽（型號(hào)DYCZ-24D，北京六一儀器廠），臺(tái)式高速離心機(jī)（型號(hào)Allegra X-30R，美國貝克曼庫爾特公司），轉(zhuǎn)印電泳槽（型號(hào)DYCZ-40D，北京六一儀器廠），MODEL550 酶標(biāo)儀（美國BIO-RAD 公司），恒溫水浴鍋（上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備公司）。

1.3 研究方法

隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為實(shí)驗(yàn)組、正常組與模型組，每組20 只，模型組與實(shí)驗(yàn)組大鼠依據(jù)劉敏等方法制備AR 模型，1 mL 生理鹽水內(nèi)溶解0.3 mg卵清白蛋白（抗原）與30 mg AI（OH）（佐劑）制備為混懸液，腹腔注射以基礎(chǔ)致敏，每次注射間隔1 d，共持續(xù)注射8 次。第16 天起，使用微量加樣器將劑量為10 mg/100 L 的卵清白蛋白經(jīng)鼻滴入50 L，持續(xù)7 d強(qiáng)化致敏。末次治療后觀察30 min內(nèi)大鼠的打噴嚏與撓鼻狀況，按照行為學(xué)指標(biāo)評(píng)分，成功造模為評(píng)分≥5分。由第22天建立模型后，依據(jù)人和動(dòng)物劑量轉(zhuǎn)換公式，實(shí)驗(yàn)組大鼠采用20 IU 的重組人IFN-γ 滴鼻治療，1 次/天，正常組與模型組采用等劑量生理鹽水滴鼻，持續(xù)14 d。

1.4 觀察指標(biāo)

（1）行為學(xué)評(píng)分：各組大鼠由基礎(chǔ)致敏到停止給藥5 周內(nèi)，在每周的末次給藥0、0.5、1、2 h 對(duì)大鼠行為進(jìn)行觀察，依據(jù)行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分：不停擦鼻，清涕流至面部，噴嚏數(shù)≥11個(gè)計(jì)3分；兩前肢撓鼻，清涕超出前鼻孔，噴嚏數(shù)4～10 個(gè)計(jì)2 分；單前肢偶有撓鼻，清涕流至前鼻孔，噴嚏數(shù)1～3 個(gè)計(jì)1分。（2）檢測(cè)鼻黏膜組織：末次給藥后處死大鼠，采用鼻腔暴露法將大鼠鼻腔外側(cè)壁與鼻中隔呼吸區(qū)黏膜組織快速取出，10% 甲醛固定后酒精梯度脫水、透明，包埋后切片，厚度4 m，常規(guī)行HE 染色，觀察大鼠鼻黏膜組織病理狀況；每張病理切片隨機(jī)選取高倍視野（10×40）5 個(gè)，計(jì)算大鼠鼻黏膜內(nèi)肥大細(xì)胞與嗜酸粒細(xì)胞數(shù)量。（3）末次給藥后，采集大鼠腹主動(dòng)脈血清，室溫下放置1 h，而后4 ℃、2 500 r/mim 離心10 min，選取上清液放置于EP管內(nèi)，ELISA法檢測(cè)血清IL-10、IFN-γ、IL-6、IgE、TNF-α、IL-4 含量。（4）RTPCR 檢測(cè)鼻黏膜組織TLR4 與NF-B p65 mRNA 相對(duì)表達(dá)量：Trizol 提取細(xì)胞總RNA，TLR4 正向引物5’-GATCTAGCATCAGCTGTAC，反 向 引 物5’-GCAT?CATCGTACGATCGAT-3’；NF-B p65 正向引物5’-GATCGATCAGTAGTCATGA-3’，反 向 引 物5’-GTAGCTCGATCGATCAGTC-3’；內(nèi)參β-actin 正向引物5’-GACTAGCATCGATCATTA-3’，反向引物5’-GATCATGCTAGCATCTAGA-3’。 PCR 反應(yīng)條件：92 ℃40 s，55 ℃450 s，74 ℃70 s，循環(huán)40 次后取TLR4與NF-B p65 mRNA 循環(huán)閾值（Ct），ΔΔCt（ΔΔCt=Ct 目的基因－ΔCt 內(nèi)參基因）分析，計(jì)算2目的基因相對(duì)表達(dá)量。（5）蛋白質(zhì)印跡法（Western blot?ting）檢測(cè)各組大鼠鼻黏膜組織內(nèi)TLR4 與NF-B p65蛋白表達(dá)：常規(guī)提取細(xì)胞總蛋白，上樣電泳，80 V 電壓，溴酚藍(lán)染料至分離膠提高電壓為100 V，分離膠下泳出溴酚藍(lán)結(jié)束電泳。PVDF膜內(nèi)蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移，30 mA 恒流，持續(xù)80 min。5%TBST 脫脂奶粉封閉PVDF 膜，震蕩50 min。封閉結(jié)束后洗膜3 次， 10分鐘/次，膜移至雜交袋，置入漂洗液稀釋抗體，孵育過夜。洗膜3 次，10 分鐘/次，置入過氧化物酶標(biāo)記二抗，震蕩50 min。ECL 顯色液中將PVDF 膜溫育6 min，分別曝光、顯影、定影。沖洗后晾干掃描。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠行為學(xué)評(píng)分情況

實(shí)驗(yàn)組與模型組大鼠在基礎(chǔ)致敏階段狀態(tài)良好，排便與飲食、飲水正常；藥物激發(fā)3 d 后，實(shí)驗(yàn)組與模型組大鼠表征為毛發(fā)凌亂、煩躁易驚，激發(fā)完成后大鼠前鼻孔流出大量鼻涕，用前爪頻繁撓鼻并打噴嚏，2 h 后部分大鼠癥狀有所緩解。強(qiáng)化致敏7 d 完成后，實(shí)驗(yàn)組大鼠行為學(xué)評(píng)分為（7.68±1.52）分，模型組為（7.81±1.43）分，均高于正常組的（2.95±0.57）分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均

P

<0.05），說明成功建模。末次給藥后實(shí)驗(yàn)組大鼠流涕、噴嚏和撓鼻等狀況較模型組顯著好轉(zhuǎn)，行為學(xué)評(píng)分降低至（3.98±0.64）分，較模型組的（8.49±1.53）分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

<0.05）。

2.2 各組大鼠鼻黏膜病理狀況

和正常組相比，模型組大鼠其鼻黏膜的假復(fù)層纖毛柱狀上皮呈現(xiàn)連續(xù)性中斷，纖毛發(fā)生倒伏且部分脫落，腺管變粗，基底細(xì)胞與柱狀細(xì)胞剝脫，腺體變多，固有層內(nèi)結(jié)締組織增生，杯狀細(xì)胞增生，并伴隨大量炎癥細(xì)胞浸潤。實(shí)驗(yàn)組大鼠較模型組鼻黏膜上皮顯著好轉(zhuǎn)，固有層內(nèi)炎癥細(xì)胞數(shù)量大幅降低，肥大杯狀細(xì)胞減少，擴(kuò)張腺管與腺體接近正常。

2.3 各組大鼠鼻黏膜內(nèi)肥大細(xì)胞與嗜酸粒細(xì)胞數(shù)量情況

模型組大鼠鼻黏膜內(nèi)肥大細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞數(shù)量較正常組升高，實(shí)驗(yàn)組大鼠鼻黏膜內(nèi)肥大細(xì)胞、嗜酸粒細(xì)胞數(shù)量較模型組降低（

P

<0.05），見表1。

表1 各組大鼠鼻黏膜內(nèi)肥大細(xì)胞與嗜酸粒細(xì)胞數(shù)量/（個(gè)/高倍視野，± s）

2.4 各組大鼠血清炎癥因子含量情況

模型組大鼠血清IFN-γ、IL-10 含量低于正常組，IgE、TNF-α、IL-4、IL-6 含量高于正常組；實(shí)驗(yàn)組大鼠血清IFN-γ、IL-10 含量高于模型組，IgE、TNF-α、IL-4、IL-6 含量低于模型組（

P

<0.05），見表2。

表2 各組大鼠血清炎癥因子含量對(duì)比/（ng/L，± s）

2.5 各組大鼠鼻黏膜組織TLR4 與NF-B p65 mRNA 表達(dá)情況

模型組大鼠鼻黏膜組織TLR4、NF-B p65 mRNA 相對(duì)表達(dá)量較正常組升高，實(shí)驗(yàn)組大鼠鼻黏膜組織TLR4、NF-B p65 mRNA相對(duì)表達(dá)量較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

<0.05），見表3。

表3 大鼠鼻黏膜組織TLR4與NF-B p65 mRNA表達(dá)對(duì)比/± s

2.6 各組大鼠鼻黏膜組織TLR4 與NF-B p65 蛋白表達(dá)情況

模型組大鼠鼻黏膜組織TLR4、NF-B p65蛋白表達(dá)較正常組升高，實(shí)驗(yàn)組大鼠鼻黏膜組織TLR4、NF-B p65 蛋白表達(dá)較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

<0.05），見表4。

表4 各組大鼠鼻黏膜組織TLR4與NF-B p65蛋白表達(dá)對(duì)比/± s

3 討論

重組人IFN-γ 為一種生物制劑，多用于肝纖維化和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等治療，近些年來逐漸應(yīng)用于AR 的治療，其對(duì)于臨床AR 病人有一定療效，但相關(guān)機(jī)制研究較少。機(jī)體免疫內(nèi)TLR 為哺乳動(dòng)物細(xì)胞唯一能夠把細(xì)胞外抗原信息傳遞至細(xì)胞內(nèi)的跨膜蛋白，對(duì)識(shí)別病原體有重要的影響。TLR 多在哺乳動(dòng)物免疫細(xì)胞表面表達(dá)，可對(duì)病原微生物生化內(nèi)特定病原體特異性識(shí)別。呼吸道鼻黏膜內(nèi)黏膜內(nèi)皮細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、黏膜上皮細(xì)胞與巨噬細(xì)胞等分布著不同TLR 的亞型，而不同亞型對(duì)于特定微生物的感染源形成免疫應(yīng)答。致敏原接觸特應(yīng)性個(gè)體后造成Th1/Th2 細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的不平衡，在疾病發(fā)生中Th2 型細(xì)胞因子表達(dá)量升高，對(duì)疾病發(fā)生有重要影響。相關(guān)研究顯示，采用脂多糖刺激哮喘小鼠，其機(jī)體內(nèi)Th2含量明顯升高，但在敲除TLR4 基因小鼠內(nèi)Th2 含量卻未明顯上升。同時(shí)，TLR4 活化將NF-B 通路激活，NF-B 通路為介導(dǎo)細(xì)胞信號(hào)傳遞關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子，可經(jīng)炎性介質(zhì)、炎性相關(guān)因子和免疫調(diào)節(jié)間級(jí)聯(lián)放大瀑布效應(yīng)，在免疫反應(yīng)與炎性反應(yīng)中起到樞紐作用，對(duì)機(jī)體內(nèi)多個(gè)信號(hào)通路傳導(dǎo)有關(guān)鍵影響，參與了多種基因的調(diào)控與表達(dá)。

有報(bào)道稱在AR 發(fā)病過程中TLR4/NF-B 信號(hào)通路起到了重要影響，TLR4 結(jié)合外源性配體將TLR4-MyD88 依賴性途徑活化，激活NF-B 通路。NF-B亞基p65活化后可對(duì)轉(zhuǎn)錄元件直接作用將轉(zhuǎn)錄過程激活，進(jìn)而啟動(dòng)系列免疫相關(guān)基因，包含趨化因子、黏附分子及前炎性介質(zhì)等轉(zhuǎn)錄過程，增大其表達(dá)量，促進(jìn)炎性細(xì)胞的浸潤，加重或誘發(fā)炎癥反應(yīng)。另外，NF-B p65 活化后可將核內(nèi)相關(guān)基因表達(dá)啟動(dòng)，造成Th1/Th2 失衡，Th2 細(xì)胞比例升高。本文研究顯示，模型組大鼠鼻黏膜組織TLR4、NF-B p65 蛋白與mRNA 表達(dá)較正常組升高，實(shí)驗(yàn)組大鼠鼻黏膜組織TLR4、NF-B p65蛋白與mRNA表達(dá)較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明重組人IFN-γ 可阻斷AR 大鼠機(jī)體內(nèi)TLR4/NF-B 信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)。AR 發(fā)生主要因素為Th1/Th2 失衡，其中Th2 可形成IL-10、IL-4 等細(xì)胞因子，介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，Th1 則釋放IFN-γ、IL-2 等，參與細(xì)胞免疫應(yīng)答，Th1 所產(chǎn)生IFN-γ 是主要抗炎因子，抑制機(jī)體內(nèi)IgE。而Th2 所形成的IL-4 等對(duì)變應(yīng)性炎癥反應(yīng)有廣泛影響，包括產(chǎn)生肥大細(xì)胞、形成黏液、嗜酸性粒細(xì)胞成熟、氣道高反應(yīng)性及生成IgE 等，同時(shí)，IL-4 可刺激IgE 基因重組與IgE 信使的RNA 轉(zhuǎn)錄，增大B 細(xì)胞所產(chǎn)生IgE的舒朗，機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)于小量抗原的刺激發(fā)生免疫應(yīng)答。本文研究顯示，模型組大鼠血清IFNγ、IL-10 含量低于正常組，IgE、TNF-α、IL-4、IL-6 含量高于正常組；實(shí)驗(yàn)組大鼠血清IFN-γ、IL-10含量高于模型組，IgE、TNF-α、IL-4、IL-6 含量低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明重組人IFN-γ 可抑制炎癥因子表達(dá)，糾正Th1/Th2的失衡狀態(tài)。

綜上所述，重組人干擾素γ 可降低變應(yīng)性鼻炎大鼠血清炎癥因子含量，減少生成IgE，調(diào)節(jié)T 細(xì)胞免疫失衡，其作用機(jī)制可能和抑制TLR4/NF-B 信號(hào)通路表達(dá)有關(guān)。