miR-143介導ADAM17基因對子宮內膜癌細胞生物活性的作用機制

王秋宇 姜 平 朱軍義 許 靜 李和麗 郭 哲

（南陽市中心醫(yī)院婦科，南陽 473000）

子宮內膜癌是發(fā)生在子宮內膜上的疾病，發(fā)病人群趨于年輕化[1]。目前，對子宮內膜癌發(fā)生的危險因素及其生物學行為尚不明確。隨著子宮內膜癌的發(fā)展，癌細胞浸潤程度的增加，生存率不斷降低，闡明其發(fā)病機制對子宮內膜癌防治具有重要作用[2]。微小RNA（microRNA，miRNA）是由18～24個核苷酸組成的非編碼RNA，對多種基因具有調節(jié)作用，能夠進行DNA調節(jié)，誘發(fā)mRNA降解，調節(jié)細胞生物活性。以往研究文獻表明，miRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有相關性。miR-143屬于其中之一，已經(jīng)證實其在宮頸癌及腎癌中具有抑制癌細胞活性的作用[3]。解整合素金屬蛋白酶17 （disintegrin and metalloproteinase domaincontaining protein 17，ADAM17）生物活性廣泛，具有解聚素和金屬蛋白酶的作用。眾多學者認為在多種惡性腫瘤中ADAM17陽性率顯著高于癌旁組織[4]。目前，關于miR-143對子宮內膜癌及ADAM17作用的研究較少。本研究通過體外培養(yǎng)子宮內膜癌細胞并轉染miR-143，觀察其生物活性和對ADAM17水平的影響。

1 材料和方法

1.1 細胞來源和主要試劑

人子宮內膜癌HEC-1B細胞購自中國醫(yī)學科學院細胞中心。miR-143 mimics，miR-143-NC（上海生工）；兔抗人ADAM17多克隆抗體（北京來福賽思科技生物）；MTT、DMSO（上海研謹生物科技）。

1.2 HEC1B細胞培養(yǎng)及分組

將低溫冷藏的HEC1B細胞株，快速移入37℃水中溶解，離心后，離棄上清液，加入培養(yǎng)基，每隔1 d更換培養(yǎng)液，生長到85%～90%時，消化傳代，取對數(shù)生長細胞分為內膜癌組、NC組、miR-143 mimics干預組，內膜癌組為HEC1B細胞株，NC組為HEC1B細胞株轉染miR-143-NC，干預組為HEC1B細胞株轉染miR-143 mimics。

1.3 細胞轉染

將數(shù)量為1×104個的HEC1B細胞株接種到96孔中，15 h后，待HEC1B細胞重復融合，在EP管中放入200 μL轉染液體和4 μL脂質體，后加入5 μg的miR-143 mimics、miR-143-NC，充分混合后，轉染9 h后，用含血清、雙抗的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 RT-PCR檢測細胞miR-143表達水平

取105/mL HEC1B細胞懸液，采用0.25%胰蛋白酶消化，采用TRIzol法提取總RNA，無核酸酶溶解。將提取的RNA進行轉錄為cDNA，獲得反體系，條件為：42℃作用60 min，72℃作用5 min，4℃終點。每個細胞設置6個復孔，以GAPDH為內參，反應條件為95℃預作用3 min，95℃作用5 s，58℃退火，40個循環(huán)，miR-143內參上游序列為5'- TGAGATGAACCACTGTAGGTC-3'，下游序列為5'-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3'；內參GAPDH上游序列為5'-CCATGCAGAAGG CTGGGG-3'，下游序列為5'-CAAAGTTGTCATGG ATGACC-3'，用相對定量2-ΔΔCT計算miR-143表達。

1.5 MTT法檢測細胞株活性抑制率

取0.6×104個/mL HEC1B細胞接種在96孔板中，消化后，加入1%的血清繼續(xù)培養(yǎng)，將3組細胞置于5%CO2的飽和濕度箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)0、24、48、72 h及96 h后加入MTT（5 g/L），每孔20 μL。4 h后離棄上清液，加入200 μL的DMSO，在490 nm檢測吸光度（OD值），取3次平均值。

1.6 流式細胞儀檢測各組HEC1B細胞凋亡

取2×105個/mL HEC1B細胞懸液，PBS溶液予以洗滌，離心5 min，運用100 μL 結合緩沖液，對細胞進行重懸，用 5 μL 標記FITC的AnnexinⅤ與5 μL PI 染色混勻，無光條件下，孵育15 min后注入400 μL 結合緩沖液混勻，予以洗滌，次數(shù)3次，記錄細胞凋亡情況。

1.7 Transwell小室檢測細胞侵襲能力

取1.5×104個/mL HEC1B細胞懸液，將50 mg/L的基質膠稀釋后加入小室上層，37℃下呈凝膠狀態(tài)，細胞數(shù)目為1×105/mL，上室中加入細胞懸液，下室中加入少量胎牛血清培養(yǎng)基，37.5℃，培養(yǎng)48 h，取出培養(yǎng)基，拭去殘留細胞，0.1%結晶紫染色，計算HEC1B細胞侵襲細胞數(shù)。

1.8 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

1 mL細胞懸液接種于6孔板，加無血清DMEM培養(yǎng)6 h，單層生長。用10 μL Eppendorf Tip在細胞板上劃痕，無血清培養(yǎng)液洗3次，加新鮮的無血清培養(yǎng)基。用Image-Pro Plus 6.0軟件測量劃痕距離。

1.9 免疫印跡檢測細胞兔抗人ADAMl7蛋白水平

1 mL的HEC1B細胞懸液，加入胰蛋白裂解液，4 000 r/min離心后，將上清液放入EP管中。在血清樣品中加入樣孔。進行電泳，PVDF膜TBS浸泡10 min，反復PBS沖洗，每次5 min，分別加入兔抗人ADAM17，GAPDH抗體（1∶500）、過氧化物酶標記二抗（1∶2 000），PBS沖洗。后將膜浸入ECL工作液，隨后進行檢測，獲取圖像。

1.10 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，HEC1B細胞OD值、凋亡侵襲、遷移及ADAM17蛋白水平以±s表示，組間比較用t檢驗，多組間比較采用方差分析，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組細胞中miR-143相對表達量

內膜癌組、NC組及干預組HEC1B細胞的miR-143相對表達量分別為1.00±0.00，1.02±0.03及1.63±0.12；干預組HEC1B細胞的miR-143相對表達顯著高于內膜癌組、NC組（均P<0.05），說明轉染成功。

2.2 過表達miR-143對各組細胞活性的影響

內膜癌組及NC組HEC1B細胞活性OD值的差異無統(tǒng)計學意義；處理48、72、96 h時，干預組分別與內膜癌組及NC組相比，HEC1B細胞活性OD降低，差異具有統(tǒng)計學意義（均P<0.05），顯示過表達miR-143能夠抑制HEC1B細胞活性（表1）。

表1 各組HEC1B細胞活性OD值比較（±s）

表1 各組HEC1B細胞活性OD值比較（±s）

*P<0.05 vs內膜癌組；#P<0.05 vs NC組

組別 0 h 24 h 48 h 72 h 96 h內膜癌組 0.250±0.060 0.351±0.070 0.600±0.060 1.030±0.100 1.790±0.150 NC組 0.247±0.080 0.347±0.090 0.559±0.070 0.998±0.090 1.700±0.130干預組 0.252±0.076 0.348±0.082 0.404±0.070*# 0.607±0.100*# 1.020±0.110*#P值 0.998 0.997 <0.001 <0.001 <0.001

2.3 過表達miR-143對各組細胞凋亡率的影響

內膜癌組及NC組HEC1B細胞凋亡率分別為4.55%±0.38%及5.00%±0.51%，差異無統(tǒng)計學意義；干預組HEC1B細胞凋亡率為29.89%±1.60%，較內膜癌組及NC組顯著增加，（P<0.05）（圖1）。

圖1 各組HEC1B凋亡率比較。

2.4 過表達miR-143對各組細胞侵襲數(shù)目的影響

內膜癌組及NC組HEC1B細胞侵襲數(shù)目分別為（230.45±17.20） 個及（227.90±20.15） 個，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；干預組HEC1B細胞侵襲數(shù)目為（75.95±10.55） 個，與內膜癌組及NC組相比侵襲數(shù)目降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（圖2）。

圖2 各組HEC1B細胞侵襲數(shù)目比較。

2.5 過表達miR-143對各組細胞遷移距離的影響

內膜癌組及NC組HEC1B細胞遷移距離分別為 （265±75） μm和 （260±80） μm，組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；干預組HEC1B細胞遷移距離為（152±43）μm，與內膜癌組及NC組相比遷移距離減小，組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（圖3）。

圖3 各組HEC1B細胞遷移數(shù)目比較。

2.6 過表達miR-143對各組細胞ADAMl7蛋白水平的影響

內膜癌組及NC組HEC1B細胞ADAMl7蛋白相對水平分別1.00±0.00及0.95±0.03，比較無差異（P>0.05）；干預組ADAMl7蛋白相對水平0.45±0.06，與內膜癌組及NC組相比HEC1B細胞中ADAMl7蛋白表達降低，組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（圖4）。

圖4 各組HEC1B細胞ADAM17蛋白相對表達

3 討論

子宮內膜癌是女性惡性腫瘤中的常見疾病，根據(jù)最新數(shù)據(jù)顯示，每年有20萬新增患者，是導致女性患者死亡的主要原因。目前，早期患者治療預后較好，但中晚期患者生存率較低，了解其生物活性機制及尋找有效治療方案用于改善生存率及預后具有重要作用[5-6]。近些年，隨著分子領域研究的不斷深入，miRNA從最初的表達譜的差異分析到現(xiàn)在對生物功能的研究均發(fā)揮了顯著作用。miRNA在全基因組中呈現(xiàn)低表達，但是研究表示在惡性腫瘤中具有非隨機性，具有改變疾病狀態(tài)下的RNA形式，介導其水平升高或降低，改善調控系統(tǒng)紊亂現(xiàn)象[7]。miR-143已經(jīng)被證實能夠抑制結腸癌、胃癌及胰腺癌中細胞生物活性，但是在子宮內膜癌女中研究還相對有限，因此，本研究建立上述實驗研究，分析其研究機制。

子宮內膜癌是在多環(huán)境、多致癌因素的作用誘導機體免疫功能障礙時，細胞生長失調，導致異常增生，加快癌細胞產(chǎn)生。HEC1B細胞侵襲能力較強，能夠通過減少細胞凋亡，誘導DNA快速復制，加大癌細胞有絲分裂，加快新病灶形成及向旁癌組織擴散[8]。研究表示，子宮內膜癌疾病發(fā)展具有時間依賴性，能夠通過不同增生方式產(chǎn)生浸潤性癌，加快術后患者殘留癌細胞的轉移及侵襲，惡化病情[9]。癌屬于一種基因病變，子宮內膜癌產(chǎn)生機制與癌基因、抑癌基因及DNA修復損傷相關。miRNA與多種腫瘤形成及發(fā)展具有相關性。研究表示，有超過50%的miRNA在癌癥相關基因組附近。miRNA具有雙重作用，既可以是抑癌基因，也可以是致癌基因[10]。miR-143起初在直腸癌細胞中被發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過多項研究證實，多種惡性腫瘤均存在miR-143異常表達，在卵巢癌及乳腺癌中表達降低，主要通過其靶基因來發(fā)揮功能。miR-143在胚胎組織水平顯著升高，具有保護子宮組織的作用。當在子宮內膜癌中表達降低時，往往意味著抑癌基因作用失效。王穎等[11]研究顯示，隨著子宮內膜癌病情的發(fā)展，伴隨淋巴轉移及腫瘤分級越高，miR-143表達水平越低。Chang等[12]研究表明，過表達miR-143能夠降低乳腺癌及宮頸癌細胞活性，加快凋亡。本研究結果顯示，過表達miR-143能夠降低HEC1B細胞活性，減少侵襲及遷移數(shù)目，加快凋亡，說明miR-143能夠降低HEC1B細胞生物活性，這與Zhang等[13]的研究結果相似。

ADAM17屬于為腫瘤壞死因子轉換酶，能夠水解多種TGF-α、HB-EGF等因子，ADAM17在乳腺癌、前列腺癌等疾病中顯著高于癌旁組織，已經(jīng)證明，ADAM17能夠參與癌細胞發(fā)生及發(fā)展[14-15]。ADAM17生物活性較廣泛，能夠釋放多種結構差異的活性物質，進而調節(jié)細胞生物活性。柳新等[16]研究顯示，子宮內膜增生患者ADAM17的陽性低于子宮內膜癌患者，表示ADAM17升高，說明子宮內膜癌患者疾病加重，并能夠作為判斷疾病輕重的有效指標。歐奇志等[17]研究表明，ADAM17能夠加快腫瘤細胞生長及侵襲是通過增加EGFR配體功能而發(fā)揮作用的。目前，關于子宮內膜癌中miRNA所調控的相關信號及靶基因對于了解子宮內膜癌生物活性具有重要意義[18]。研究顯示，在鼻咽癌細胞中miR-140-5p能調控ADAM10蛋白水平，減少鼻咽癌細胞遷移及侵襲[19]。本研究結果顯示，通過過表達miR-143能夠抑制ADAM17蛋白水平減少HEC1B增殖，加快凋亡。說明升高miR-143水平，抑制HEC1B生物活性可能與抑制ADAM17水平相關，可能通過減少Notch 1信號逆轉ADAM17活性相關，但是具體機制還需要進一步探討[20]。

綜上所述，過表達miR-143模擬物能夠抑制子宮內膜癌細胞生物活性，抑制癌癥發(fā)展可能與抑制ADAM17基因表達相關。