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    三種動(dòng)物油脂對(duì)大鼠急性胃粘膜損傷的影響

    2021-10-29 13:59:10夏蘊(yùn)實(shí)孫印石李志滿
    食品工業(yè)科技 2021年19期
    關(guān)鍵詞:牛油胃粘膜豬油

    夏蘊(yùn)實(shí),孫印石,劉 暢,李志滿,姜 輝,王 梓

    (1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130118;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所,吉林長(zhǎng)春 130112;3.長(zhǎng)春大學(xué)食品學(xué)院,吉林長(zhǎng)春 130022;4.吉林特研藥業(yè)有限公司,吉林吉林 132109)

    胃粘膜是胃的重要生理屏障,胃粘膜損傷是導(dǎo)致多種胃病的主要因素[1]。吸煙、飲酒、壓力及營(yíng)養(yǎng)缺乏,可能會(huì)危害到由刺激和防御因素維持的胃粘膜完整性的平衡,導(dǎo)致發(fā)生胃潰瘍的風(fēng)險(xiǎn)增加[2]?,F(xiàn)如今,對(duì)胃部疾病的治療主要依賴于合成藥物,這些藥物的使用可能會(huì)引起不同程度的副作用,在這種情況下,從自然資源中尋找安全有效的功能性食品是極為必要的[3?4]。

    近年來(lái),對(duì)胃粘膜損傷的飲食預(yù)防控制已取得很大進(jìn)展,一些食物來(lái)源的功能性成分受到了廣泛關(guān)注。其中動(dòng)物油脂中所富含的不飽和脂肪酸,如亞麻酸、亞油酸和油酸等對(duì)胃粘膜損傷均具有一定的保護(hù)作用[5],如蠶蛹油[6]能緩解鹽酸/乙醇對(duì)胃組織造成的傷害。許常輝等[7]用鴯鹋油給胃潰瘍大鼠連續(xù)灌胃,結(jié)果表明鴯鹋油能夠抑制乙醇致小鼠胃粘膜損傷且明顯促進(jìn)酸性胃潰瘍大鼠胃潰瘍面愈合。鹿油是鹿科動(dòng)物梅花鹿(Cervus nippon)或馬鹿(Cervus elaphus)的脂肪油,也叫鹿脂。鹿油在古籍《唐本草》中記載:“主癰腫死肌,溫中,四肢不隨,風(fēng)頭,通腠理”[8]?!吨袊?guó)醫(yī)學(xué)大辭典》記:“療面皰瘡,頻頻涂之”。民間多傳鹿油對(duì)胃潰瘍有一定的保護(hù)作用,但現(xiàn)如今關(guān)于鹿油的相關(guān)活性卻鮮有報(bào)道。牛油被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè),不僅具有獨(dú)特風(fēng)味,還富含大量維生素、脂肪酸、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分[9?10]。豬油是提取自豬脂肪組織經(jīng)煉制而成的一種動(dòng)物油脂,其風(fēng)味獨(dú)特且資源豐富易得,但食用豬油對(duì)人體的利弊至今仍褒貶不一[11]。本文通過(guò)分析三種動(dòng)物油脂對(duì)大鼠急性胃粘膜損傷的影響,尋求對(duì)急性胃粘膜損傷具有保護(hù)作用且較易獲得的動(dòng)物油脂,為動(dòng)物油脂的研究與開發(fā)提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    SD 大鼠 鼠齡7 周左右,體重170~180 g,購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司,合格證號(hào):SCXK(遼)2015-0001;鹿油 未經(jīng)加工的新鮮板油,長(zhǎng)春市世鹿鹿業(yè)有限公司;豬油、牛油 未經(jīng)加工的新鮮板油,長(zhǎng)春市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng);超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)試劑盒 南京建成生物工程研究所;大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒、大鼠白細(xì)胞介素6(IL-6)試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司;RNA 提取試劑盒 普洛麥格生物技術(shù)有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒 羅氏公司;無(wú)水乙醇 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;生理鹽水 昆明南疆制藥有限公司;戊巴比妥鈉、10%中性福爾馬林 北京酷來(lái)博科技有限公司。

    GZX-9140MBE 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;HH-4A 數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司;商用電磁爐 諸城隆澤機(jī)械有限公司;LDZM-40KCS-2 立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;電子數(shù)顯卡尺605 哈爾濱量具刃具集團(tuán)有限責(zé)任公司;Epoch2 酶標(biāo)儀美國(guó)博騰儀器有限公司;EC3 凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)UVP 公司;DYY-8C 電泳儀電源 北京六一儀器廠;C1000 Touch PCR 儀 美國(guó)伯樂(lè)公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 油脂的提取 參考文獻(xiàn)方法[12],取新鮮的鹿、牛、豬板油,去除粘附的毛、皮等雜質(zhì)殘片,沖洗后瀝干水分,切碎成小塊,設(shè)置商用電磁爐溫度為130 ℃,熬煉提油,過(guò)濾油渣,得到鹿油、牛油和豬油。

    1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型建立 參考文獻(xiàn)方法[13],選取健康的SD 雄性大鼠40 只,飼養(yǎng)在溫度為22~25 ℃,相對(duì)濕度45%~65%環(huán)境中,自由飲水、進(jìn)食,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后,隨機(jī)分為8 組,每組5 只,即正常組、模型組、低劑量鹿油組、高劑量鹿油組、低劑量牛油組、高劑量牛油組、低劑量豬油組和高劑量豬油組。灌胃劑量依據(jù)人體每日服用劑量12 g/60 kg換算,并根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇對(duì)大鼠甘油三酯、總膽固醇、高、低密度脂蛋白影響較小的劑量,則低劑量為500 mg/kg,高劑量為850 mg/kg。分別在給藥前期(第1 d 給藥前)、中期(第15 d 給藥前)、末期(第30 d給藥前)稱重并記錄。

    正常組、模型組分別灌胃生理鹽水;鹿油、牛油、豬油組每天按10 mL/(kg·bw)灌胃1 次,連續(xù)30 d。末次給藥后,斷糧不斷水24 h。除正常組外,灌胃其余各組大鼠無(wú)水乙醇1.0 mL/只,1 h 后麻醉、心臟取血處死,取胃組織并稱重[14?16]。

    1.2.3 大鼠胃粘膜形態(tài)學(xué)觀察 大鼠心臟取血處死后,取完整胃組織,結(jié)扎幽門,灌注10%福爾馬林,固定20 min 后沿胃大彎剪開,用生理鹽水沖洗表面胃內(nèi)容物,展開胃粘膜,觀察胃粘膜出血情況。

    1.2.4 組織病理學(xué)檢查 觀察結(jié)束后,選取胃粘膜損傷最嚴(yán)重的部位,以10%中性福爾馬林固定、水洗、脫水透明,浸蠟包埋,修整蠟塊,以5 μm 厚度連續(xù)切片,脫蠟至水,經(jīng)H&E 染色后,鏡下觀察大鼠胃組織病理學(xué)變化。

    1.2.5 急性損傷指標(biāo)測(cè)定 用游標(biāo)卡尺記錄出血帶長(zhǎng)度、寬度及出血點(diǎn)個(gè)數(shù),按表1 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算各組大鼠胃粘膜充血面積、損傷積分指數(shù)、損傷發(fā)生率、損傷抑制率,評(píng)價(jià)三種油脂對(duì)急性胃粘膜損傷大鼠的保護(hù)作用[17?18]。

    表1 乙醇對(duì)大鼠急性胃粘膜損傷肉眼觀察評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for visual observation of ethanol in acute gastric mucosal injury in rats

    胃粘膜充血面積=出血帶長(zhǎng)度×出血帶寬度;

    個(gè)體損傷評(píng)分=出血點(diǎn)個(gè)數(shù)分值+出血帶長(zhǎng)度分值+出血帶寬度分值×2;

    損傷積分指數(shù)=某組損傷評(píng)分總和/該組動(dòng)物數(shù)量;

    損傷發(fā)生率(%)=某組出現(xiàn)出血、充血的大鼠數(shù)量/該組大鼠數(shù)量×100;

    損傷抑制率(%)=(模型組損傷積分?實(shí)驗(yàn)組損傷積分)/模型組損傷積分 × 100

    1.2.6 生化指標(biāo)的測(cè)定 各組大鼠取血后,室溫靜止30 min,在4 ℃條件下,以2500 r/min的轉(zhuǎn)速離心20 min,分離得到血清,按照試劑盒說(shuō)明方法測(cè)定大鼠血清中的SOD 活性、MDA 含量、GSH-Px 活力、IL-6 含量和TNF-α含量。

    1.2.7 胃組織中EPO 和EPOR mRNA 表達(dá)水平采用Eastep Super 總RNA 提取試劑盒提取胃組織中的總RNA,使用Quick Drop 檢測(cè)RNA 濃度后,用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定完整性。再按照BioRT cDNA 合成試劑盒方法將分離的RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,并通過(guò)使用表2 中所述的基因特異性引物進(jìn)行RT-PCR,GAPDHmRNA的表達(dá)水平作為內(nèi)置參數(shù)。最后,利用含有溴化乙錠的瓊脂糖凝膠電泳觀察PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物,并以計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)成像進(jìn)行半定量分析。

    表2 實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)引物序列Table 2 Sequences of primers for RT-PCR amplification

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    2 結(jié)果與分析

    2.1 三種動(dòng)物油脂對(duì)大鼠體重、胃重量/體質(zhì)量的影響

    實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠在各個(gè)時(shí)期體重均持續(xù)增長(zhǎng),與正常組相比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。第30 d經(jīng)無(wú)水乙醇刺激胃粘膜后,模型組大鼠胃重量/體質(zhì)量較正常組明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。說(shuō)明經(jīng)無(wú)水乙醇刺激后的大鼠胃組織出現(xiàn)出血、水腫,造模成功。鹿油組胃組織重量較模型組明顯降低,水腫各有一定程度減輕,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01 或P<0.001),結(jié)果見表3。

    表3 三種動(dòng)物油脂對(duì)大鼠體重和胃重量/體質(zhì)量的影響( )Table 3 Effects of three kinds of animal fats on rat body weight and stomach weight/body weight()

    表3 三種動(dòng)物油脂對(duì)大鼠體重和胃重量/體質(zhì)量的影響( )Table 3 Effects of three kinds of animal fats on rat body weight and stomach weight/body weight()

    注:與模型組相比,#表示顯著(P<0.05),##表示高度顯著(P<0.01),###表示極顯著(P<0.001);與對(duì)照組相比,*表示顯著(P<0.05),**表示高度顯著(P<0.01),***表示極顯著(P<0.001);表4、圖3、圖4同。

    2.2 三種動(dòng)物油脂對(duì)大鼠急性胃粘膜損傷的形態(tài)學(xué)觀察

    如圖1 所示,正常組大鼠胃粘膜完整光滑,無(wú)出血帶及出血點(diǎn);模型組大鼠胃粘膜表面嚴(yán)重充血糜爛,有明顯粗大的出血帶,且顏色較深;鹿油組大鼠胃粘膜局部輕微出血,表面有較細(xì)小出血帶和出血點(diǎn);牛油組大鼠胃粘膜表面有多條細(xì)長(zhǎng)出血帶,顏色略深;豬油組大鼠胃粘膜表面有多條較寬出血帶,顏色較深。此外,三種油脂處理組對(duì)胃黏膜形態(tài)的保護(hù)呈現(xiàn)出典型的量效關(guān)系,即同模型組比較,隨著劑量升高,無(wú)水乙醇對(duì)大鼠胃黏膜損傷程度減弱。鹿油和牛油能一定程度上減輕乙醇所致急性胃粘膜損傷,且高劑量組效果優(yōu)于低劑量組,豬油則無(wú)明顯效果。

    圖1 三種動(dòng)物油脂對(duì)乙醇致大鼠胃黏膜損傷形態(tài)影響Fig.1 Effects of three animal fats on the morphology of gastric mucosa injury induced by ethanol in rats

    2.3 三種動(dòng)物油脂對(duì)大鼠急性胃粘膜損傷的組織病理學(xué)影響

    選取各組大鼠胃粘膜損傷最嚴(yán)重部位進(jìn)行H&E 染色,結(jié)果如圖2 所示。正常組大鼠胃黏膜細(xì)胞排列緊密、有序,細(xì)胞的藍(lán)紫色較深,胃黏膜整體形態(tài)完整、邊界清晰、明顯;模型組胃黏膜細(xì)胞排列則松散、無(wú)序,且碎片較多,空腔細(xì)胞聚集成片,具有炎性浸潤(rùn),胃黏膜腫脹;鹿油組和牛油組細(xì)胞排列較為有序,炎性浸潤(rùn)減少。此外,三種油脂處理組對(duì)胃黏膜形態(tài)的保護(hù)呈現(xiàn)劑量依賴性。

    圖2 不同組別大鼠胃黏膜H&E 染色(40×)Fig.2 H&E staining pictures of gastric mucosa of rats in different groups(40×)

    2.4 三種動(dòng)物油脂對(duì)大鼠急性損傷指標(biāo)的影響

    統(tǒng)計(jì)各組胃粘膜充血面積、損傷積分指數(shù)、損傷發(fā)生率及損傷抑制率,結(jié)果見表4。結(jié)果表明,模型組大鼠胃黏膜充血面積、損傷積分指數(shù)均高于其它各組,出血情況最為嚴(yán)重,造模成功;與模型組相比,鹿油組胃粘膜充血面積、損傷積分指數(shù)均明顯降低,能夠較大程度地緩解大鼠胃粘膜出血情況,具有極顯著差異(P<0.001);與模型組相比,牛油組胃粘膜充血面積和損傷積分指數(shù)均有降低,有顯著性差異(P<0.05 或P<0.01);豬油組損傷積分指數(shù)稍有降低,但較模型組相比,無(wú)顯著性差異(P>0.05);鹿油組、牛油組、豬油組的高劑量組胃粘膜充血面積、損傷積分指數(shù)均低于低劑量組,損傷抑制率高于低劑量組。上述結(jié)果表明,鹿油、牛油對(duì)急性胃粘膜均具有不同程度的保護(hù)作用,且呈明顯劑量依賴性,其中鹿油的保護(hù)效果更佳,豬油無(wú)明顯保護(hù)作用。

    表4 三種動(dòng)物油脂對(duì)大鼠急性胃粘膜損傷指標(biāo)的影響( )Table 4 Effects of three kinds of animal oils on the indexes of acute gastric mucosa injury in rats()

    表4 三種動(dòng)物油脂對(duì)大鼠急性胃粘膜損傷指標(biāo)的影響( )Table 4 Effects of three kinds of animal oils on the indexes of acute gastric mucosa injury in rats()

    2.5 三種動(dòng)物油脂對(duì)大鼠血清抗氧化能力的影響

    無(wú)水乙醇攝入會(huì)使細(xì)胞抗氧化能力降低,導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生,進(jìn)而使機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[19]。GSH-Px、SOD 是重要的內(nèi)源性抗氧化酶,能夠反映機(jī)體清除自由基的能力。MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物,可反映體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)程度[20?21]。如圖3 所示,與正常組相比,過(guò)量無(wú)水乙醇可降低血清GSH-Px 及SOD 活性,提高M(jìn)DA 水平。鹿油預(yù)處理有效地提高了血清GSH-Px 和SOD 活性,降低了MDA 水平,且呈劑量依賴性;牛油僅能夠提高SOD活性,降低MDA 水平,呈劑量依賴性;豬油組對(duì)以上指標(biāo)影響不顯著(P>0.05)。這些結(jié)果證實(shí)了鹿油和牛油可以減輕過(guò)量乙醇引起的氧化應(yīng)激,提高機(jī)體抗氧化能力,且鹿油組效果優(yōu)于牛油組。

    圖3 三種動(dòng)物油脂對(duì)大鼠血清中GSH-Px、SOD活性和MDA 含量的影響Fig.3 Effects of three kinds of animal oils on GSH-Px,SOD activity and MDA content in rat serum

    2.6 三種油脂對(duì)大鼠血清中炎癥因子分泌的影響

    TNF-α和IL-6 是兩種重要的促炎細(xì)胞因子,與急性胃粘膜損傷的發(fā)生密切相關(guān)[3]。如圖4 所示,乙醇刺激后的模型組大鼠血清中TNF-α和IL-6 水平較正常大鼠明顯升高(P<0.001)。與模型組大鼠相比,鹿油組大鼠血清炎癥細(xì)胞因子顯著下降(P<0.05),且呈劑量依賴性,牛油組、豬油組無(wú)明顯影響。結(jié)果表明,鹿油預(yù)處理顯著限制了促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生,有效抑制了炎癥因子的分泌。

    圖4 三種動(dòng)物油脂對(duì)大鼠血清中TNF-α和 IL-6 含量的影響Fig.4 Effects of three animal fats on serum levels of TNF-α and IL-6 in rats

    2.7 鹿油對(duì)大鼠胃組織中EPO 和EPOR mRNA 表達(dá)的影響

    EPO(促紅細(xì)胞生成素)是由炎癥誘導(dǎo)的內(nèi)源性細(xì)胞保護(hù)和炎癥調(diào)控的分子,一定程度上能夠抑制促炎癥因子的表達(dá)。EPOR(促紅細(xì)胞生成素受體)是靶細(xì)胞膜表面上的促紅細(xì)胞生成素受體,有研究發(fā)現(xiàn)EPOR 在炎癥細(xì)胞表面表達(dá)[22?23]。對(duì)低、高劑量鹿油組進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)胃組織中EPO 和EPOR mRNA的變化情況,如圖5 所示,與正常組大鼠相比,模型組大鼠胃組織中EPO 和EPOR mRNA的表達(dá)均明顯增強(qiáng);與模型組相比,高、低劑量鹿油組中EPO 和EPOR mRNA 表達(dá)水平明顯降低。說(shuō)明模型組乙醇攝入后,促炎因子大量分泌,導(dǎo)致EPO 和EPOR 水平升高;鹿油預(yù)處理組分泌較少炎癥因子,則EPO 和EPOR 水平較模型組降低。

    圖5 鹿油對(duì)大鼠胃組織中EPO和EPOR mRNA 表達(dá)的影響Fig.5 Effects of deer oil on the expression of EPO and EPOR mRNA of stomach tissure in rats

    3 結(jié)論

    以乙醇致急性胃粘膜損傷模型[24?27]研究三種常見動(dòng)物油脂對(duì)乙醇所致急性胃粘膜損傷的影響。三種油脂中,鹿油能夠通過(guò)提高GSH-Px 活力和SOD 活性、降低體內(nèi)MDA 含量提高機(jī)體抗氧化能力,并減少IL-6 和TNF-α的分泌,提高機(jī)體抗炎能力,EPO 及EPOR 表達(dá)較少,說(shuō)明鹿油抑制了炎癥因子的表達(dá),進(jìn)而保護(hù)乙醇所致急性胃粘膜損傷;牛油對(duì)急性胃粘膜損傷也具有一定的保護(hù)作用,可通過(guò)升高SOD 活性、降低MDA 含量提升機(jī)體抗氧化能力對(duì)胃粘膜損傷形成一定的保護(hù)作用,低劑量牛油組無(wú)明顯變化;豬油對(duì)急性胃粘膜損傷的影響無(wú)顯著性差異(P>0.05),僅是一種簡(jiǎn)單的物理性保護(hù)。故三種動(dòng)物油脂對(duì)急性胃粘膜損傷保護(hù)作用依次是:鹿油>牛油>豬油,呈劑量依賴性。

    綜上所述,鹿油對(duì)乙醇致胃粘膜損傷具有良好的改善作用,且鹿作為個(gè)體較大的哺乳動(dòng)物,分布較為廣泛,油脂較容易獲取且提取率高,但其作用機(jī)理還需進(jìn)一步明確。本研究為動(dòng)物油脂在食品、保健品、日用品等各個(gè)領(lǐng)域的開發(fā)利用提供理論依據(jù),具有重要的理論意義和社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

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