氣管植入間充質(zhì)干細胞聯(lián)合部分液體通氣對海水淹溺致肺損傷大鼠治療作用的研究

張春陽 李亮 張寧坤

海水淹溺可導(dǎo)致肺組織損傷，嚴重者出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)，死亡率高。傳統(tǒng)的治療方法，如常規(guī)機械通氣、高壓氧等，不能有效的促進局部損傷細胞修復(fù)、阻止ARDS的病理進程，未從根本上解決肺泡/毛細血管膜受損的問題[1-2]。有研究發(fā)現(xiàn)，部分液體通氣可減輕ARDS所導(dǎo)致的肺泡萎陷，同時作為液體通氣的介質(zhì)-全氟化碳(perfluorocarbon，PFC)具有降低炎癥反應(yīng)的作用[3]。而間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有修復(fù)損傷、自動歸巢、免疫調(diào)節(jié)的作用，有可能針對肺泡/毛細血管膜受損，減輕海水淹溺導(dǎo)致的肺損傷[2]。目前國內(nèi)外尚無將兩者聯(lián)合，用于海水淹溺導(dǎo)致的肺損傷及急性呼吸窘迫綜合征治療的研究報道。因此，本研究擬通過氣管內(nèi)植入臍帶來源的間充質(zhì)干細胞聯(lián)合部分液體通氣，觀察對海水淹溺致大鼠肺損傷的治療效果，以探索新的救治手段。

資料與方法

一、主要試劑及材料

DMEM/F12(dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12)培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；胰蛋白酶(Trypsin)(美 國Invitrogen公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(美國 Gibco 公司)；全氟化碳(上海捷視醫(yī)療設(shè)備有限公司)；CM-Dil 細胞標(biāo)記液(Molecular Probes,C7000)；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白介素-1β(Interleukin-1β, IL-1β)、白介素-6(Interleukin-6, IL-6)、白介素-10(Interleukin-10, IL-10)ELISA試劑盒(天津安諾瑞康生物技術(shù)有限公司，中國)。配置海水 參考前期研究[4]，采用海水配方，海水成分：NaCl 26.518 g/L, MgCl22.447 g/L, MgSO43.305 g/L, CaCl21.141g/L, KCl 0.725 g/L，NaHCO30.202 g/L, NaBr 0.083 g/L, 滲透壓濃度 1250～1350 mmol/L, PH 8.2, 比重 1.05～1.06。SPF級健康雌性SD大鼠(北京科宇動物養(yǎng)殖中心)，鼠齡(2.5±0.5)月，體重(300±30)g,許可證號：SCXK(京)2018-0010。

二、方法

1. 間充質(zhì)干細胞分離、培養(yǎng)、傳代及熒光標(biāo)記: 經(jīng)倫理委員會批準(zhǔn)(NO.HZKY-PJ-2015-1)，簽訂知情同意書后，無菌條件下留取臍帶組織。參考既往研究[5]，采用組織塊貼壁法，分離、培養(yǎng)臍帶華通膠間充質(zhì)干細胞，已對其分化及免疫表型進行檢測，符合MSCs標(biāo)準(zhǔn)。取長勢良好的第 3 代MSCs， 經(jīng)0.25% 胰蛋白酶消化， PBS 洗滌離心后，棄上清，用空白細胞培養(yǎng)液制成1×106/mL的細胞懸液; 每毫升細胞懸液加5μl 的 CM-Dil 細胞標(biāo)記液，輕柔地吹打混勻; 37 ℃孵育5 min或更短的時間，然后于4 ℃再孵育15 min。離心 5 min; 棄上清，DMEM重懸細胞沉淀; 再次孵育離心，重復(fù)2次，繼續(xù)培養(yǎng);觀察標(biāo)記情況。

2. 實驗動物分組： 將大鼠分為5組：CONTROL組(C組)、MODEL組(M組)、REGULAR組(R組)、PFC組(P組)和PFC+MSC組(PM組)，每組6只大鼠。

3. 構(gòu)建模型：大鼠給予腹腔注射10%水合氯醛(0.35mL/100mg)麻醉，固定于鼠板，組織剪暴露頸部肌肉，鈍性分離，暴露氣管，并分離右側(cè)頸動脈置管，供留取血氣分析使用。氣管切開后，使用1mL注射器，連接改良自腰椎穿刺麻醉用軟導(dǎo)管，插入大鼠氣道內(nèi)1.5cm左右，緩慢注射配方海水(4mL/kg)，時間約15 min，之后予以經(jīng)氣管切開處氣管插管，連接呼吸機。于頸動脈留置動脈導(dǎo)管，于1h、3h抽取動脈血氣分析。除C組外，其余各組給予氣管切開后注入4 mL/kg海水。

4. 常規(guī)機械通氣及部分液體通氣: 除C和M組外，其余各組予以氣管插管，R組給予常規(guī)機械通氣，P組給予部分液體通氣(參照研究[6]，按2 mL/kg氣管內(nèi)注入PFC)，PM組給予氣管內(nèi)植入100μl含1×106MSCs的PBS后，予以部分液體通氣(同P組)，以上機械通氣，均采用CMV模式，呼吸頻率80次/分，潮氣量10mL/Kg，給氧濃度100%。

5. 監(jiān)測指標(biāo): 監(jiān)測大鼠呼吸、心率、血氧飽和度變化；造模后1h和3h測定大鼠動脈血氣血氧分壓(PaO2)，計算氧合指數(shù)(動脈血氧分壓/吸氧濃度，PaO2/FiO2)。

6. 標(biāo)本的采集和處理: 麻醉后5mL注射器動脈穿刺置管放血處死大鼠，注入抗凝管后離心留取血清，-80℃凍存。組織剪剪開胸腔，充分暴露心臟及肺臟，眼科剪小心將雙肺游離，立即放入冷0.9%生理鹽水中，洗凈殘留血，吸水紙吸干后，觀察肺大體表現(xiàn)。留取左肺葉置于10%的甲醛；余按右肺上葉、右肺中葉、右肺下葉，分別放入錫紙內(nèi)包裹，標(biāo)記信息后，立即放入液氮中保存。

7. 大鼠肺組織病理學(xué)檢查: 左肺葉標(biāo)本石蠟包埋，切片行H&E染色染色。光鏡下觀察，各組病理學(xué)的變化。

8. 觀察大鼠肺組織內(nèi)MSCs分布: 預(yù)冷恒冷箱切片機，設(shè)定在-18℃左右；將右肺上葉標(biāo)本自液氮取出后，留取約1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm大小的標(biāo)本，加入OCT包埋劑；冷凍切片，5μm厚度，切片附著于潔凈載玻片上，激光共聚焦顯微鏡，觀察肺組織標(biāo)本中表達紅色熒光的MSCs表達情況。

9.ELISA法檢測: 采用相應(yīng)的試劑盒檢測大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10含量變化。

三、統(tǒng)計分析

結(jié) 果

一、間充質(zhì)干細胞形態(tài)及熒光標(biāo)記

光鏡下觀察第4代間充質(zhì)干細胞，可見細胞呈梭形，平行排列(見圖1)。加入CM-DIL染料后，光鏡下可見間充質(zhì)干細胞呈梭形或多角形，更換熒光后，可見細胞發(fā)出紅色熒光，提示CM-DIL標(biāo)記細胞(見圖2)。

圖1 光鏡下觀察間充質(zhì)干細胞 (40×)

圖2 間充質(zhì)干細胞CM-DIL標(biāo)記(A:CM-DIL標(biāo)記的間充質(zhì)干細胞，紅色熒光；B：光鏡下觀察間充質(zhì)干細胞 100×)

二、大鼠一般狀況

M組大鼠氣管內(nèi)灌注海水后，立即出現(xiàn)呼吸頻率增快、心率增快，偶有嗆咳，并出現(xiàn)呼吸加深、屏氣現(xiàn)象，氣道內(nèi)有白色泡沫樣滲出物，可聞及氣道喘鳴音。監(jiān)測氧飽和度迅速下降。

三、動脈血氣

氧分壓PaO2變化：海水灌注大鼠氣管后，1h時間點，M組較C組、R組、P組和PM組明顯下降,PM組與C組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(H=25.062,P=0.032)。R組、P組和PM組較M組升高，P組和PM組與M組分別比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(H=25.062,PvsM:P=0.001,PMvsM:P<0.001)。R組、P組和PM組水平依次升高，但兩組之間分別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(H=25.062,P>0.05)。3h時，M組、R組、P組和PM組分別與C組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=659.461,P<0.001)。R組、P組和PM組分別與M組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=659.461,P<0.001)。P組高于R組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=659.461,P=0.046)，PM組高于R組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=659.461,P=0.012)。PM組水平均輕度高于P組，兩者之間無統(tǒng)計學(xué)差異(F=659.461，P>0.05)(見表1)。

表1 大鼠動脈血氣分析氧分壓(mmHg,n=6)

氧合指數(shù)PaO2/FiO2變化：在海水灌注后，1h和3h時間點，M組、R組、P組和PM組低于C組，兩組間分別比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，(1h:F=77.579,P<0.001；3h:F=74.000,P<0.001)；M組較R組、P組和PM組明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(1h:F=77.579,P<0.001；3h:F=74.000,P<0.001)。P組和PM組分別與R組比較，在1h時間點兩組之間分別比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=77.579,PvsR:P=0.013,PMvsR:P=0.005)；在3h時間點比較，雖分別高于R組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。P組與PM組兩者分別在1h、3h比較，PM組雖輕度高于P組，但兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表2)。

表2 大鼠氧合指數(shù)(mmHg/%,n=6)

四、肺組織形態(tài)學(xué)變化

C組雙肺組織呈粉紅色，未見腫脹及充血改變。M組大鼠肺組織腫脹明顯，呈蒼白色，表面可見大面積片狀出血，局部可見大小不等暗紅色點片狀實變。R組與C組比較，未出現(xiàn)明顯蒼白腫脹表現(xiàn)，但局部可見片狀出血及暗紅色實變樣改變。P組及PM組大鼠肺組織表面片狀出血及暗紅色點片狀實變較M組和R組少。PM組較P組大鼠肺組織表面片狀出血面積及暗紅色點片狀實變減少(見圖3)。

圖3 大鼠肺組織形態(tài)

五、大鼠肺組織病理變化(HE染色)

光鏡下可見，C組大鼠肺泡組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁薄，肺間質(zhì)未見增厚，肺泡腔內(nèi)未見水腫。M組可見肺組織內(nèi)充血明顯，并可見大量炎性細胞滲出，局部可見肺泡萎陷，失去正常結(jié)構(gòu)，部分肺泡腔內(nèi)可見大量紅細胞，肺泡間隔明顯增寬、增厚。R組、P組及PM組較M組減輕，其中P組和PM組損傷減輕更加明顯，肺泡間隔較R組增寬、增厚減少，肺泡萎陷數(shù)量減少(見圖4)。

圖4 大鼠肺組織病理(A:C組，B：M組；C：R組；D：P組；E:PM組，HE染色 20×)

六、ELISA檢測大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10表達

血清IL-1β表達，M組、R組均高于C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(H=26.908,MvsC:P<0.001，RvsC:P=0.01)。P組和PM組水平高于C組，但各自兩者之間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。R組、P組和PM組水平低于M組，PM組與M組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(H=26.908,P=0.004)，R組和P組分別與M組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。R組、P組和PM組的IL-1β表達水平依次下降，但兩者之間分別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表3)。

表3 大鼠海水淹溺血清細胞因子(pg/mL，n=6)

血清IL-6表達，M組、R組、P組和PM組均較C組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=231.683,P<0.001)。R組、P組和PM組與M組比較，各組均表達降低，兩組之間分別比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=231.683,P<0.001)。P組和PM組水平均分別低于R組，兩組之間分別比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=231.683,PvsR:P<0.001,PMvsR:P<0.001)。PM組水平低于P組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=231.683,P=0.004)(見表3)。

血清IL-10表達，M組、R組、P組和PM組均較C組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=85.451,P<0.001)。R組和PM組水平高于M組，兩組之間分別比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=85.451,RvsM:P=0.035，PMvsM:P<0.001)。P組水平高于M組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。P組表達水平低于R組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。PM組水平均高于R組和P組，兩組之間分別比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=85.451,PMvsR:P=0.003，PMvsp:P<0.001)(見表3)。

血清TNF表達，M組、R組、P組和PM組均較C組升高，M組與C組分別比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(H=24.882,P=0.004)，而R組、P組和PM組與C組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。R組、P組和PM組與M組比較，表達水平均低于M組，R組和P組分別與M組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，PM組與M組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(H=24.882,P<0.001)。P組和PM組表達水平低于R組，P組與R組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，PM組與R組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(H=24.882,P=0.016)。PM組水平低于P組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(見表3)。

七、外源性MSCs在大鼠肺組織內(nèi)分布及分化表達

通過激光共聚焦顯微鏡觀察PM組大鼠肺組織冰凍切片，可發(fā)現(xiàn)通過CM-DIL標(biāo)記的紅色熒光表達的MSCs(圖5)。

圖5 激光共聚焦顯微鏡觀察大鼠肺內(nèi)間充質(zhì)干細胞(A:CM-DIL ；B: DAPI；C: MERG, 100×)

討 論

目前國內(nèi)外尚無關(guān)于通過氣道植入間充質(zhì)干細胞聯(lián)合部分液體通氣治療肺損傷的報道。PFC與MSCs直接接觸，因PFC脂溶性、比重大等特征，對MSCs的活力及遷移均有著影響[8]。通過前期體外模擬試驗中發(fā)現(xiàn)，不能直接將MSCs加入PFC中進行試驗，而先加入MSCs，后加入PFC時，PFC對MSCs的細胞遷移、細胞增殖及分化能力未受明顯影響。因此本研究采用先氣管內(nèi)植入間充質(zhì)干細胞，之后灌注全氟化碳，進行部分液體通氣。

本研究采用人工配方模擬海水，在氣管內(nèi)注入后，大鼠動脈血氣分析提示氧合指數(shù)在造模后的1h和3h，均小于300mmHg，說明構(gòu)建的大鼠海水淹溺模型可保持肺損傷導(dǎo)致缺氧狀態(tài)。通過監(jiān)測動脈血氣分析及測算氧合指數(shù)，提示聯(lián)合治療同單獨部分液體通氣，同樣可較快改善海水淹溺后大鼠的動脈血氧分壓及氧合指數(shù)，并維持至造模觀察終點3h。這一方面與PFC較高的氧溶解能力有關(guān)，另一方面因PFC比重大，可使損傷較重的肺泡萎陷區(qū)域復(fù)張，抑制海水灌注引起的肺泡腔炎性滲出，使肺內(nèi)血流重新分布，從而改善通氣/血流比值有關(guān)[8]。同時肺組織病理也證實，部分液體通氣及聯(lián)合干細胞治療組可明顯減輕肺泡損傷，維持正常結(jié)構(gòu)。

研究表明，肺內(nèi)過度和失控的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致ARDS的根本原因，其中TNF-α、IL-1β和IL-6均與ARDS發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[1]。TNF-α、IL-1β是全身及局部炎癥反應(yīng)中起到重要作用的細胞因子，參與炎癥級聯(lián)反應(yīng)[9]。IL-10作為抗炎細胞因子被發(fā)現(xiàn)具有抑制NF-kB活化的功能，其變化是機體抗炎反應(yīng)的之一[9]。本研究在海水灌注后，大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6均顯著升高，提示機體對于海水淹溺出現(xiàn)全身炎癥反應(yīng)。同時IL-10也同時升高，作為機體對過多炎癥因子釋放的反應(yīng)，屬于機體的負反饋調(diào)節(jié)。針對肺損傷機體過度炎癥反應(yīng)，本研究中部分液體通氣聯(lián)合氣道植入間充質(zhì)干細胞組和部分液體通氣組，較常規(guī)通氣治療減輕了TNF-α、IL-1β和IL-6的升高，其中聯(lián)合治療組更加明顯?？紤]與PFC和MSCs均具有抗炎作用有關(guān)[10]。已有大量研究證明，MSCs具有免疫調(diào)節(jié)、抑制炎癥反應(yīng)的作用，并已在肺損傷的多種動物模型中被證實[11-12]。作為抗炎因子的IL-10，在聯(lián)合治療組較其他組升高更加明顯，這有可能與MSCs通過免疫調(diào)節(jié)作用，參與機體對炎癥反應(yīng)的調(diào)控有關(guān)。

針對解決ARDS中肺泡/毛細血管膜受損的問題，本研究提出利用MSCs修復(fù)損傷的這一特點進行嘗試。研究中可觀察到大鼠肺組織內(nèi)可見紅色熒光標(biāo)記的MSCs，提示通過氣管植入的外源MSC可順利植入肺組織內(nèi)。因本研究未進行長時間的觀察，需要后續(xù)研究觀察植入MSCs在修復(fù)損傷方面所起到的作用。

總之，本研究首次發(fā)現(xiàn)氣管植入間充質(zhì)干細胞聯(lián)合部分液體通氣，較常規(guī)機械通氣及部分液體通氣可更好的改善和維持氧合，減輕海水淹溺導(dǎo)致的肺組織損傷，并可更有效的減少細胞因子表達水平，這為研究救治海水淹溺致急性呼吸窘迫綜合征的方法，提供了新的思路和理論基礎(chǔ)。