復(fù)方羅歐咳祖帕中總多酚總黃酮的含量測(cè)定與抗氧化活性研究

李 瑋，李 莉，王曉梅，刁娟娟，王新玲

（新疆醫(yī)科大學(xué)1藥學(xué)院，2中心實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830011)

復(fù)方羅歐咳祖帕[1]是新疆地區(qū)的一種傳統(tǒng)方劑，由神香草和喜堿鳶尾根組成，具有溫肺平喘、化痰止咳的功效，主要用于治療氣道疾病，例如咳嗽、哮喘和慢性支氣管炎的治療。研究表明復(fù)方中神香草（Hyssopus cuspidatus Boriss）含有揮發(fā)油、多酚、黃酮、萜類等有效成分[2-9]，具有抗炎、抗氧化及抗哮喘的活性作用[10-14]。喜堿鳶尾根（Iris halophila Pal1）中主要化學(xué)成分也多為黃酮類異黃酮類化合物[15-17]，具有抗炎、抗腫瘤及神經(jīng)保護(hù)等活性作用[18-20]。本研究測(cè)定復(fù)方羅歐咳祖帕中總多酚、總黃酮的含量及抗氧化活性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器UV2500 型紫外-可見分光光度儀（日本島津公司），DRT-SX 型智能恒溫電熱套（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司），N-1001 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司），DZKW-D-2 型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），MODUL YOD-230 型全自動(dòng)定量濃縮儀（賽默飛世爾科技（中國）有限公司），AB135-S 型電子天平（梅特勒-托利多國際有限公司），Multiskan GO 型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）。

1.2 試藥神香草（新疆維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：Y1911044），喜堿鳶尾根（新疆恩薩爾維吾爾醫(yī)藥飲片藥業(yè)有限公司，批號(hào)：190523），沒食子酸（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：508F021），蘆?。ㄖ袊幤飞镏破窓z定所，批號(hào)：10080-201409），抗壞血酸(VC，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司，批號(hào)：20190214) ，1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號(hào)：5C5LI-GA），硫酸亞鐵(天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20130820) ，總抗氧化能力（T-AOC）檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20200622），其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 復(fù)方羅歐咳祖帕提取物的制備按照臨床用藥的配伍比例，采用水煎煮法制備復(fù)方羅歐咳祖帕粗提物，得到復(fù)方混合提取液后加入乙醇使成70% 乙醇溶液，4℃條件下靜置過夜，將提取液過濾，濾液減壓濃縮成浸膏后，冷凍干燥使成粉末，即得復(fù)方羅歐咳祖帕提取物，備用。

2.2 總多酚含量測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用福林酚法進(jìn)行總多酚含量測(cè)定，稱取沒食子酸對(duì)照品2.50 mg 置于25 mL容量瓶，用蒸餾水定容至刻度，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別吸取儲(chǔ)備液0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25 mL 置于25 mL 容量瓶，加入1.5 mL 福林酚試劑，8 min 后加入1.5 mL 10%Na2CO3溶液，用蒸餾水定容至刻度，25℃反應(yīng)1 h，測(cè)定765 nm 處吸光度。得到線性回歸方程：A= 144.77C+ 0.072 8，R2= 0.999 2，沒食子酸在（0.001～0.060）mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.2 復(fù)方羅歐咳祖帕總多酚含量測(cè)定 稱取復(fù)方羅歐咳祖帕25.00 mg，置于25 mL 容量瓶，用蒸餾水定容至刻度，即得供試品儲(chǔ)備液。從中吸取1.5 mL置于25 mL 容量瓶，按“2.2.1”項(xiàng)下方法，測(cè)定765 nm處吸光度，重復(fù)3 次，將吸光度值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算得到復(fù)方羅歐咳祖帕中總多酚含量為（47.5±1.8）mg/g。

2.3 總黃酮含量測(cè)定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法進(jìn)行總黃酮含量測(cè)定，稱取蘆丁對(duì)照品2.50 mg，置于25 mL 容量瓶，用70% 乙醇定容刻度，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別吸取儲(chǔ)備液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL 置于10 mL 容量瓶，加入400 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% 的NaNO2溶液，搖勻，6 min 后加入400 μL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)10% 的Al(NO3)3溶液，搖勻，6 min 后再加入4 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的NaOH 溶液，室溫避光放置15 min 后，以甲醇代替樣品提取液為空白調(diào)零，在510 nm 處測(cè)定吸光度。得到線性回歸方程：A= 10.628C+ 0.023 5，回歸系數(shù)：R2= 0.997 0，表明蘆丁質(zhì)量濃度在（0.002～0.040）mg/mL范圍內(nèi)與吸光度具有良好的線性關(guān)系。

2.3.2 復(fù)方羅歐咳祖帕總黃酮含量測(cè)定 稱取復(fù)方羅歐咳祖帕10.00 mg，置于10 mL 容量瓶，用甲醇定容至刻度，得到供試品儲(chǔ)備液。從中吸取2.5 mL 置于10 mL 容量瓶，按“2.3.1”項(xiàng)下方法，在510 nm 處測(cè)定吸光度，重復(fù)3次，將吸光度值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算得到復(fù)方羅歐咳祖帕總黃酮含量為（82.0±2.1）mg/g。

2.4 抗氧化活性測(cè)定

2.4.1 DPPH 自由基清除能力測(cè)定 稱取DPPH·粉末4.00 mg 置于100 mL 棕色容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，搖勻，得到0.04 mg/mL 的DPPH·溶液，備用。稱取復(fù)方羅歐咳祖帕25.00 mg，置于25 mL 容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，得到1 mg/mL 的復(fù)方羅歐咳祖帕儲(chǔ)備液，分別吸取儲(chǔ)備液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 置于10 mL 容量瓶，用無水乙醇定容至刻度，得到濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL的系列濃度復(fù)方羅歐咳祖帕溶液，分別吸取各濃度復(fù)方羅歐咳祖帕溶液1.0 mL，加入具塞試管中，再分別加入2 mL 0.04 mg/mL 的DPPH·溶液，搖勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，在517 nm 處測(cè)定吸光度；以Vc 為陽性對(duì)照，稱取VC25.00 mg，置于25 mL 容量瓶，用無水乙醇定容至刻度，得到1 mg/mL 的VC儲(chǔ)備液，分別吸取儲(chǔ)備液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL 置于10 mL 容量瓶，用無水乙醇定容至刻度，得到濃度為0.01、0.02、0.04、0.06、0.08 mg/mL 的系列濃度Vc 溶液，吸取各濃度VC溶液1.0 mL，分別加入具塞試管中，再加2 mL 0.04 mg/mL的DPPH·溶液，搖勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，在517 nm 處測(cè)定吸光度，按照公式DPPH 自由基清除率%=[A0-(Ax-A1) /A0]×100% 計(jì)算清除率，公式中：AX為樣品溶液（或?qū)φ掌啡芤海獶PPH·溶液；A0為蒸餾水＋DPPH·溶液；A1為樣品溶液（或?qū)φ掌啡芤海珶o水乙醇，每組平行測(cè)定3次。分別以VC和復(fù)方羅歐咳祖帕濃度為橫坐標(biāo)，以DPPH 自由基清除率作為縱坐標(biāo)，求得復(fù)方羅歐咳祖帕對(duì)DPPH 自由基清除能力的EC50值為0.46 mg/mL，Vc 的EC50值為0.01 mg/mL，見圖1。

圖1 復(fù)方羅歐咳祖帕DPPH自由基清除率

2.4.2 OH 自由基清除能力測(cè)定 稱取FeSO427.36 mg 置于100 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，得到1.8 mmol/L的FeSO4溶液，備用。稱取水楊酸24.86 mg 置于100 mL 容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，搖勻，得到1.8 mmol/L 的水楊酸乙醇溶液，備用。 將30% 雙氧水溶液用蒸餾水稀釋成濃度為0.03% 的雙氧水溶液，備用。稱取復(fù)方羅歐咳祖帕100.00 mg，置于10 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，得到10 mg/mL 的復(fù)方羅歐咳祖帕儲(chǔ)備液，分別吸取儲(chǔ)備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 置于10 mL 容量瓶，用蒸餾水定容至刻度，得到濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL 的系列濃度復(fù)方羅歐咳祖帕溶液，分別吸取各濃度復(fù)方羅歐咳祖帕溶液1.0 mL，加入具塞試管中，試管中提前加入2 mL 1.8 mmol/L 的FeSO4溶液和1.5 mL 1.8 mmol/L 的水楊酸乙醇溶液，加入樣品溶液后，震蕩搖勻，再加入0.1 mL H2O2（0.03%）溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，于37℃水浴加熱30 min，在510nm 出測(cè)定吸光度；以Vc 為陽性對(duì)照，稱取VC25.00 mg，置于25 mL容量瓶，用蒸餾水定容至刻度，得到1 mg/mL 的VC儲(chǔ)備液，分別吸取儲(chǔ)備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 置于10 mL 容量瓶，用蒸餾水定容至刻度，得到濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mg/mL 的系列濃度Vc 溶液，吸取各濃度VC溶液1.0 mL，分別加入具塞試管中，試管中提前加入2 mL 1.8 mmol/L 的FeSO4溶液和1. 5 mL 1.8 mmol/L的水楊酸乙醇溶液，加入樣品溶液后，震蕩搖勻，再加入0.1 mL H2O2（0.03%）溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，于37℃水浴加熱30 min，在510 nm 處測(cè)定吸光度，按照公式：OH 自由基清除率%=(A0-Ax) /A0×100%計(jì)算清除率，公式中：Ax為樣品溶液（或?qū)φ掌啡芤海?FeSO4溶液+水楊酸乙醇溶液+ H2O2溶液；A0為蒸餾水+FeSO4溶液+水楊酸乙醇溶液+ H2O2溶液，每組平行測(cè)定3 次。分別以VC和復(fù)方羅歐咳祖帕濃度為橫坐標(biāo)，以O(shè)H 自由基清除率作為縱坐標(biāo)，求得復(fù)方羅歐咳祖帕對(duì)OH 自由基清除能力的EC50為1.32 mg/mL，Vc的EC50為0.12 mg/mL，見圖2。

圖2 復(fù)方羅歐咳祖帕OH自由基清除率

2.4.3 總抗氧化能力（T-AOC）測(cè)定 按試劑盒說明書操作將40 μmol/mL FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液用蒸餾水稀釋至0.1、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25、0.003 125 μmol/mL，分別吸取500 μL 標(biāo)準(zhǔn)溶液（蒸餾水作空白）至96孔板中，加入500 μL試劑二，充分混勻，此時(shí)FeSO4標(biāo)準(zhǔn) 溶 液 的 終 濃 度 為0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125、0.001 56 μmol/mL。 室溫反應(yīng)10 min，在593 nnm 處測(cè)定吸光度A，以FeSO4終濃度為橫坐標(biāo)，以A 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：A=5.126 2C+ 0.035 7，R2=0.999 5，結(jié)果表明FeSO4在質(zhì)量濃度（0.01～2.00）mg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。稱取復(fù)方羅歐咳祖帕100.00 mg，置于10 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，得到濃度為10 mg/mL 的復(fù)方羅歐咳祖帕儲(chǔ)備液，分別吸取0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL 置于10 mL 容量瓶，用蒸餾水定容至刻度，得到濃度為0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL 的復(fù)方羅歐咳祖帕溶液；以VC為陽性對(duì)照，配制相同濃度的VC溶液（濃度為0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL），分別吸取30 μL復(fù)方羅歐咳祖帕溶液和VC溶液至96 孔板中，按說明書步驟配制并加入混合液900 μL，加入蒸餾水90μL，輕微震蕩使溶液充分混勻，室溫反應(yīng)10 min，在593 nm 處測(cè)定吸光度Ax，將Ax代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，求得被還原的Fe2+-TPTZ 的濃度C（μmol/mL）。根據(jù)公式總抗氧化能力（μmol/mL）=C×V總÷V樣計(jì)算復(fù)方羅歐咳祖帕和VC的總抗氧化能力，公式中V總為反應(yīng)總體積1.02 mL；V樣為反應(yīng)中樣本體積0.03mL。復(fù)方羅歐咳祖帕總抗氧化能力和濃度相關(guān)，在濃度為0.01～2.00 mg/mL 范圍內(nèi)，復(fù)方羅歐咳祖帕及Vc 的總抗氧化活性能力都隨著濃度的增加而逐漸增強(qiáng)；當(dāng)濃度為1.0 mg/mL 時(shí)，復(fù)方羅歐咳祖帕總抗氧化能力為2.85 μmol /mL，VC總抗氧化能力為10.96 μmol /mL,見表1、圖3。

表1 復(fù)方羅歐咳祖帕還原Fe2+-TPTZ的濃度/（μmol/mL）

圖3 復(fù)方羅歐咳祖帕總抗氧化能力

3 討論

復(fù)方羅歐咳祖帕目前存在臨床定位不清、化學(xué)成分不明等問題，本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方羅歐咳祖帕中富含黃酮類和多酚類化學(xué)成分，且通過3種抗氧化模型研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方羅歐咳祖帕具有較好的抗氧化活性，為黃酮和多酚類化合物作為抗氧化功能性成分提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)復(fù)方羅歐咳祖帕物質(zhì)基礎(chǔ)的研究和生物活性的考察提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。