熒光快速現(xiàn)場評價在惡性胸膜疾病診斷中的應(yīng)用

王 劍 宋 嘉 陳清勇

隨著氣管鏡介入技術(shù)的發(fā)展，如何取得足量陽性標(biāo)本、指導(dǎo)精準(zhǔn)治療是臨床醫(yī)生面臨的問題。因此，快速現(xiàn)場評價（ROSE）在國內(nèi)已越來越受重視。研究表明，ROSE 結(jié)合氣管鏡介入技術(shù)，可有效減少操作時間和活檢次數(shù)，提高診斷陽性率，減少并發(fā)癥[1-2]。目前國內(nèi)的ROSE 技術(shù)主要是迪夫快速染色法，該法存在一些缺陷，例如對細(xì)胞學(xué)專業(yè)水平要求高、染色過程復(fù)雜、試劑有毒易揮發(fā)等[3]。本研究對現(xiàn)有的吖啶橙染色法進行改進，首次將熒光染色法引入ROSE，為臨床工作者提供新的方法。

1 資料與方法

1.1 研究對象 納入2017 年6 月—2020 年3 月中國人民解放軍第903 醫(yī)院收治的32 例不明原因胸腔積液患者，其中男23 例，女9 例，年齡36～73（59.3±9.4）歲，肺腺癌伴胸膜轉(zhuǎn)移31 例，肺鱗癌伴胸膜轉(zhuǎn)移1 例。所有患者均行內(nèi)科胸腔鏡檢查，并行ROSE 評估。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡18～75歲；（2）胸部CT 或胸片提示胸腔積液，性質(zhì)不明者；（3）簽署檢查知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并嚴(yán)重凝血功能障礙、出血傾向或嚴(yán)重臟器功能不全；（2）不同意接受內(nèi)科胸腔鏡檢查者；（3）存在內(nèi)科胸腔鏡檢查禁忌。

1.3 檢查方法 術(shù)前行血常規(guī)、凝血功能、乙肝三系、輸血三項、心電圖、肺功能等常規(guī)檢查?；颊呷〗?cè)臥位，超聲檢查觀察胸腔積液及胸膜粘連情況，以確定最佳穿刺點，建立靜脈通道，術(shù)前0.5h 可肌注地西泮5mg、嗎啡5mg 鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛，同時予心電監(jiān)護監(jiān)測生命體征。根據(jù)術(shù)前定位點，常規(guī)消毒鋪巾，2%利多卡因逐層局部注射至胸膜，作皮膚切口（1.0～1.5cm），用止血鉗逐層鈍性分離胸膜壁層，直至穿透壁層胸膜，插入套管針（Trocar）并固定，拔出套管針芯，立即插入胸腔鏡，抽出胸水后旋轉(zhuǎn)胸腔鏡，按內(nèi)、前、上、后、下順序觀察臟層、壁層、膈胸膜及肋膈竇，觀察組織色澤、彈性、活動度，同時注意術(shù)中患者生命體征變化；直視下選擇病變部位避開大血管，多處活檢（5～15 塊），留取胸水標(biāo)本；術(shù)畢，退出胸腔鏡及套管，在切口處放置多側(cè)孔20F 引流管接水封瓶行閉式引流，縫合固定引流管。

1.4 標(biāo)本處理 將適量吖啶橙粉末與95%乙醇混合，配置成0.05%濃度的吖啶橙染色液。（1）將10mL胸水放置于離心管內(nèi)，離心速度1500r/min，離心5min，棄上清液，用移液槍將細(xì)胞沉淀與剩余上清吹打混勻后，吸取適量滴在載玻片上，進行細(xì)胞涂片自內(nèi)向外涂抹出直徑約1cm 的圓形，厚薄適度?；顧z胸膜組織用注射器針頭挑起，在載玻片上涂抹直徑約1cm 圓形，厚薄適中。上述所有標(biāo)本一式兩份。（2）將所制的玻片分別置于吖啶橙染色液或迪夫染色液中。其中，玻片在吖啶橙染色液中浸泡約30s，再于磷酸鹽緩沖液中輕輕洗滌5s 后，擦干玻片底部，加載玻片熒光顯微鏡下觀察。迪夫快速染色法[3-4]：先于迪夫A 液（Diff-quik A）中浸泡約20s；再于磷酸鹽緩沖液中輕輕洗滌5s，甩干緩沖液；再把玻片完全浸于迪夫B 液（Diff-quik B）15s；最后清水染缸中水洗5s，擦干玻片底部后于普通顯微鏡下觀察。

1.5 評價標(biāo)準(zhǔn) 由2 名經(jīng)驗豐富的細(xì)胞學(xué)醫(yī)師觀察細(xì)胞成分及形態(tài)，進行綜合分析，并記錄判讀結(jié)果。迪夫快速染色后發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞認(rèn)定為陽性，只見淋巴細(xì)胞、間皮細(xì)胞、紅細(xì)胞而無腫瘤細(xì)胞，則認(rèn)定為陰性。吖啶橙染色后凡細(xì)胞核呈黃色或綠色，胞質(zhì)呈火焰樣橘紅色的熒光，又具備惡性細(xì)胞的形態(tài)特征者為陽性。細(xì)胞核呈亮綠色，胞質(zhì)呈灰綠色者為陰性。最終診斷由病理科醫(yī)師依據(jù)細(xì)胞學(xué)、組織病理形態(tài)學(xué)及免疫組化結(jié)果確定。

1.6 觀察指標(biāo) 比較兩種染色方法在操作時間、判讀所需時間、診斷的敏感度和特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、診斷符合率。其中靈敏度=真陽性例數(shù)/（真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%，特異度=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù)）×100%，陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/（真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù)）×100%，陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/（真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù)）×100%。總結(jié)歸納熒光染色后的細(xì)胞學(xué)特征。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計量）表示，符合正態(tài)分布者采用參數(shù)檢驗，不符合正態(tài)分布者采用非參數(shù)檢驗；計數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗，診斷符合率采用Kappa 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤細(xì)胞經(jīng)不同染色后細(xì)胞學(xué)特征 胸膜組織和細(xì)胞沉淀涂片經(jīng)迪夫快速染色后表現(xiàn)為細(xì)胞核大，深染，細(xì)胞核異型明顯，細(xì)胞胞漿豐富，背景可見紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及白細(xì)胞（見圖1A、C）；胸膜組織和細(xì)胞沉淀涂片經(jīng)吖啶橙染色后表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞整體較大，細(xì)胞核大、異型明顯，呈現(xiàn)強烈的黃色熒光，部分細(xì)胞核內(nèi)可見核仁，胞漿呈現(xiàn)鮮亮的橘紅色，個別病例的腺癌細(xì)胞可見豐富胞漿，分泌的黏液表現(xiàn)為透明，將細(xì)胞核擠至一邊。正常細(xì)胞如白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞均表現(xiàn)為細(xì)胞核小，或有分葉，呈綠色熒光，包漿少，無橘紅色熒光（見圖1B、D）。

圖1 不同染色后的腫瘤細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)

2.2 兩種染色方法操作時間、判讀簡易程度比較結(jié)果顯示，胸膜組織涂片后經(jīng)熒光染色，總體耗時（44.69±2.60）s，迪夫染色耗時（54.44±2.80）s，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；胸水沉淀涂片后經(jīng)熒光染色，總體耗時（44.88±2.22）s，迪夫染色耗時（53.94±4.05）s，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。胸膜組織經(jīng)熒光染色后，判讀需（6.53±1.57）s，迪夫染色判讀需（6.13±1.31）s，兩組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.117）；胸水沉淀涂片后經(jīng)熒光染色，判讀需（10.13±2.63）s，迪夫染色判讀需（14.31±2.98）s，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 兩種染色方法診斷結(jié)果比較 32 例病例經(jīng)常規(guī)組織病理學(xué)和免疫組化檢查，最終均診斷為肺癌伴胸膜轉(zhuǎn)移，液基細(xì)胞學(xué)檢查找到癌性細(xì)胞24 例，8例未找到癌性細(xì)胞。吖啶橙染色法診斷癌性胸水24例，8 例未找到癌性細(xì)胞，對胸水性質(zhì)鑒別診斷的敏感度為88.0%，特異度為71.4%，陽性預(yù)測值為91.7%，陰性預(yù)測值為62.5%，與液基結(jié)果符合率為84.3%；迪夫快速染色法診斷癌性胸水26 例，6 例未資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s找到癌性細(xì)胞，對胸水性質(zhì)診斷的敏感度為87.5%，特異度為37.5%，陽性預(yù)測值為80.8%，陰性預(yù)測值為50.0%，與液基結(jié)果符合率為80.0%。兩種方法比較對胸水最終診斷結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.24）。兩種方法均在胸膜組織涂片中找到癌細(xì)胞，對胸膜組織診斷的特異度為100%，陽性預(yù)測值為100%，與組織病理學(xué)診斷結(jié)果符合率為100%，兩種方法對胸膜活檢組織最終診斷結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1-2。

表1 吖啶橙染色對胸水沉淀判讀結(jié)果

表2 迪夫快速染色對胸水沉淀判讀結(jié)果

3 討論

目前，國內(nèi)ROSE 技術(shù)主要采用迪夫快速染色，但存在幾個問題：（1）操作需四步，耗時時間1～2min，加之涂片、鏡下觀察、判讀，總體耗時需2～4min；（2）迪夫染色劑的A 液為甲醇配置，甲醇具有揮發(fā)性及毒性；（3）國內(nèi)的ROSE 技術(shù)主要由肺科醫(yī)師操作，缺乏細(xì)胞病理學(xué)知識，并且每個從事ROSE 工作的肺科醫(yī)師細(xì)胞學(xué)水平不一，對大部分肺科醫(yī)生而言判讀仍有一定的難度。盡管有研究表明肺科醫(yī)師經(jīng)過3 個月的細(xì)胞病理學(xué)知識培訓(xùn)后，ROSE 判讀的準(zhǔn)確率可達80%，與病理學(xué)家相比（準(zhǔn)確率92%）無統(tǒng)計學(xué)差異[5-6]，但是臨床工作中12%的差距仍可能給臨床診治帶來較大困難。因此，尋找一種既能夠降低判讀難度，又能保證染色效果、縮短操作時間的染色方法對肺科醫(yī)生而言具有重要意義。

吖啶橙是一種特異性熒光染料，當(dāng)與細(xì)胞內(nèi)的DNA 結(jié)合時發(fā)出黃色或黃綠熒光，與RNA 結(jié)合時發(fā)出橘黃色或橘紅色熒光，熒光強度與核酸豐度呈正比[7-8]。腫瘤細(xì)胞的DNA、RNA 較正常細(xì)胞多，因此熒光更強，色澤更鮮艷，紅細(xì)胞因無DNA 和RNA，不能發(fā)出熒光，因此在細(xì)胞背景中被過濾。余泉峰等[9]利用吖啶橙染色尋找尿液中脫落細(xì)胞診斷膀胱移行細(xì)胞癌400 例，總陽性率可達77%，而HE 染色、巴氏染色法等，陽性率僅40%～60%。馬富玲等[10]將前列腺癌細(xì)胞系或腎癌細(xì)胞系與正常血清混合來模擬循環(huán)腫瘤細(xì)胞，再用吖啶橙染色后觀察，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞具有獨特的色彩及形態(tài)學(xué)特征，能夠較為容易的和正常細(xì)胞區(qū)別。

受上述研究啟發(fā)，我們嘗試將這一染色方法引入ROSE，并對惡性胸膜疾病進行初步診斷。傳統(tǒng)的吖啶橙染色需經(jīng)乙醇固定、吖啶橙染色、漂洗等步驟[11]，耗時約15min，不能滿足ROSE 的“快速”要求，我們對此進行改進，將吖啶橙直接加入95%乙醇中，實現(xiàn)固定和染色同步，將染色時間縮短為30s。結(jié)果顯示，兩種方法對胸膜活檢組織、胸水脫落細(xì)胞判讀均具有較好的靈敏度、特異度以及陽性預(yù)測值，最終病理結(jié)果符合率均較高。但吖啶橙染色在判讀簡易程度、操作時間方面，明顯優(yōu)于迪夫快速染色。我們認(rèn)為胸水中腫瘤細(xì)胞數(shù)量不多，迪夫染色后尋找腫瘤細(xì)胞較為困難，吖啶橙染色后腫瘤細(xì)胞可在熒光下激發(fā)出特異性色彩，較為容易找到，因此判讀優(yōu)勢明顯；胸膜組織活檢是針對病變部位直接活檢，本身標(biāo)本陽性率高，組織涂片后腫瘤細(xì)胞數(shù)量都較大，判讀難度不高，因此吖啶橙染色判讀無優(yōu)勢。此外乙醇作為溶劑是相對無毒的，避免了甲醇作為溶劑揮發(fā)吸入人體后帶來的危害。但本研究也存在一些缺陷，如研究的樣本量少、熒光顯微鏡成本高、熒光易淬滅故標(biāo)本不易長久保存等，需進一步深入研究和改進。

綜上所述，吖啶橙染色可作為一種新型的ROSE 手段聯(lián)合胸腔鏡檢查用于惡性胸膜疾病的初步診斷，具有簡易、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點，值得臨床推廣應(yīng)用。