王 劍 宋 嘉 陳清勇
隨著氣管鏡介入技術(shù)的發(fā)展,如何取得足量陽性標(biāo)本、指導(dǎo)精準(zhǔn)治療是臨床醫(yī)生面臨的問題。因此,快速現(xiàn)場評價(ROSE)在國內(nèi)已越來越受重視。研究表明,ROSE 結(jié)合氣管鏡介入技術(shù),可有效減少操作時間和活檢次數(shù),提高診斷陽性率,減少并發(fā)癥[1-2]。目前國內(nèi)的ROSE 技術(shù)主要是迪夫快速染色法,該法存在一些缺陷,例如對細(xì)胞學(xué)專業(yè)水平要求高、染色過程復(fù)雜、試劑有毒易揮發(fā)等[3]。本研究對現(xiàn)有的吖啶橙染色法進行改進,首次將熒光染色法引入ROSE,為臨床工作者提供新的方法。
1.1 研究對象 納入2017 年6 月—2020 年3 月中國人民解放軍第903 醫(yī)院收治的32 例不明原因胸腔積液患者,其中男23 例,女9 例,年齡36~73(59.3±9.4)歲,肺腺癌伴胸膜轉(zhuǎn)移31 例,肺鱗癌伴胸膜轉(zhuǎn)移1 例。所有患者均行內(nèi)科胸腔鏡檢查,并行ROSE 評估。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過。
1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn):(1)年齡18~75歲;(2)胸部CT 或胸片提示胸腔積液,性質(zhì)不明者;(3)簽署檢查知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并嚴(yán)重凝血功能障礙、出血傾向或嚴(yán)重臟器功能不全;(2)不同意接受內(nèi)科胸腔鏡檢查者;(3)存在內(nèi)科胸腔鏡檢查禁忌。
1.3 檢查方法 術(shù)前行血常規(guī)、凝血功能、乙肝三系、輸血三項、心電圖、肺功能等常規(guī)檢查?;颊呷〗?cè)臥位,超聲檢查觀察胸腔積液及胸膜粘連情況,以確定最佳穿刺點,建立靜脈通道,術(shù)前0.5h 可肌注地西泮5mg、嗎啡5mg 鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛,同時予心電監(jiān)護監(jiān)測生命體征。根據(jù)術(shù)前定位點,常規(guī)消毒鋪巾,2%利多卡因逐層局部注射至胸膜,作皮膚切口(1.0~1.5cm),用止血鉗逐層鈍性分離胸膜壁層,直至穿透壁層胸膜,插入套管針(Trocar)并固定,拔出套管針芯,立即插入胸腔鏡,抽出胸水后旋轉(zhuǎn)胸腔鏡,按內(nèi)、前、上、后、下順序觀察臟層、壁層、膈胸膜及肋膈竇,觀察組織色澤、彈性、活動度,同時注意術(shù)中患者生命體征變化;直視下選擇病變部位避開大血管,多處活檢(5~15 塊),留取胸水標(biāo)本;術(shù)畢,退出胸腔鏡及套管,在切口處放置多側(cè)孔20F 引流管接水封瓶行閉式引流,縫合固定引流管。
1.4 標(biāo)本處理 將適量吖啶橙粉末與95%乙醇混合,配置成0.05%濃度的吖啶橙染色液。(1)將10mL胸水放置于離心管內(nèi),離心速度1500r/min,離心5min,棄上清液,用移液槍將細(xì)胞沉淀與剩余上清吹打混勻后,吸取適量滴在載玻片上,進行細(xì)胞涂片自內(nèi)向外涂抹出直徑約1cm 的圓形,厚薄適度?;顧z胸膜組織用注射器針頭挑起,在載玻片上涂抹直徑約1cm 圓形,厚薄適中。上述所有標(biāo)本一式兩份。(2)將所制的玻片分別置于吖啶橙染色液或迪夫染色液中。其中,玻片在吖啶橙染色液中浸泡約30s,再于磷酸鹽緩沖液中輕輕洗滌5s 后,擦干玻片底部,加載玻片熒光顯微鏡下觀察。迪夫快速染色法[3-4]:先于迪夫A 液(Diff-quik A)中浸泡約20s;再于磷酸鹽緩沖液中輕輕洗滌5s,甩干緩沖液;再把玻片完全浸于迪夫B 液(Diff-quik B)15s;最后清水染缸中水洗5s,擦干玻片底部后于普通顯微鏡下觀察。
1.5 評價標(biāo)準(zhǔn) 由2 名經(jīng)驗豐富的細(xì)胞學(xué)醫(yī)師觀察細(xì)胞成分及形態(tài),進行綜合分析,并記錄判讀結(jié)果。迪夫快速染色后發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞認(rèn)定為陽性,只見淋巴細(xì)胞、間皮細(xì)胞、紅細(xì)胞而無腫瘤細(xì)胞,則認(rèn)定為陰性。吖啶橙染色后凡細(xì)胞核呈黃色或綠色,胞質(zhì)呈火焰樣橘紅色的熒光,又具備惡性細(xì)胞的形態(tài)特征者為陽性。細(xì)胞核呈亮綠色,胞質(zhì)呈灰綠色者為陰性。最終診斷由病理科醫(yī)師依據(jù)細(xì)胞學(xué)、組織病理形態(tài)學(xué)及免疫組化結(jié)果確定。
1.6 觀察指標(biāo) 比較兩種染色方法在操作時間、判讀所需時間、診斷的敏感度和特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、診斷符合率。其中靈敏度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%,特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%,陽性預(yù)測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%,陰性預(yù)測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%。總結(jié)歸納熒光染色后的細(xì)胞學(xué)特征。
1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。計量)表示,符合正態(tài)分布者采用參數(shù)檢驗,不符合正態(tài)分布者采用非參數(shù)檢驗;計數(shù)資料以例(%)表示,采用χ2檢驗,診斷符合率采用Kappa 檢驗,以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 腫瘤細(xì)胞經(jīng)不同染色后細(xì)胞學(xué)特征 胸膜組織和細(xì)胞沉淀涂片經(jīng)迪夫快速染色后表現(xiàn)為細(xì)胞核大,深染,細(xì)胞核異型明顯,細(xì)胞胞漿豐富,背景可見紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及白細(xì)胞(見圖1A、C);胸膜組織和細(xì)胞沉淀涂片經(jīng)吖啶橙染色后表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞整體較大,細(xì)胞核大、異型明顯,呈現(xiàn)強烈的黃色熒光,部分細(xì)胞核內(nèi)可見核仁,胞漿呈現(xiàn)鮮亮的橘紅色,個別病例的腺癌細(xì)胞可見豐富胞漿,分泌的黏液表現(xiàn)為透明,將細(xì)胞核擠至一邊。正常細(xì)胞如白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞均表現(xiàn)為細(xì)胞核小,或有分葉,呈綠色熒光,包漿少,無橘紅色熒光(見圖1B、D)。
圖1 不同染色后的腫瘤細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)
2.2 兩種染色方法操作時間、判讀簡易程度比較結(jié)果顯示,胸膜組織涂片后經(jīng)熒光染色,總體耗時(44.69±2.60)s,迪夫染色耗時(54.44±2.80)s,兩組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);胸水沉淀涂片后經(jīng)熒光染色,總體耗時(44.88±2.22)s,迪夫染色耗時(53.94±4.05)s,兩組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。胸膜組織經(jīng)熒光染色后,判讀需(6.53±1.57)s,迪夫染色判讀需(6.13±1.31)s,兩組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.117);胸水沉淀涂片后經(jīng)熒光染色,判讀需(10.13±2.63)s,迪夫染色判讀需(14.31±2.98)s,兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
2.3 兩種染色方法診斷結(jié)果比較 32 例病例經(jīng)常規(guī)組織病理學(xué)和免疫組化檢查,最終均診斷為肺癌伴胸膜轉(zhuǎn)移,液基細(xì)胞學(xué)檢查找到癌性細(xì)胞24 例,8例未找到癌性細(xì)胞。吖啶橙染色法診斷癌性胸水24例,8 例未找到癌性細(xì)胞,對胸水性質(zhì)鑒別診斷的敏感度為88.0%,特異度為71.4%,陽性預(yù)測值為91.7%,陰性預(yù)測值為62.5%,與液基結(jié)果符合率為84.3%;迪夫快速染色法診斷癌性胸水26 例,6 例未資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s找到癌性細(xì)胞,對胸水性質(zhì)診斷的敏感度為87.5%,特異度為37.5%,陽性預(yù)測值為80.8%,陰性預(yù)測值為50.0%,與液基結(jié)果符合率為80.0%。兩種方法比較對胸水最終診斷結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.24)。兩種方法均在胸膜組織涂片中找到癌細(xì)胞,對胸膜組織診斷的特異度為100%,陽性預(yù)測值為100%,與組織病理學(xué)診斷結(jié)果符合率為100%,兩種方法對胸膜活檢組織最終診斷結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1-2。
表1 吖啶橙染色對胸水沉淀判讀結(jié)果
表2 迪夫快速染色對胸水沉淀判讀結(jié)果
目前,國內(nèi)ROSE 技術(shù)主要采用迪夫快速染色,但存在幾個問題:(1)操作需四步,耗時時間1~2min,加之涂片、鏡下觀察、判讀,總體耗時需2~4min;(2)迪夫染色劑的A 液為甲醇配置,甲醇具有揮發(fā)性及毒性;(3)國內(nèi)的ROSE 技術(shù)主要由肺科醫(yī)師操作,缺乏細(xì)胞病理學(xué)知識,并且每個從事ROSE 工作的肺科醫(yī)師細(xì)胞學(xué)水平不一,對大部分肺科醫(yī)生而言判讀仍有一定的難度。盡管有研究表明肺科醫(yī)師經(jīng)過3 個月的細(xì)胞病理學(xué)知識培訓(xùn)后,ROSE 判讀的準(zhǔn)確率可達80%,與病理學(xué)家相比(準(zhǔn)確率92%)無統(tǒng)計學(xué)差異[5-6],但是臨床工作中12%的差距仍可能給臨床診治帶來較大困難。因此,尋找一種既能夠降低判讀難度,又能保證染色效果、縮短操作時間的染色方法對肺科醫(yī)生而言具有重要意義。
吖啶橙是一種特異性熒光染料,當(dāng)與細(xì)胞內(nèi)的DNA 結(jié)合時發(fā)出黃色或黃綠熒光,與RNA 結(jié)合時發(fā)出橘黃色或橘紅色熒光,熒光強度與核酸豐度呈正比[7-8]。腫瘤細(xì)胞的DNA、RNA 較正常細(xì)胞多,因此熒光更強,色澤更鮮艷,紅細(xì)胞因無DNA 和RNA,不能發(fā)出熒光,因此在細(xì)胞背景中被過濾。余泉峰等[9]利用吖啶橙染色尋找尿液中脫落細(xì)胞診斷膀胱移行細(xì)胞癌400 例,總陽性率可達77%,而HE 染色、巴氏染色法等,陽性率僅40%~60%。馬富玲等[10]將前列腺癌細(xì)胞系或腎癌細(xì)胞系與正常血清混合來模擬循環(huán)腫瘤細(xì)胞,再用吖啶橙染色后觀察,發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞具有獨特的色彩及形態(tài)學(xué)特征,能夠較為容易的和正常細(xì)胞區(qū)別。
受上述研究啟發(fā),我們嘗試將這一染色方法引入ROSE,并對惡性胸膜疾病進行初步診斷。傳統(tǒng)的吖啶橙染色需經(jīng)乙醇固定、吖啶橙染色、漂洗等步驟[11],耗時約15min,不能滿足ROSE 的“快速”要求,我們對此進行改進,將吖啶橙直接加入95%乙醇中,實現(xiàn)固定和染色同步,將染色時間縮短為30s。結(jié)果顯示,兩種方法對胸膜活檢組織、胸水脫落細(xì)胞判讀均具有較好的靈敏度、特異度以及陽性預(yù)測值,最終病理結(jié)果符合率均較高。但吖啶橙染色在判讀簡易程度、操作時間方面,明顯優(yōu)于迪夫快速染色。我們認(rèn)為胸水中腫瘤細(xì)胞數(shù)量不多,迪夫染色后尋找腫瘤細(xì)胞較為困難,吖啶橙染色后腫瘤細(xì)胞可在熒光下激發(fā)出特異性色彩,較為容易找到,因此判讀優(yōu)勢明顯;胸膜組織活檢是針對病變部位直接活檢,本身標(biāo)本陽性率高,組織涂片后腫瘤細(xì)胞數(shù)量都較大,判讀難度不高,因此吖啶橙染色判讀無優(yōu)勢。此外乙醇作為溶劑是相對無毒的,避免了甲醇作為溶劑揮發(fā)吸入人體后帶來的危害。但本研究也存在一些缺陷,如研究的樣本量少、熒光顯微鏡成本高、熒光易淬滅故標(biāo)本不易長久保存等,需進一步深入研究和改進。
綜上所述,吖啶橙染色可作為一種新型的ROSE 手段聯(lián)合胸腔鏡檢查用于惡性胸膜疾病的初步診斷,具有簡易、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點,值得臨床推廣應(yīng)用。