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    高效液相色譜法測定飼料中的單寧酸

    2021-10-27 03:50:22常選妞楊新玲楊建平
    畜禽業(yè) 2021年10期
    關鍵詞:甲醇溶液單寧酸檢出限

    常選妞,楊新玲,楊建平

    (1.河南牧業(yè)經濟學院河南省非常規(guī)飼料資源創(chuàng)新利用重點實驗室,河南 鄭州 450046;2河南牧業(yè)經濟學院理學院,河南 鄭州 450046;3.河南牧業(yè)經濟學院河南省高校飼料工程技術研究中心,河南 鄭州 450046)

    0 引言

    單寧酸是由五倍子提取得到的一種鞣酸,單寧酸結構中含有多酚基團,有很強的生理活性功能,單寧酸的抗菌、消炎、促生長和防治腸道腹瀉,抑制大腸桿菌、輪狀病毒的作用在動物營養(yǎng)界被廣泛關注「1」。關于單寧酸的測定標準有LY/T 1642-2005《單寧酸分析試驗方法》「2」和GB/T 27985-2011《飼料中單寧的測定分光光度法》「3」,這兩個標準針對測定高含量的單寧酸原料,且操作繁瑣、耗時、所用試劑多。而對基質復雜的常規(guī)配合飼料、濃縮飼料、混合型飼料添加劑中低含量的單寧酸的檢測方法尚未有報道。本研究建立以高效液相色譜測定飼料中單寧酸方法,方法簡便、快捷、準確,適合飼料企業(yè)作為質量控制的方法。

    1 材料與方法

    1.1 儀器與試劑

    Waters 2695高效液相色譜儀;W2487雙通道紫外可見檢測器;甲醇(色譜純,F(xiàn)isher);乙腈(色譜純,F(xiàn)isher);單寧酸標準品(含量≥95.2%)。

    單寧酸標準溶液:準確稱取單寧酸標準品25 mg(精確至0.1 mg),置于100 mL容量瓶中,用水溶解,定容至刻度,搖勻。該儲備液的濃度為250 μg/mL。

    單寧酸標準工作液:準確移取不同體積的儲備液,用水配制成不同濃度的標準工作液。

    1.2 樣品前處理

    稱取配合飼料樣品5.0 g,濃縮飼料3.0~5.0 g,預混料1.0 g置于50 mL離心管中,加入20%甲醇溶液25.00 mL,渦旋15 min,8 000 r/min 離心5 min,取出上清液,殘渣用20%甲醇溶液25.00 mL重新提取1次。合并2次提取液,混勻,精密移取提取液適量,50℃氮吹干,加5.00 mL 20%甲醇溶液復溶,取上清液過0.45 μm濾膜,上機測定。

    1.3 色譜條件

    色譜柱為WatersXB-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動相為甲醇:0.1%磷酸水溶液=20:80,流速:1.0 mL/min;進樣量:10 μL;檢測波長:275 nm。

    2 結果與分析

    2.1 提取條件的優(yōu)化

    單寧酸分子有較強的極性,極易溶于水和一些有機溶劑中如甲醇、乙腈、乙酸、乙酸乙酯等,而在三氯甲烷、正己烷中均不溶。故選擇水、甲醇、乙腈作為提取溶劑反復試驗,試驗結果發(fā)現(xiàn),用水提取溶劑,回收率低,考慮單寧酸易被氧化,商品用單寧酸做成包被產品,不容易提取出來。甲醇作為提取溶劑,回收率高,但提取液里雜質多,基質干擾。用乙腈作為提取溶劑,回收率高,基質干擾小,故選擇乙腈作為提取溶劑。

    2.2 檢測波長的選擇

    取單寧酸適量,用20%甲醇溶液配成單寧酸濃度為10 μg/mL的溶液,用紫外-可見分光光度計在200~400 nm掃描。結果表明,單寧酸在275nm處有最大吸收,因此,波長選擇275 nm。

    2.3 流動相的篩選與優(yōu)化

    單寧酸結構中有多酚羥基和羧基,極性強、在C18柱上幾乎無保留,水中含有一定量的磷酸能增加保留時間,同時還能抑制單寧酸氧化和離子化,減少拖尾。采用梯度洗脫,單寧酸峰型完好,無雜質干擾,分離色譜圖如圖1、圖2所示。

    圖1 單寧酸標準圖譜

    圖2 樣品圖譜

    2.4 線性范圍

    將標準溶液逐級稀釋成0.5、2、5、10、15、20、30、50 μg/mL的濃度,以濃度(X)為橫坐標,峰面積(Y)為縱坐標,得回歸方程 Y=7 313.47X+7 075.82,R2=0.999 5,顯示在0.5~50 μg/mL濃度范圍內線性關系良好。

    2.5 檢出限定量限

    分別以S/N=3和S/N=10確定檢出限和定量限。配合飼料、濃縮飼料的檢出限為0.2 mg/kg,定量限為0.5 mg/kg。預混料的檢出限為0.5 mg/kg,定量限為1.0 mg/kg。

    2.6 準確度與精密度

    以陰性飼料樣品作為空白樣品,進行50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg 3種水平的加標回收試驗,平均回收率為99.7%,單寧酸的相對標準偏差(RSD)為0.7%~1.2%,符合方法學要求,說明該方法精密度好,準確可靠。

    3 結語

    建立了飼料中單寧酸測定的高效液相色譜法,本方法具有操作簡單、快速、準確,儀器設備要求不高,適合飼料企業(yè)質量控制使用。

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