D3胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分對(duì)單囊胚凍融移植周期臨床結(jié)局的影響

方璐，黃亞，徐杰，祁秀娟

(上海永遠(yuǎn)幸婦科醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，上海 200131)

輔助生殖技術(shù)(ART)發(fā)展40年來，隨著臨床促排卵方案的優(yōu)化和胚胎培養(yǎng)技術(shù)的提高，囊胚的移植成功率顯著升高，但在 IVF-ET治療過程中僅有50%～60%的胚胎被利用，這是由于一些D3胚胎因?yàn)榕咛ピu(píng)分低而被丟棄[1]。臨床常常面臨患者因無法獲得優(yōu)質(zhì)D3胚胎而導(dǎo)致ART治療失敗的困擾。因此，如何合理利用已獲胚胎，縮短治療時(shí)間、提高累計(jì)妊娠率是生殖醫(yī)生共同關(guān)注的問題。有研究發(fā)現(xiàn)，將非優(yōu)質(zhì)D3胚胎在體外進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，玻璃化冷凍復(fù)蘇后再進(jìn)行移植，盡管囊胚形成率較低，但仍有成功分娩健康嬰兒的病例報(bào)道[2-3]。Stecher等[4]通過延時(shí)成像觀察到一些質(zhì)量較差的D3胚胎在培養(yǎng)成囊胚后移植可獲得活產(chǎn)分娩。以上研究表明，即使評(píng)分低的D3胚胎在囊胚培養(yǎng)過程中仍有可能表現(xiàn)出較好的發(fā)育潛能。

本研究回顧性分析了2017年4月至2020年1月在本院生殖中心行凍融單囊胚移植的699個(gè)周期的臨床資料，探討不同評(píng)分的D3胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)后再行單囊胚凍融胚胎移植的妊娠結(jié)局，旨在為胚胎培養(yǎng)和單囊胚胎移植提供臨床依據(jù)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

回顧性分析2017年4月至2020年1月在本院生殖中心行凍融單囊胚移植患者的臨床資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：18 kg/m2≤體質(zhì)量指數(shù)(BMI)≤30 kg/m2，行凍融單囊胚移植的患者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：≥45歲；合并子宮畸形、嚴(yán)重子宮腺肌癥或者伴有其它子宮器質(zhì)性病變。

本研究共納入699個(gè)移植周期。根據(jù)不同囊胚來源的D3胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分分為兩組：D3胚胎為非優(yōu)質(zhì)胚胎者(D3非優(yōu)胚組，n=492)；D3胚胎為優(yōu)質(zhì)胚胎者(D3優(yōu)胚組，n=207)。

二、研究方法

1.促排卵方案：根據(jù)女方年齡和卵巢儲(chǔ)備功能選擇適當(dāng)?shù)拇倥怕逊桨?，包括微刺激促排卵方案、高孕激素狀態(tài)下促排卵方案(PPOS)、拮抗劑方案等。于扳機(jī)后35～37 h經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下穿刺取卵。授精方式以手術(shù)當(dāng)天男方精液情況決定。

2.囊胚培養(yǎng)及評(píng)分：應(yīng)用卵裂胚胎培養(yǎng)液(Sage，美國)和囊胚培養(yǎng)液(Kitazato，日本)進(jìn)行序貫培養(yǎng)，將D3胚胎轉(zhuǎn)移至囊胚培養(yǎng)，繼續(xù)培養(yǎng)觀察至第5、6、7天。

根據(jù)D3胚胎形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)[5]進(jìn)行評(píng)分，分為Ⅰ級(jí)(7～9個(gè)細(xì)胞，卵裂球大小均勻，碎片<10%，無空泡)、Ⅱ級(jí)(6～10個(gè)細(xì)胞，卵裂球大小基本均勻，碎片10%～20%，無空泡)、Ⅲ級(jí)(>4個(gè)細(xì)胞，卵裂球大小不均勻或有少量空泡，碎片為20%～50%)和Ⅳ級(jí)(<4個(gè)細(xì)胞，卵裂球明顯不均勻，有大量空泡，碎片>50%)。其中D3發(fā)育到6～10個(gè)細(xì)胞的Ⅰ、Ⅱ級(jí)胚胎定義為優(yōu)質(zhì)胚胎，D3發(fā)育為2～10個(gè)細(xì)胞的Ⅲ、Ⅳ級(jí)和>10個(gè)細(xì)胞Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級(jí)胚胎定義為非優(yōu)胚胎。

囊胚評(píng)分采用Gardner評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[6]，其中AA、AB、BA囊胚為優(yōu)質(zhì)囊胚；D5囊胚或D6囊胚直徑≥16 mm或D7囊胚直徑≥18 mm視為可凍存的囊胚。所有囊胚移植前均進(jìn)行激光輔助孵化。

3.囊胚玻璃化冷凍和解凍：將囊胚放入玻璃化冷凍試劑盒(VTl01，Kitazato，日本)的平衡液(ES)中平衡8～15 min，然后將平衡后的囊胚移入玻璃化冷凍液(VS)中放置60～90 s，隨后將囊胚迅速裝入冷凍載桿放入液氮中。囊胚解凍時(shí)，將載桿上的胚胎轉(zhuǎn)移到玻璃化解凍試劑盒(VTl02，Kitazato，日本)的解凍液(TS)中，37℃放置1 min，然后轉(zhuǎn)移到稀釋液(DS)中，25℃放置3 min，再轉(zhuǎn)移到清洗液(WS)中放置5 min，清洗2次，最后將胚胎在培養(yǎng)基(Art-1029，Sage，美國)中清洗2次，立即用倒置顯微鏡(IX-73，Olympus，日本)觀察胚胎解凍3 h后的擴(kuò)張情況。

4.內(nèi)膜準(zhǔn)備方案：對(duì)于月經(jīng)規(guī)律的患者采用自然周期準(zhǔn)備內(nèi)膜，排卵前注射HCG(珠海麗珠醫(yī)藥)5 000 U，監(jiān)測到排卵后口服地屈孕酮片(達(dá)芙通，蘇威制藥，荷蘭)10 mg，3次/d，5 d后進(jìn)行囊胚移植。對(duì)于無規(guī)律月經(jīng)周期的患者采用激素替代周期準(zhǔn)備內(nèi)膜，月經(jīng)第3天開始，口服雌二醇地屈孕酮片(芬嗎通，蘇威制藥，荷蘭)紅片4 mg，2次/d，連續(xù)服用10 d，根據(jù)患者的內(nèi)膜情況調(diào)整用藥劑量，當(dāng)子宮內(nèi)膜厚度≥8 mm時(shí)，改為口服芬嗎通(蘇威制藥，荷蘭)黃片4 mg，2次/d，同時(shí)陰道給藥黃體酮軟膠囊(安琪坦，Besins Manufacturing，比利時(shí))200 mg，2次/d，連續(xù)服用10 d。黃體支持第6天在陰道超聲引導(dǎo)下行胚胎移植，每周期移植1枚復(fù)蘇囊胚，移植后繼續(xù)黃體支持。

5.妊娠結(jié)局判定：囊胚移植后10 d檢測血β-HCG，β-HCG≥25 U/L為HCG陽性；移植后28 d行陰道超聲檢查，子宮腔內(nèi)可見孕囊為臨床妊娠；妊娠≥28周的活產(chǎn)嬰兒定義為活產(chǎn)。

6.觀察指標(biāo)：比較兩組患者的活產(chǎn)率、HCG陽性率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率?；町a(chǎn)率=活產(chǎn)分娩周期數(shù)/移植周期總數(shù)×100%；HCG陽性率=HCG陽性周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；流產(chǎn)率=流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者一般資料比較

本研究共納入699個(gè)單囊胚凍融移植周期，根據(jù)囊胚來源的D3胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分分為D3非優(yōu)胚組(n=492)和D3優(yōu)胚組(n=207)。兩組間平均年齡、BMI、不孕類型、促排卵方案、受精方式和子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方法比較均無顯著差異(P>0.05)；D3優(yōu)胚組的D5、D7囊胚形成與D3非優(yōu)胚組比較均無顯著差異(P>0.05)，而D3優(yōu)胚組的D6囊胚形成顯著低于D3非優(yōu)胚組(P<0.05)(表1)。

表1 患者一般情況比較[(-±s)，n(%)]

二、D3優(yōu)胚組和非優(yōu)胚組來源囊胚的囊胚移植妊娠結(jié)局比較

D3優(yōu)胚組來源囊胚的優(yōu)質(zhì)囊胚率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率均顯著高于D3非優(yōu)胚組來源囊胚(P<0.05)，兩組間HCG陽性率和流產(chǎn)率比較均無顯著差異(P>0.05)(表2)。

表2 D3優(yōu)胚組和非優(yōu)胚組來源囊胚的凍融移植結(jié)局比較(%)

三、不同囊胚形成時(shí)間組中來源于D3優(yōu)胚組和非優(yōu)胚組的囊胚移植妊娠結(jié)局比較

根據(jù)不同囊胚形成時(shí)間分為3個(gè)亞組：D5囊胚組、D6囊胚組和D7囊胚組，比較各亞組中來源于D3優(yōu)胚組和非優(yōu)胚組的囊胚移植妊娠結(jié)局。

D5囊胚組的HCG陽性率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率均顯著高于D6囊胚組和D7囊胚組(P<0.05)；D5囊胚組、D6囊胚組和D7囊胚組中來源于D3優(yōu)胚組的囊胚移植活產(chǎn)率均高于來源于D3非優(yōu)胚組的囊胚，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；D6、D7囊胚組中來源于D3非優(yōu)胚組的囊胚移植流產(chǎn)率均顯著高于來源于D3優(yōu)胚組囊胚(P<0.05)(表3)。

表3 不同形成囊胚時(shí)間優(yōu)胚組和非優(yōu)胚組的妊娠結(jié)局比較[n(%)]

四、不同年齡段來源于D3優(yōu)胚組和非優(yōu)胚組的單囊胚移植妊娠結(jié)局比較

根據(jù)患者不同年齡分為3個(gè)年齡段：<35歲組、35～40歲組和≥40歲組，比較不同年齡段中來源于D3優(yōu)胚組和非優(yōu)胚組的囊胚移植妊娠結(jié)局。

與≥40歲組比較，<35歲組和35～39歲組HCG陽性率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率均顯著升高(P<0.05)；相同年齡段患者中，來源于D3優(yōu)胚組的囊胚活產(chǎn)率均高于來源于D3非優(yōu)胚組囊胚，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表4)。

表4 不同年齡段中來源于D3優(yōu)胚組和非優(yōu)胚組的囊胚移植妊娠結(jié)局比較[n(%)]

討 論

胚胎質(zhì)量是ART成功的關(guān)鍵因素。優(yōu)先移植優(yōu)質(zhì)的胚胎可以提高妊娠率和活產(chǎn)率，減少流產(chǎn)率和產(chǎn)前并發(fā)癥、縮短治療時(shí)間。但是，對(duì)于沒有優(yōu)質(zhì)D3胚胎的患者，是否選擇評(píng)分差的D3胚胎來源的囊胚進(jìn)行移植以縮短IVF治療周期是困擾生殖醫(yī)生的難題。

囊胚質(zhì)量與卵裂期胚胎的質(zhì)量高度相關(guān)。優(yōu)質(zhì)的卵裂期胚胎可以形成數(shù)量更多、質(zhì)量更好、發(fā)育更快的囊胚，移植后的臨床妊娠率和活產(chǎn)率更高。本研究發(fā)現(xiàn)，D3優(yōu)胚組的優(yōu)質(zhì)囊胚率以及所形成囊胚移植后的臨床妊娠率、活產(chǎn)率均顯著高于D3非優(yōu)胚組(P<0.05)，本研究結(jié)果與黃柳靜等[7]研究結(jié)果一致。但也有研究者提出，囊胚形成率與D3胚胎的質(zhì)量相關(guān)，而所形成的囊胚質(zhì)量與D3胚胎質(zhì)量無關(guān)。據(jù)研究推測，在D3胚胎向囊胚發(fā)育的過程中，隨著胚胎基因組的激活，基因和代謝缺陷的胚胎將被自然淘汰，一部分胚胎似乎可以自我修復(fù)并最終發(fā)育成囊胚[1，8]。在本研究中，來源于D3非優(yōu)胚組的胚胎仍有25.81%最終形成優(yōu)質(zhì)囊胚，盡管所形成囊胚的凍融移植活產(chǎn)率低于來源于D3優(yōu)胚組所形成的囊胚，但移植后活產(chǎn)率仍可達(dá)到33.13%，這可能與胚胎的自我修復(fù)功能有關(guān)。

目前，大多數(shù)胚胎實(shí)驗(yàn)室采用卵裂期胚胎評(píng)分，通過靜態(tài)的胚胎形態(tài)學(xué)觀察對(duì)胚胎的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估[9]。分裂對(duì)稱、碎片率低(<10%)、大小均勻、單核、具有均勻透明細(xì)胞質(zhì)的胚胎常被評(píng)為卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎[10]。形態(tài)學(xué)觀察操作簡便、評(píng)估效率高，因此，受到臨床醫(yī)生的推崇。但是，該方法受評(píng)估者主觀經(jīng)驗(yàn)影響較大，而且只能反映出某些特定時(shí)間點(diǎn)的胚胎狀態(tài)，不能準(zhǔn)確評(píng)估胚胎的發(fā)育潛能[11]。有研究表明，評(píng)分差的卵裂期胚胎可以在體外培養(yǎng)到囊胚階段，然后玻璃化冷凍復(fù)蘇后進(jìn)行移植，仍有可能成功分娩健康的嬰兒[2]。黃柳靜等[7]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)評(píng)分差的D3胚胎進(jìn)行囊胚培養(yǎng)后移植的活產(chǎn)率可達(dá)26.7%。本研究發(fā)現(xiàn)，來源于非優(yōu)胚組的囊胚凍融移植活產(chǎn)率為33.13%。因此，對(duì)于沒有優(yōu)質(zhì)D3胚胎的患者，可進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，增加體外培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)而挑選出發(fā)育潛能較好的胚胎，再進(jìn)行囊胚移植仍可獲得較好的臨床結(jié)局，可以最大限度地利用胚胎[6，12]。但是，也有研究發(fā)現(xiàn)，非優(yōu)質(zhì)卵裂胚所形成的囊胚移植后流產(chǎn)率顯著高于優(yōu)質(zhì)卵裂胚[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，來源于D3優(yōu)胚組和非優(yōu)胚組的囊胚凍融移植后的流產(chǎn)率比較并無顯著差異，且流產(chǎn)率均低于20%。確切的機(jī)制不明，也可能與實(shí)驗(yàn)室采用的胚胎培養(yǎng)體系相關(guān)。

囊胚發(fā)育速度是影響ART妊娠結(jié)局的一個(gè)重要因素。D5與D6囊胚移植后臨床妊娠結(jié)局是否有顯著差異目前仍存在爭議。有研究報(bào)道，在鮮胚移植周期中，D5囊胚移植的臨床妊娠率高于D6囊胚，但是，在復(fù)蘇周期中D5、D6囊胚移植后的臨床妊娠率比較并無顯著差異[14-15]，這可能與新鮮周期中D6囊胚與子宮內(nèi)膜發(fā)育不同步有關(guān)。大多數(shù)研究顯示，D5囊胚的復(fù)蘇率、種植率及活產(chǎn)率均顯著高于D6囊胚[16-18]；在行囊胚培養(yǎng)的D3胚評(píng)分相同的情況下，所形成的D5囊胚移植后的活產(chǎn)率仍高于D6囊胚[19]。本研究顯示，在凍融單囊胚移植周期中，D5囊胚組的HCG陽性率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率均顯著高于D6囊胚組和D7囊胚組(P<0.05)。由于大多數(shù)研究中移植的囊胚未進(jìn)行胚胎移植前遺傳學(xué)篩查(Pre-implantation Genetic Screening，PGS)，發(fā)育緩慢的囊胚有較高的染色體異常發(fā)生率，所以D6囊胚組非整倍體的發(fā)生率可能高于D5囊胚組[20]，從而增加了D6囊胚組早期流產(chǎn)率。Hashimoto等[21]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)育較遲緩的D6囊胚會(huì)增加異常紡錘體的發(fā)生率，并降低玻璃化冷凍后胚胎的種植率；D5囊胚移植結(jié)局優(yōu)于D6囊胚的內(nèi)在原因之一，可能是D5囊胚細(xì)胞DNA對(duì)于冷凍過程的抵抗力更強(qiáng)。然而，一項(xiàng)Meta分析發(fā)現(xiàn)，移植玻璃化冷凍復(fù)蘇胚胎的妊娠結(jié)局很大程度上取決于子宮內(nèi)膜的同步性，若D5和D6囊胚具有相近的囊胚評(píng)分，則凍融單囊胚移植能獲得相似的妊娠結(jié)局[22]。Yang等[23]的研究結(jié)果也支持這一結(jié)論。

年齡是影響ART妊娠結(jié)局的另一個(gè)獨(dú)立因素。本研究發(fā)現(xiàn)，無論在所移植的囊胚是來源于D3非優(yōu)胚組還是D3優(yōu)胚組，年齡<35歲組的臨床妊娠率和活產(chǎn)率最高，其次是35～39歲組，年齡≥40歲組最低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與既往研究報(bào)道[24]一致。而且，在相同年齡段中，來源于D3非優(yōu)胚組和優(yōu)胚組的囊胚移植活產(chǎn)率比較并無顯著差異(P>0.05)。年齡是影響活產(chǎn)率的獨(dú)立因素[25]，隨著患者年齡的增加，胚胎的非整倍體率增加10%[26]，這也是高齡(≥40歲)患者IVF周期胚胎種植失敗和流產(chǎn)的主要原因。

在大多數(shù)生殖中心中，常常選擇D5或D6囊胚進(jìn)行移植或冷凍，而對(duì)于發(fā)育緩慢者如D7囊胚給予丟棄處理。因?yàn)镈7囊胚形成率低，而且冷凍過程將進(jìn)一步損傷囊胚細(xì)胞，增加DNA碎片、促進(jìn)凋亡基因轉(zhuǎn)錄，從而降低了冷凍囊胚發(fā)育潛能[27]。因此，對(duì)于D7囊胚的冷凍價(jià)值仍然存在爭議。有研究發(fā)現(xiàn)，D7囊胚移植后的臨床妊娠率為6.2%～42.9%[28]。本研究中，D7囊胚的臨床妊娠率達(dá)到32.26%，活產(chǎn)率達(dá)到22.58%，即使來源于D3非優(yōu)胚組的D7囊胚活產(chǎn)率也可達(dá)20.00%。需要強(qiáng)調(diào)的是，本中心對(duì)D7形成的囊胚直徑≥18 mm才予以冷凍保存，對(duì)于未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的囊胚仍然給予丟棄處理，從而提高了D7囊胚移植的臨床妊娠率[29]。盡管D7囊胚僅占可用囊胚的5%，但是通過延長培養(yǎng)時(shí)間可以增加可用囊胚的數(shù)量，提高每個(gè)周期的可用胚胎數(shù)，從而提高取卵周期的累計(jì)妊娠率，特別是對(duì)于無優(yōu)質(zhì)D3胚胎的患者，進(jìn)行囊胚培養(yǎng)后仍可獲得一定的活產(chǎn)率[30]。但是，由于本研究中D7囊胚樣本量較少，可能影響統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果，后期需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，建議優(yōu)先選用來源于優(yōu)質(zhì)D3胚胎的囊胚進(jìn)行移植；對(duì)于評(píng)分差的D3胚胎延長培養(yǎng)至囊胚后，優(yōu)先選擇發(fā)育快的囊胚進(jìn)行移植仍可獲得良好的妊娠結(jié)局；對(duì)于D7囊胚仍有22.58%的活產(chǎn)率。因此，對(duì)于評(píng)分差的D3胚胎可培養(yǎng)至囊胚后再行凍融胚胎移植，不應(yīng)當(dāng)輕易丟棄D7囊胚，如此可以提高取卵周期的累計(jì)妊娠率和胚胎利用率，縮短患者獲得臨床妊娠的時(shí)間，減少患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和心理負(fù)擔(dān)。