痔斷根片治療痔瘡的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究及對結(jié)腸黏膜組織AQP1表達(dá)的影響

趙 平，黃 華，丁旭楓，衛(wèi) 軍，蔣 捷，季利江

痔瘡是肛腸科常見病和多發(fā)病，發(fā)病率約占肛腸疾病50%[1-2]。由于不規(guī)律的生活作息、不良的飲食習(xí)慣，痔瘡發(fā)病率逐年上增，嚴(yán)重地影響著人們的健康和生活質(zhì)量[3]。

痔斷根片是常熟市中醫(yī)醫(yī)院多年治療痔瘡的經(jīng)驗(yàn)用藥，治療風(fēng)傷腸絡(luò)、濕熱下注證痔病，能夠極大改善內(nèi)痔患者癥狀，起到促進(jìn)止血、緩解疼痛、促進(jìn)痔黏膜修復(fù)等作用，對內(nèi)痔治療效果尤其顯著[4]。前期研究表明，痔斷根片相較于地奧司明片內(nèi)痔患者出血、疼痛、墜脹感的臨床癥狀明顯減少，且能顯著減少患者痔核脫出、減小痔核體積[4-5]。已有研究表明，痔斷根片對痔瘡治療有顯著的臨床效果，但其相關(guān)的藥效學(xué)研究仍未有報(bào)道，阻礙了痔斷根片的進(jìn)一步推廣及應(yīng)用。本研究通過各病理模型小鼠探究了痔斷根片在抗炎、鎮(zhèn)痛、止血和促進(jìn)腸蠕動(dòng)的作用，總結(jié)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 阿司匹林腸溶片，購自拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號(hào)：BJ27286；洛派丁胺鹽酸鹽，Sigma?aldrich公司，貨號(hào)：L4752；乳果糖口服溶液（杜密克），購自Abbott Biologicals B.V.(荷蘭)；二甲苯，購自南京化學(xué)試劑廠，批號(hào)：010920；乙酸，購自南京化學(xué)試劑股份有限公司，批號(hào)：150923844E；SPF 級(jí) ICR 小鼠共240只，體質(zhì)重18~22 g，雌雄各半，購自揚(yáng)州大學(xué)，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2017?0001，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：NO.201807019；小鼠飼養(yǎng)于清潔動(dòng)物實(shí)驗(yàn)房，采用架式籠養(yǎng)，環(huán)境溫度24~26 ℃，相對濕度50%~60%；紫外分光光度計(jì)，購自上海儀器科技有限公司，型號(hào)：UV?1100；電子天平，購自德國賽多利斯集團(tuán)，型號(hào):BSA124S?CW;實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，購自美國Bio?rad，型號(hào)：CFX96。

1.2 方法

1.2.1 痔斷根片制備 痔斷根片混懸液：南京中醫(yī)藥大學(xué)常熟附屬醫(yī)院肛腸科制備，采用的藥材均從先聲再康江蘇藥業(yè)有限公司（南京學(xué)衡路藥店）購買。取黃連45 g，黃芩45 g，當(dāng)歸45 g，地榆炭 45 g，火麻仁75 g，生地75 g，防風(fēng) 45 g，龜板15 g，珍珠粉 20 g，加入10倍量水，煎煮1 h后過濾，并濃縮濾液小于500 mL；再加入經(jīng)粉碎并過200目篩的荊芥炭4 500 g，生大黃45 g，槐米炭75 g，制得濃度為0.72 g生藥/mL的痔斷根片混懸液，分裝?20 ℃保存，待用。

1.2.2 抗炎實(shí)驗(yàn) 取ICR小鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)平均分為5 組，分組與處理如下：①模型對照組：生理鹽水20 mL/kg；②陽性對照組:阿司匹林0.05 g/kg；③痔斷根片低劑量組：1.8 g 生藥/kg；④痔斷根片中劑量組：3.6 g生藥/kg；⑤痔斷根片高劑量組：7.2 g生藥/kg。各組小鼠每天用藥物灌胃1次，連續(xù)3 d。末次給藥1 h 后，在小鼠右耳兩側(cè)涂抹0.10 mL 二甲苯。涂藥1 h后，處死小鼠并切斷左右耳。用打孔器在兩耳同一部位取出圓狀耳片，再用電子天平計(jì)算兩個(gè)耳片的重量，比較各組耳殼腫脹程度（右耳片重量－左耳片重量），計(jì)算各組小鼠腫脹抑制率：腫脹抑制百分率（%）=（給藥組小鼠耳殼腫脹度/模型對照組小鼠耳殼腫脹度）×100%。

1.2.3 鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn) 取ICR 小鼠50 只隨機(jī)分為5 組，分組與處理同1.2.2。各組末次給藥1 h后，用0.5%乙酸注射入腹腔。30 min后，觀察各組小鼠出現(xiàn)扭體反應(yīng)的數(shù)量以及次數(shù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死。

1.2.4 促排便實(shí)驗(yàn) 取ICR小鼠60只，雌雄各半，隨機(jī)平均分為6組，分組與處理如下：①空白對照組：生理鹽水10 mL/kg；②模型對照組：生理鹽水10 mL/kg；③陽性對照組：乳果糖口服溶液，5.0 mL/kg；④痔斷根片低劑量組：1.8 g生藥/kg；⑤痔斷根片中劑量組：3.6 g生藥/kg；⑥痔斷根片高劑量組：7.2 g生藥/kg。除陽性對照組外，各組每日灌胃給藥1次，連續(xù)3 d，陽性對照組于洛派丁胺給藥1 h前給予乳果糖口服溶液。末次給藥1 h后，空白對照組灌胃給予冷開水10 mL/kg，其余組灌胃給與洛派丁胺5 mg/kg（0.05%CMC?Na 配制，0.5 mg/kg）構(gòu)建小鼠便秘模型，同時(shí)所有組別給與0.1 mL印度墨汁，觀察首粒黑便時(shí)間及5 h內(nèi)的黑便數(shù)目。另外在造模給藥前，收集各組新鮮糞便2~5粒，測定糞便含水量。含水量計(jì)算公式：含水量=（濕糞—干糞）/濕糞×100%

1.2.5 qRT?PCR 檢測結(jié)腸黏膜組織水通道蛋白1（aquaporin1，AQP1）mRNA 表達(dá) 將用于促排便實(shí)驗(yàn)的各組小鼠脫頸處死。取結(jié)腸黏膜組織約100 mg，加入裂解液，并用勻漿機(jī)破碎，提取總RNA。以 β?actin 作為內(nèi)標(biāo)，采用 qRT?PCR 檢測AQP1 在結(jié)腸黏膜組織中的表達(dá)水平。引物AQP1正義鏈為 5′?GGAGATGAAGCCCAAATAGAG?3′，反義鏈為 5′?GCTCTGAGACCAGGAAACAGA?3′;β-actin 正義鏈 5′?GGGACCTGACTGACTACCTC?3′，反義鏈 5′?TCATACTCCTGCTTGCTGAT?3′。

1.2.6 止血、凝血實(shí)驗(yàn) 取ICR 小鼠40 只，雌雄各半，隨機(jī)平均分為4 組，分組與處理如下：①空白對照組：生理鹽水20 mL/kg；②痔斷根片低劑量組：1.8 g 生藥/kg；③痔斷根片中劑量組：3.6 g 生藥/kg；④痔斷根片高劑量組：7.2 g 生藥/kg。各組小鼠每天用藥物灌胃1 次，連續(xù)3 d。末次給藥1 h 后，將小鼠尾尖切下約3 mm，計(jì)算出血時(shí)間。每隔3 s 用濾紙輕輕觸碰傷口，直到傷口沒有血液滲出的時(shí)間為小鼠出血時(shí)間。取ICR 小鼠40 只，雌雄各半，隨機(jī)平均分為4 組，分組和給藥方式同上，末次給藥后，采用眼科鑷取血，取第2 滴血置于干凈的玻璃片上，隔3 s觀察血滴是否有血絲，觀察到有血絲出現(xiàn)的時(shí)間作為凝血時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 21.0 軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 痔斷根片對小鼠耳腫脹的影響 痔斷根片高、中、低劑量組的耳廓腫脹程度比模型對照組顯著減輕（P<0.05或P<0.01）；腫脹抑制率隨著痔斷根片用藥量的增加而增加，低、中劑量組的腫脹抑制率比陽性對照組低，但差異不顯著；痔斷根片大劑量對小鼠耳廓腫脹的抑制程度優(yōu)于阿司匹林。

2.2 痔斷根片對小鼠疼痛的影響 與表1模型對照組相比，由乙酸引起的小鼠扭體反應(yīng)在痔斷根片高、中劑量組顯著減少（P<0.05 或P<0.01）；與陽性對照組比較，痔斷根片高劑量組小鼠的扭體反應(yīng)次數(shù)也能明顯降低（P<0.05），表明痔斷根片可以減輕乙酸引起的小鼠疼痛反應(yīng)，有一定的鎮(zhèn)痛效果，表2。

表1 痔斷根片對小鼠耳腫脹的影響()

表1 痔斷根片對小鼠耳腫脹的影響()

與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與陽性對照組比較，#P<0.05

組別 耳殼重量（mg）左18.4±0.8 18.5±0.7 18.6±0.9 18.5±0.8 17.9±0.8右模型對照組陽性對照組痔斷根片低劑量組痔斷根片中劑量組痔斷根片高劑量組35.0±4.9 31.6±1.4 35.6±1.1 34.8±1.3 27.8±2.6腫脹程度（mg）16.6±5.0 13.2±1.5*17.0±1.4*16.3±1.1*9.9±2.3**，#腫脹抑制率（%）...29.7 8.9 13.0 47.2

表2 痔斷根片對小鼠疼痛的影響()

表2 痔斷根片對小鼠疼痛的影響()

與模型對照組比較*P<0.05，**P<0.01；與陽性對照組比較#P<0.05

抑制率（%）...26.8 8.56 14.6 43.7組別模型對照組陽性對照組痔斷根片低劑量組痔斷根片中劑量組痔斷根片高劑量組無扭體反應(yīng)動(dòng)物數(shù)（只）0 1 0 0 2給藥后15 min內(nèi)扭體反應(yīng)次數(shù)32.2±6.5 23.6±5.7**29.4±5.0 27.5±5.3*18.1±5.1**，#

2.3 痔斷根片對便秘小鼠排便時(shí)間和糞便含水量的影響 模型對照組小鼠首粒黑便的出現(xiàn)時(shí)間比空白對照組明顯延長（P<0.01），5 h 內(nèi)的黑便粒數(shù)與糞便含水量明顯降低（P<0.01），表明洛派丁胺引起小鼠便秘。與模型對照組比較，陽性對照組、痔斷根片高劑量組可以顯著縮短首粒黑便出現(xiàn)的時(shí)間（P<0.05 或P<0.01），增加 5h 內(nèi)黑便粒數(shù)和糞便含水量（P<0.05或P<0.01），提示痔斷根片有一定程度的通便、潤腸作用，且高劑量痔斷根片效果優(yōu)于乳果糖口服溶液，表3。

表3 痔斷根片對首粒黑便時(shí)間、5 h內(nèi)黑便粒數(shù)和糞便含水量的影響()

表3 痔斷根片對首粒黑便時(shí)間、5 h內(nèi)黑便粒數(shù)和糞便含水量的影響()

與空白對照組比較，##P<0.05；與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別空白對照組模型對照組陽性對照組痔斷根片低劑量組痔斷根片中劑量組痔斷根片高劑量組首粒黑便時(shí)間（min）130.0±33.8 268.2±60.1##223.7±41.8*264.4±59.9 243.6±41.7 183.2±44.1**5 h黑便粒數(shù)12.5±3.1 2.0±0.9##5.7±1.8**2.1±0.9 3.4±0.84*7.9±2.0**糞便含水量53.9±2.6 30.5±1.3##54.5±2.0**46.6±3.5 56.9±4.4 59.3±2.7**

2.4 痔斷根片對結(jié)腸黏膜組織AQP1 mRNA 表達(dá)的影響 與空白對照組比較，模型對照組小鼠結(jié)腸黏膜組織AQP4 mRNA 表達(dá)顯著升高（P<0.01），表明洛派丁胺可以通過調(diào)控AQP1 表達(dá)引起小鼠便秘。與模型對照組比較，陽性對照組、痔斷根片低劑量組、痔斷根片中劑量組和痔斷根片高劑量組均可下調(diào)AQP1 表達(dá)（P<0.05 或P<0.01），且高劑量痔斷根片調(diào)控AQP1的效果優(yōu)于乳果糖口服溶液，表4。

表4 痔斷根片對結(jié)腸黏膜組織AQP1 mRNA表達(dá)的影響()

表4 痔斷根片對結(jié)腸黏膜組織AQP1 mRNA表達(dá)的影響()

與空白對照組比較，##P<0.05；與模型對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

組別空白對照組模型對照組陽性對照組痔斷根片低劑量組痔斷根片中劑量組痔斷根片高劑量組AQP4 mRNA相對表達(dá)量1.00±0.06 12.20±0.05##1.91±0.06**8.35±0.07*5.76±0.09*1.24±0.05**

2.5 痔斷根片對止血及凝血時(shí)間的影響 連續(xù)3 d給予小鼠不同劑量痔斷根片后，與空白對照組比較，痔斷根片高、中劑量組的小鼠止血時(shí)間和凝血時(shí)間明顯縮短（P<0.05），提示痔斷根片有一定的止血作用，表5。

表5 痔斷根片對小鼠止血時(shí)間及凝血時(shí)間的影響()

與空白對照組比較，*P<0.05

組別空白對照組痔斷根片低劑量組痔斷根片中劑量組痔斷根片高劑量組止血時(shí)間（s）294.5±30.6 286.7±46.1 270.9±33.3*252.2±37.6*凝血時(shí)間（s）145.3±22.8 146.0±21.2 130.6±17.7*111.2±21.8*

3 討論

痔瘡是一類多發(fā)病，嚴(yán)重地影響著人們的健康和生活質(zhì)量[6-7]。痔瘡多為飲食不節(jié)，起居失慎，濕熱內(nèi)生，蘊(yùn)結(jié)腸道，下注肛門或風(fēng)傷腸洛，熱迫血下致[8]。中醫(yī)藥治療疾病的特點(diǎn)就是運(yùn)用辨證論治，從多方面多角度改善患者的癥狀和體征，符合痔瘡疾病發(fā)病原因和治療原理[9]。

南京中醫(yī)藥大學(xué)常熟附屬醫(yī)院肛腸科在臨床治療內(nèi)痔常用的中藥制劑基礎(chǔ)上，研制出了痔斷根片，旨在尋找到一種穩(wěn)定、易用、有效、安全的促進(jìn)肛瘺創(chuàng)面愈合的有效制劑，并在臨床推廣應(yīng)用。痔痔斷根片充分利用了藥物功能的適當(dāng)兼容性，能達(dá)到顯著的治愈效果[4-5]。痔斷根片由槐米炭、當(dāng)歸、黃連、生地、黃芩、大黃、火麻仁等十余味中藥組成，經(jīng)煎煮濃縮,烘干后研末,壓制成片?；泵滋克幮躁幒两?，善止痔血，配合黃連、生地、黃芩等能入血從而起到止血作用[4，10-11]。當(dāng)歸和火麻仁可以起到潤滑腸道、促進(jìn)排便的作用，大黃素用于濕熱導(dǎo)致的便秘癥狀，3 類藥合理配伍讓痔斷根片的效果十分突出[12-14]。將大便軟化、促進(jìn)排便通暢，是治療痔瘡的重要手段[15]，而痔斷根片恰能軟化大便，使痔瘡患者的癥狀有效消減。

本研究采用了小鼠各類病理模型，證實(shí)了痔斷根片的抗炎、鎮(zhèn)痛、止血及通便潤腸功效，與先前報(bào)道的痔斷根片治療痔瘡的治療臨床療效取得一致[4]。基于各類小鼠模型，本研究發(fā)現(xiàn)高劑量痔斷根片的抗炎鎮(zhèn)痛效果優(yōu)于阿司匹林、潤腸通便作用優(yōu)于乳果糖。近年研究發(fā)現(xiàn)水通道蛋白異常表達(dá)與便秘存在顯著相關(guān)性，而便秘極易引起痔瘡反復(fù)發(fā)作[16]。結(jié)腸黏膜組織中AQP1表達(dá)量升高往往導(dǎo)致黏膜吸收水分過度，從而造成糞便含水量急劇下降，誘發(fā)便秘[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)痔斷根片可有效降低AQP1 表達(dá)，從而使糞便含水量升高達(dá)到促進(jìn)排便作用，在一定程度上保存腸道內(nèi)水分，這可能是痔斷根片在臨床應(yīng)用上有效改善痔核脫出的原因之一。痔斷根片能通過調(diào)控AQP1 表達(dá)量改善小鼠排便情況，這提示痔斷根片或許是便秘引起痔瘡反復(fù)發(fā)作的有效預(yù)防用藥。

本研究利用小鼠耳腫脹急性炎癥模型、乙酸刺激構(gòu)建的疼痛模型、洛派丁胺誘導(dǎo)的便秘模型、出血及凝血模型，充分研究了痔斷根片的藥效，實(shí)驗(yàn)表明痔斷根片具有抗炎、鎮(zhèn)痛、通便潤腸和止血功效，為痔斷根片的深入開發(fā)和臨床應(yīng)用提供了扎實(shí)的基礎(chǔ)。