蒼耳子治療過敏性鼻炎的分子機(jī)制研究

王 康，孟 泳，王玉潔，季紹威，鄧澤坤

過敏性鼻炎（Allergic rhinitis）又稱變應(yīng)性鼻炎，普遍認(rèn)為其是以IgE 介導(dǎo)的I 型變態(tài)反應(yīng)。臨床癥狀為陣發(fā)性噴嚏、清水樣涕、鼻塞、鼻癢等，嚴(yán)重影響患者的睡眠及生活質(zhì)量。據(jù)流行病學(xué)顯示，全球約有10%~40%的人口患有此病[1]。在我國(guó)，過敏性鼻炎患病率達(dá)10%以上，近幾年呈上升趨勢(shì)[2]。長(zhǎng)期的臨床觀察發(fā)現(xiàn)，過敏性鼻炎控制不當(dāng)，易誘發(fā)支氣管哮喘。

蒼耳子為菊科植物，性味辛、苦、溫，具有散風(fēng)寒、通鼻竅的功效，是治療鼻鼽的良藥，臨床應(yīng)用廣泛。在對(duì)治療鼻部疾病的常用方劑統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)[3]，含有蒼耳子的方劑占比約80%。經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)[4]，含蒼耳子正丁醇的滴鼻劑和蒼耳油對(duì)變應(yīng)性鼻炎有較好的治療作用，但其具體作用機(jī)制不明。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是中醫(yī)藥研究的新途徑，不但能揭示中藥對(duì)機(jī)體的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，也能為新藥的研發(fā)提供方向，節(jié)約成本[5]。為了更好地闡述蒼耳子治療疾病的分子機(jī)制，本研究將借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)此進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件 本研究所涉及的數(shù)據(jù)庫(kù)：中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP）（https://tcmspw.com/tcmsp.php），有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(kù)（PubChem）（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(kù)（online mendelian inheritance in man, OMIM）（https://omim.org/），基因組注釋數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)（GeneCards）（https://www.genecards.org/），基因與疾病關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫(kù)（DisGeNET）（https://www.disgenet.org/），全球蛋白資源數(shù)據(jù)庫(kù)（Uniprot）（https://www.uniprot.org/），蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)（String）（https://string?db.org/），蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（prorein data bank，PDB）（https://www.rcsb.org/），生物信息學(xué)開源軟件平臺(tái)（Bioconductor）（http://www.bioconductor.org/）。軟件：R 語(yǔ)言（V4.1.1）（https://www.r?project.org/），Cytoscape（V3.7.0）（https://cytoscape.org/），PyMOL（V2.1.1）（https://pymol.org/），iGemdock（V2.1）（http://gemdock.life.nctu.edu.tw），AutoDock Tools（V1.5.6）（http://autodock.scripps.edu/）。

1.2 中藥蒼耳子化學(xué)成分收集及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 借助TCMSP 平臺(tái)查找蒼耳子的化學(xué)成分，以口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%以及藥物相似性（drug?likeness，DL）≥0.18 為條件進(jìn)行篩選，獲取藥物的有效活性成分。繼續(xù)運(yùn)用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)查找其有效活性成分的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，借助Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行人類基因標(biāo)注并規(guī)范化處理。

1.3 過敏性鼻炎靶點(diǎn)篩選 以“Allergic rhinitis”為關(guān)鍵詞，分別在疾病數(shù)據(jù)庫(kù)OMIM、GeneCards和Dis-GeNET進(jìn)行檢索，對(duì)得到靶點(diǎn)進(jìn)行匯總及去重處理。

1.4 “成分?靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 借助Excel 2019 軟件對(duì)1.2和1.3得到的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，找出中藥與疾病的共同蛋白靶點(diǎn)，并將其導(dǎo)入Cytoscape 軟件平臺(tái)，構(gòu)建“成分?靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)由中藥的活性成分和中藥治療疾病的靶點(diǎn)兩部分構(gòu)成。兩者的相互關(guān)系以邊表示。

1.5 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將1.4 中找到的共同蛋白靶點(diǎn)導(dǎo)入在線數(shù)據(jù)庫(kù)String 中進(jìn)行分析，種屬選擇Homo sapien，將得到的蛋白相互作用關(guān)系數(shù)據(jù)（combined score≥0.4）進(jìn)行下載，將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 軟件進(jìn)行分析，按照度值大小選出藥物治療疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.6 GO 功能富集和KEGG 通路富集 運(yùn)用R 語(yǔ)言將1.4 中找到的共同蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論（gene ontology, GO）功能富集和（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路富集分析，得到蒼耳子治療過敏性鼻炎的主要功能富集和作用通路。

1.7 小分子優(yōu)化處理 對(duì)1.4 得到的主要活性成分通過PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)查找相應(yīng)的3D 結(jié)構(gòu)（或2D 結(jié)構(gòu)）并下載“SDF”格式文件，用Pymol軟件進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換。將1.5所得到的治療過敏性鼻炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)通過PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)查找蛋白晶體結(jié)構(gòu)，依據(jù)分辨率Resolution(A)、配體等條件進(jìn)行篩選，選出最佳蛋白晶體結(jié)構(gòu)并下載“PDB”格式文件。通過Pymol軟件對(duì)所得到的蛋白晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行除水、剔除雜質(zhì)等優(yōu)化處理。

1.8 分子對(duì)接 用AutoDock Tools 軟件對(duì)主要活性成分（配體）和優(yōu)化后的蛋白晶體結(jié)構(gòu)（受體）進(jìn)行分子對(duì)接前數(shù)據(jù)處理。受體進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷、添加原子類型等結(jié)構(gòu)處理并保存PDB 文件格式。配體進(jìn)行root 判定及扭轉(zhuǎn)鍵選擇等操作處理并保存PDB 格式。利用iGemdock 軟件對(duì)受體配體進(jìn)行匹配篩選，找出最佳受體與配體的匹配方式。將最佳匹配方式運(yùn)用AutoDock Tools軟件進(jìn)行分子對(duì)接。用Pymol軟件對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化展示。

2 結(jié)果

2.1 中藥化學(xué)成分收集及靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 以O(shè)B≥30%、DL≥0.18 為條件在TCMSP 進(jìn)行蒼耳子有效成分的查找與篩選，得到有效活性成分11 個(gè)，搜索到有對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的有效活性成分7 個(gè)（無(wú)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的有效成分已剔除），表1。

表1 蒼耳子有效活性成分

2.2“成分?靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)”建立 通過查詢疾病數(shù)據(jù)庫(kù)OMIM、Gene Cards和DisGeNET，得到過敏性鼻炎疾病相關(guān)基因1 575個(gè)。通過與蒼耳子蛋白基因進(jìn)行比對(duì)，得到蒼耳子治療過敏性鼻炎的潛在靶點(diǎn)15個(gè)，構(gòu)建“蒼耳子?過敏性鼻炎疾病靶點(diǎn)”數(shù)據(jù)庫(kù)。

2.3 “成分?靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將“蒼耳子?過敏性鼻炎疾病靶點(diǎn)”數(shù)據(jù)庫(kù)導(dǎo)入Cytoscape軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）。該網(wǎng)絡(luò)圖共有22個(gè)節(jié)點(diǎn)和26條邊，圖中紫色長(zhǎng)方形代表疾病，黃色橢圓形代表藥物，粉色八邊形代表潛在靶點(diǎn)，藍(lán)色六邊形代表有效成分。

圖1 蒼耳子的有效成分?靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

經(jīng)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析后，將蒼耳子的7 種有效成分按照度值大小排序，排名前4的有效成分為beta?sitosterol（β 谷甾醇）、stigmasterol（豆甾醇）、aloe?emodin（蘆薈大黃素）、(2R,3R)?3?(4?hydroxy?3?methoxy?phenyl)?5?methoxy?2?methylol?2，3?dihydropyrano（5,6?h）（1,4）benzodioxin?9?one（即 Cleomiscosin A，黃花菜木脂素A）。

2.4 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 借助String 平臺(tái)對(duì)蒼耳子治療過敏性鼻炎的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行分析，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖（剔除游離蛋白），圖2。

圖2 蒼耳子治療過敏性鼻炎的潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)圖

對(duì)PPI 所得的數(shù)據(jù)按照度值進(jìn)行可視化處理，圖3。度值越大表明與其他蛋白的相互作用越強(qiáng)，地位越關(guān)鍵。

圖3 蛋白相互作用度值數(shù)可視化

從圖3 可知，度值較大的靶點(diǎn)蛋白分別是：細(xì)胞腫瘤抗原p53（tumor protein 53，TP53）、半胱氨酸蛋白酶?3（cysteine protease?3，CASP3）、雌激素受體（estrogen receptor，ESR1）、Myc 原癌基因蛋白（myc proto?oncogene protein，MYC）、細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子Bcl?2（apoptosis regulator bcl?2，BCL2）及孕酮受體（progesterone receptor，PGR）。

2.5 GO 功能富集分析 運(yùn)用R 語(yǔ)言對(duì)蒼耳子治療過敏性鼻炎的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行GO 功能富集分析，篩選條件：pvalueCutoff=0.05。通過Goplot 對(duì)結(jié)果進(jìn)行展示，圖4。

圖4 蒼耳子治療過敏性鼻炎的功能?靶點(diǎn)Goplot圖

由圖4 可知，靶點(diǎn)參與的生物過程主要有：參與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞凋亡過程（glial cell apoptotic process）、上皮管細(xì)胞的分支形態(tài)發(fā)生（branching morphogenesis of an epithelial tube）、上皮管細(xì)胞形態(tài)發(fā)生（epithelial tube morphogenesis）、分支上皮細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生（morphogenesis of a branching epithelium）、分支結(jié)構(gòu)細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生（morphogenesis of a branching structure）、對(duì)紫外線的反應(yīng)（response to UV）以及女性性特征的發(fā)育等。

2.6 KEGG通路富集分析結(jié)果

運(yùn)用R 包（ClusterProfiler）對(duì)蒼耳子治療過敏性鼻炎的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路富集分析，設(shè)定條件pvalueCutoff=0.05。在得到的結(jié)果中，選出顯著性差異最大的20條通路繪制條形圖，圖5。

圖5 蒼耳子治療過敏性鼻炎的潛在靶點(diǎn)KEGG富集通路條形圖

由圖5可知，靶點(diǎn)參與的信號(hào)通路有：甲狀腺激素信號(hào)通路（Thyroid hormone signaling pathway）、p53信號(hào)通路（p53 signaling pathway）、PI3K?Akt信號(hào)通路（PI3K?Akt signaling pathway），和相關(guān)疾病通路如乙型肝炎（Hepatitis B）、結(jié)腸直腸癌（Colorectal cancer）、小細(xì)胞肺癌（Small cell lung cancer）、前列腺癌（Prostate cancer）、麻疹（Measles）等。

2.7 分子對(duì)接結(jié)果 借助AutoDock Tools 軟件對(duì)主要有效成分的小分子（配體）及關(guān)鍵蛋白靶點(diǎn)（受體）結(jié)構(gòu)優(yōu)化后，運(yùn)用iGemdock 軟件對(duì)配體與受體進(jìn)行對(duì)接匹配（表2）。配體與受體結(jié)合能越低，表示兩者發(fā)生作用的可能性就越大。由表2 可知MOL000011（即 Cleomiscosin A）與TP53、CASP3、ESR1、MYC及PGR均是最優(yōu)對(duì)接形式。運(yùn)用AutoDock Tools 軟件對(duì)Cleomiscosin A 的最優(yōu)結(jié)合模式進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證（圖6）。

圖6 MOL000011與TP53、CASP3、ESR1、MYC及PGR蛋白的分子對(duì)接圖

表2 主要有效成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合能

從圖 6 可知，Cleomiscosin A 與TP53、CASP3、ESR1、MYC、PGR5 個(gè)靶點(diǎn)蛋白的氨基酸殘基均形成了2個(gè)以上的氫鍵。

3 討論

過敏性鼻炎為呼吸系統(tǒng)的常見疾病，發(fā)作具有明顯的季節(jié)性。發(fā)作時(shí)，嚴(yán)重影響患者的正常工作與生活。隨著對(duì)過敏性鼻炎研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)其發(fā)病與鼻黏膜上皮細(xì)胞及上皮源性細(xì)胞因子、II型固有淋巴細(xì)胞、輔助T 細(xì)胞免疫失衡、Breg 細(xì)胞、樹狀突細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞相關(guān)，是由輔助T細(xì)胞、肥大細(xì)胞等炎性細(xì)胞與IL?4、IL?5等細(xì)胞因子共同相互作用的結(jié)果[6]。蒼耳子為傳統(tǒng)中醫(yī)治療鼻炎的常用藥物。現(xiàn)代藥理學(xué)研究指出[7]，蒼耳子含有脂肪酸、木脂素類級(jí)酚酸類等多種化學(xué)成分，并具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗菌、抗病毒等多種藥理作用。通過小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[8]，蒼耳子通過穩(wěn)定肥大細(xì)胞膜，減少組胺等過敏介質(zhì)的釋放，抑制肥大細(xì)胞依賴性速發(fā)型過敏反應(yīng)。

本研究通過對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索及數(shù)據(jù)處理，明確了蒼耳子中 beta?sitosterol、Stigmasterol、aloe?emodin、Cleomiscosin A 是治療過敏性鼻炎的主要有效成分。經(jīng)過模擬分子對(duì)接發(fā)現(xiàn)，Cleomiscosin A 與TP53、CASP3、ESR1、MYC及PGR都能較好的結(jié)合。文獻(xiàn)指出，Cleomiscosin A 為一種有機(jī)雜三環(huán)化合物，屬于天然香豆素內(nèi)酯范疇，具有抗炎活性，可抑制TSLP 表達(dá)[9]。TSLP 被認(rèn)為是最常見的炎癥性過敏性疾病，如哮喘、特應(yīng)性皮炎及特應(yīng)性鼻炎的主開關(guān)，在小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中[10]，當(dāng)阻斷TSLP 信號(hào)表達(dá)時(shí)，變應(yīng)原特異性血清IgE 水平、嗜酸性氣道組織炎癥及Th2細(xì)胞因子水平等顯著降低。Th2細(xì)胞因子水平與過敏性鼻炎的發(fā)生關(guān)系密切。當(dāng)Th2 細(xì)胞因子活性增強(qiáng)時(shí)能誘導(dǎo)體內(nèi)IgE 合成，促使前列腺素、白三烯及組織胺等遞質(zhì)釋放，增加毛細(xì)血管通透性及腺體分泌，導(dǎo)致嗜酸性粒細(xì)胞水平升高，進(jìn)而引起過敏性鼻炎的相關(guān)臨床癥狀[11]。beta?sitosterol 和Stigmasterol 均屬于植物甾醇類，具有抗炎、抗氧化及免疫調(diào)節(jié)的作用。研究發(fā)現(xiàn)[12-13]，β?谷甾醇具有降低血清組胺和IgE 水平，減少肥大細(xì)胞的產(chǎn)生及下調(diào)TSLP 水平的作用。豆甾醇在治療IgE介導(dǎo)的過敏性疾病方面有巨大潛力。蘆薈大黃素為蒽醌類生物活性成分，能通過抑制T 細(xì)胞達(dá)到機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的功能[14]。以上研究表明，蒼耳子通過多成分治療過敏性鼻炎。

通過GO 功能富集以及KEGG 通路富集得出，蒼耳子可能通過甲狀腺激素信號(hào)通路、p53 信號(hào)通路及PI3K?Akt 信號(hào)通路來(lái)達(dá)到調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞及控制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，從而達(dá)到治療過敏性鼻炎的作用。研究發(fā)現(xiàn)[15]，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中的小膠質(zhì)細(xì)胞能調(diào)節(jié)T細(xì)胞的增殖。T細(xì)胞和上皮細(xì)胞的異常是過敏性鼻炎誘發(fā)的因素[16-17]。

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，展示了蒼耳子治療過敏性鼻炎的多成分、多靶點(diǎn)、多通路、多功能的作用特點(diǎn)，通過對(duì)T細(xì)胞和上皮細(xì)胞的調(diào)控來(lái)達(dá)到治療過敏性鼻炎的目的。經(jīng)過分子對(duì)接展示蒼耳子發(fā)揮作用的可能過程，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供理論指導(dǎo)。