• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    PFOS暴露對(duì)肺癌細(xì)胞中信號(hào)通路的影響

    2021-10-26 13:29:40于志輝董晶熒王亞楠汪夏燕
    中國(guó)環(huán)境科學(xué) 2021年10期
    關(guān)鍵詞:培養(yǎng)液毒性測(cè)序

    于志輝,董晶熒,王亞楠,汪夏燕*

    PFOS暴露對(duì)肺癌細(xì)胞中信號(hào)通路的影響

    于志輝1,董晶熒1,王亞楠2,汪夏燕2*

    (1.北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境科學(xué)系,北京 100124;2.北京工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生物系,綠色催化與分離北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,環(huán)境安全與生物效應(yīng)卓越中心,北京 100124)

    為探討全氟辛烷磺酸鹽(PFOS)產(chǎn)生肺毒性的分子機(jī)制,采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)方法測(cè)定不同濃度PFOS對(duì)A549細(xì)胞活性的影響,并用二代測(cè)序方法測(cè)定PFOS暴露對(duì)A549細(xì)胞中miRNAs表達(dá)的影響,預(yù)測(cè)異常表達(dá)miRNAs的靶基因.通過(guò)生物信息學(xué)分析推斷靶基因參與的信號(hào)通路及潛在的生物學(xué)功能.結(jié)果顯示,低濃度PFOS(<200μmol/L)促進(jìn)A549細(xì)胞增殖,高濃度PFOS抑制細(xì)胞增殖.暴露于300μmol/L PFOS中24h的A549細(xì)胞中108個(gè)miRNAs表達(dá)量顯著上調(diào),63個(gè)miRNAs表達(dá)量顯著下調(diào).差異表達(dá)miRNAs通過(guò)Ras、Rap1、HIF-1、ErbB和VEGF等信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖、代謝和發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程.這表明PFOS可通過(guò)影響細(xì)胞增殖和誘發(fā)炎癥反應(yīng)對(duì)肺造成威脅.

    全氟辛烷磺酸鹽(PFOS);miRNA;信號(hào)通路

    全氟烷基化合物(PFASs)由于具有良好的疏水疏油性,已被廣泛應(yīng)用于滅火劑、食品包裝、紡織品、紙張、洗發(fā)劑、表面活性劑等工商業(yè)產(chǎn)品加工過(guò)程[1-2].由于C-F鍵具有強(qiáng)極性,在強(qiáng)紫外線(xiàn)、高溫及其他化學(xué)作用的條件下具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性,并且很難通過(guò)微生物及高等動(dòng)物的代謝作用來(lái)降解,因此PFASs可以穩(wěn)定的存在于環(huán)境中并在生物中積累[3-4].已有研究表明PFASs廣泛分布于大氣、水、土壤等多種環(huán)境介質(zhì)中,甚至在職業(yè)暴露和非職業(yè)暴露人群的血液、尿液、膽汁、母乳及臍帶血中均有檢測(cè)出PFASs[5-10].全氟辛烷磺酸鹽(PFOS)是PFASs的最終代謝產(chǎn)物,分布最為廣泛.PFOS可通過(guò)胃腸道、呼吸道和皮膚進(jìn)入人體[11],且半衰期高達(dá)5a以上[2].研究表明,PFOS具有肝[12]、肺[13]、腎[14]、免疫[15]、神經(jīng)[16]、生殖發(fā)育[17]等多種毒性,是一類(lèi)具有全身多器官和組織毒性的有機(jī)污染物.其中,PFOS對(duì)肝、神經(jīng)毒性的相關(guān)研究相對(duì)較多.PFOS的肝毒性主要表現(xiàn)為脂肪肝、肝腫大、肝細(xì)胞增生和肝細(xì)胞氧化損傷等[18-19].此外,PFOS通過(guò)誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)量的活性氧或炎癥因子,對(duì)神經(jīng)細(xì)胞造成氧化損傷或神經(jīng)炎癥[16,20].

    PFOS在非職業(yè)暴露者肺中的含量?jī)H次于肝[21],可誘發(fā)多種肺部疾病.流行病學(xué)研究表明,血清PFOS濃度與兒童哮喘病加劇具有相關(guān)性[22].Qin等[23]通過(guò)評(píng)估兒童哮喘病患者的肺功能,進(jìn)一步證明兒童哮喘病患者血清中PFOS的濃度與其肺功能呈顯著性負(fù)相關(guān).與其他組織毒性相同,PFOS也主要通過(guò)誘導(dǎo)肺組織分泌過(guò)量的炎癥因子和活性氧來(lái)造成肺毒性[24],但研究者對(duì)其中的調(diào)控機(jī)制以及涉及的信號(hào)通路知之甚少,對(duì)PFOS的肺毒性機(jī)制還沒(méi)有形成系統(tǒng)完善的認(rèn)識(shí).

    microRNA(miRNA)是一類(lèi)由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為18~24個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子,存在于幾乎所有的真核生物及少數(shù)病毒中,通過(guò)與mRNA的完全或不完全互補(bǔ)誘導(dǎo)mRNA降解或抑制其翻譯,實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)調(diào)控.基于miRNA的生物學(xué)功能,已經(jīng)有很多學(xué)者從miRNA分子水平探究PFOS對(duì)生物體的毒性機(jī)制[25-27]. PFOS可引起妊娠初期人滋養(yǎng)層細(xì)胞的miR-29b含量升高,進(jìn)而使得多種蛋白的DNA甲基化和蛋白乙?;?蛋白表達(dá)量降低引起ROS含量升高[25].ROS含量的升高與子癇前期等妊娠并發(fā)癥相關(guān).此外,研究表明,PFOS通過(guò)增加SH-SY5Y細(xì)胞中miR-22的相對(duì)表達(dá)量,抑制BDNF mRNA的表達(dá),影響B(tài)DNF- ERK-CREB信號(hào)通路,為PFOS的神經(jīng)毒性提供了新的實(shí)驗(yàn)證據(jù)[26].這些研究為PFOS的肺毒性機(jī)制研究提供了新思路.然而,與miRNA相關(guān)的PFOS對(duì)肺毒性機(jī)制的研究未見(jiàn)報(bào)道.

    本文采用體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)的方法,以人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞為模型,從miRNA表觀遺傳調(diào)控角度研究PFOS對(duì)肺損傷可能的作用機(jī)制.采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)方法檢測(cè)細(xì)胞活性,探討PFOS對(duì)A549的細(xì)胞增殖毒性.二代測(cè)序篩選PFOS暴露后差異表達(dá)的miRNAs并進(jìn)行基因組百科全書(shū)(KEGG)和基因本體論(GO)富集分析,推測(cè)參與PFOS肺毒性的信號(hào)通路,深入探究PFOS肺毒性的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制.

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞與試劑

    人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心(北京,中國(guó));杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、磷酸鹽緩沖溶液(PBS)、青鏈霉素雙抗溶液(PS)、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(胰蛋白酶-EDTA)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Gibco公司;PFOS(純度98%)購(gòu)自北京百靈威科技有限公司;二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;CCK-8試劑盒購(gòu)自北仁化學(xué)科技(北京)有限公司;TRIzol試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司;miRcute miRNA提取分離試劑盒、miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、目的基因和內(nèi)參基因引物、miRcute增強(qiáng)型miRNA 熒光定量檢測(cè)試劑盒(SYBR Green)購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司.

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

    將A549細(xì)胞置于含10% FBS、1% PS的DMEM培養(yǎng)液中,于37℃、飽和濕度、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng).將PFOS溶于DMSO中,配制500mmol/L PFOS儲(chǔ)備液儲(chǔ)存于-20°C,使用前用培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋.為避免對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性,實(shí)驗(yàn)組中DMSO的終體積分?jǐn)?shù)不能超過(guò)0.1%,對(duì)照組為只含0.1% DMSO的培養(yǎng)液,空白組為不含細(xì)胞的0.1% DMSO的培養(yǎng)液.

    1.3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性

    收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制備細(xì)胞懸液.取100μL密度為4×104個(gè)/mL的A549細(xì)胞懸液接種于96孔板中培養(yǎng).孵育24h后棄去培養(yǎng)液,每孔加入200μL濃度分別為0,50,100,200,300,400,500μmol/L PFOS的培養(yǎng)液,每組6個(gè)平行.在標(biāo)準(zhǔn)條件下分別培養(yǎng)24,48,72h后棄去培養(yǎng)液,每孔加入100μL含10% CCK-8的培養(yǎng)液于37℃條件下孵育0.5h.用酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)檢測(cè)各孔在450nm處吸光度(A),吸光度與細(xì)胞活性呈正比.細(xì)胞活性的計(jì)算公式為:

    1.4 RNA提取與測(cè)序

    考慮到A549細(xì)胞倍增周期約為21h[28],且其在PFOS中暴露24h的半數(shù)抑制濃度(IC50)在400~ 500μmol/L之間,因此,將A549細(xì)胞在300μmol/L PFOS中暴露24h研究PFOS暴露對(duì)A549細(xì)胞中miRNAs表達(dá)的影響.取1mL密度為2×106個(gè)/mL的A549細(xì)胞懸液加入75cm2培養(yǎng)瓶中,加入適量的培養(yǎng)液,將細(xì)胞吹打均勻.待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)24h后,移去上清液,實(shí)驗(yàn)組加入適量PFOS濃度為300μmol/L的培養(yǎng)液,對(duì)照組加入適量含0.1% DMSO的培養(yǎng)液,每組設(shè)置3個(gè)平行.待細(xì)胞暴露24h之后,用0.25%的胰蛋白酶將細(xì)胞消化下來(lái),利用TRIzol試劑抽提總RNA.委托天根生化科技(北京)有限公司基于Illumina HiSeq 2000測(cè)序平臺(tái)對(duì)總RNA樣品進(jìn)行測(cè)序分析.

    1.5 miRNAs靶基因預(yù)測(cè)和鑒定

    使用R包edgeR對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣品中所有miRNAs進(jìn)行差異分析,TMM方法歸一化.采用miRanda軟件對(duì)具有顯著性差異的miRNAs靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè),得到miRNAs和靶基因間的對(duì)應(yīng)關(guān)系.將得到的靶基因基于topGO進(jìn)行GO功能富集分析.GO共包含3個(gè)類(lèi)群,分別描述基因的分子功能(MF)、細(xì)胞組分(CC)、參與的生物學(xué)過(guò)程(BP).本文主要對(duì)靶基因的生物學(xué)過(guò)程進(jìn)行富集分析,并對(duì)富集分析結(jié)果進(jìn)行圖形化展示.在生物體內(nèi),不同基因相互協(xié)調(diào)行使其生物學(xué)功能,通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行通路顯著性富集,以確定差異表達(dá)的miRNAs靶基因參與的最主要的生化代謝途徑和信號(hào)傳導(dǎo)途徑.

    1.6 RT-qPCR驗(yàn)證miRNAs

    參照miRcute miRNA提取分離試劑盒提取實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞中的miRNAs.測(cè)定提取的miRNAs純度,保證所有樣品的A260/A280在1.8~2之間.使用PCR儀和熒光定量PCR儀(美國(guó)Applied Biosystems公司),結(jié)合miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒和miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(SYBR Green)對(duì)miRNAs樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR),每組設(shè)置3個(gè)平行,具體實(shí)驗(yàn)操作參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū).數(shù)據(jù)處理以U6為內(nèi)參基因,對(duì)目標(biāo)基因表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,計(jì)算DCt值.以對(duì)照組作為參照因子,其倍數(shù)變化為1,實(shí)驗(yàn)組基因表達(dá)差異相對(duì)于參照因子基因表達(dá)的倍數(shù)為2﹣△△Ct.分析實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中miRNAs的相對(duì)表達(dá)量,并與測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較.

    1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

    所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)果以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示.采用單因素方差分析方法比較各組之間的差異,當(dāng)<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

    2 結(jié)果分析

    2.1 PFOS暴露對(duì)細(xì)胞活性的影響

    CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性結(jié)果(圖1)顯示,A549細(xì)胞在高濃度(>300μmol/L)PFOS中暴露24,48,72h后細(xì)胞活性顯著降低(<0.0001),且細(xì)胞活性隨PFOS濃度增大而減小.經(jīng)過(guò)不同濃度的PFOS暴露24h后,細(xì)胞活性的變化范圍為47.9%~118.0%.其中,當(dāng)PFOS濃度為50和100μmol/L時(shí),細(xì)胞活性顯著增加(<0.001).經(jīng)過(guò)不同濃度的PFOS暴露48和72h后,細(xì)胞活性的變化范圍分別為12.1%~106.5%和2.1%~108.9%.當(dāng)PFOS濃度<300μmol/L,細(xì)胞活性與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異.當(dāng)PFOS濃度為400, 500μmol/L時(shí),細(xì)胞活性顯著降低.A549細(xì)胞在300μmol/L的PFOS中暴露48h后,細(xì)胞活性無(wú)顯著性變化,但暴露72h后,細(xì)胞活性顯著降低(<0.05).

    圖1 PFOS暴露后的A549細(xì)胞活性

    *<0.05;***<0.001; ****<0.0001

    2.2 PFOS暴露對(duì)細(xì)胞中miRNAs的影響

    本文利用二代測(cè)序技術(shù)篩查了PFOS暴露后miRNAs的表達(dá)情況,結(jié)果表明,在300μmol/L的PFOS中暴露24h可引起A549細(xì)胞中171個(gè)miRNAs異常表達(dá)(FC>2.0,<0.05)(圖2).其中,108個(gè)miRNAs(含miR-377-3p和miR-3199兩個(gè)已知miRNAs及106個(gè)未知miRNAs)表達(dá)量顯著上升,63個(gè)miRNAs(含已知的miR-4709-5p和62個(gè)未知miRNAs)表達(dá)量顯著下降.

    2.3 miRNAs靶基因的預(yù)測(cè)

    表達(dá)量顯著上升的108個(gè)miRNAs可作用于42009個(gè)靶mRNAs,表達(dá)量顯著下降的63個(gè)miRNAs對(duì)應(yīng)于30098個(gè)靶mRNAs.通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析差異表達(dá)miRNAs靶基因的功能及其相互作用,預(yù)測(cè)到靶基因可能參與的信號(hào)通路包括——大鼠肉瘤基因(Ras)信號(hào)通路、Ras相關(guān)蛋白1(Rap1)信號(hào)通路、ErbB信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)信號(hào)通路、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)信號(hào)通路、磷脂酶D信號(hào)通路、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路和雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號(hào)通路等(圖3).GO富集分析靶基因參與的生物學(xué)過(guò)程,結(jié)果表明差異表達(dá)miRNAs靶基因參與的生物學(xué)過(guò)程包括——細(xì)胞增殖過(guò)程、生物調(diào)節(jié)過(guò)程、代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程、應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程、多細(xì)胞生物過(guò)程、細(xì)胞組分組織或合成過(guò)程、細(xì)胞定位過(guò)程、發(fā)育過(guò)程、免疫系統(tǒng)過(guò)程、多組織過(guò)程、生物附著過(guò)程和復(fù)制過(guò)程等(圖4).

    圖2 PFOS暴露后A549細(xì)胞中miRNAs的火山

    圖3 差異表達(dá)miRNAs靶基因KEGG通路富集分析

    圖4 差異表達(dá)miRNAs靶基因GO(BP)富集分析

    2.4 RNA-Seq結(jié)果的驗(yàn)證

    采用RT-qPCR方法驗(yàn)證差異表達(dá)的miR- 377-3p、miR-3199和miR-4709-5p的表達(dá)量,結(jié)果如圖5所示,miR-4709-5p與測(cè)序結(jié)果一致,在PFOS實(shí)驗(yàn)組中顯著下調(diào);miR-377-3p和miR-3199表達(dá)量無(wú)明顯變化,與測(cè)序結(jié)果不一致.

    圖5 差異表達(dá)miRNAs的驗(yàn)證

    3 討論

    由于PFOS在環(huán)境介質(zhì)中的廣泛存在使得人們開(kāi)始關(guān)心它對(duì)人類(lèi)健康的影響.研究表明,PFOS對(duì)包括肺在內(nèi)的多種組織和系統(tǒng)均有毒性作用[29]. PFOS的肺毒性與DNA甲基化、ROS含量變化相關(guān).然而這些變化都不能充分解釋PFOS的肺毒性機(jī)理.已有研究表明PFOS可引起妊娠初期人滋養(yǎng)層細(xì)胞、大鼠肝臟和大腦組織中的miRNAs異常表達(dá).因此,本文以容易培養(yǎng)且對(duì)外加作用因子敏感的非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞為研究對(duì)象,探討PFOS的肺毒性作用機(jī)制.

    PFOS通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期影響細(xì)胞增殖,而細(xì)胞的異常增殖往往與癌癥的發(fā)生有關(guān)[30].Jabeen等[31]通過(guò)研究表觀遺傳修飾在細(xì)胞增殖和凋亡中的作用對(duì)PFOS影響A549細(xì)胞活性的機(jī)制進(jìn)行了闡述,發(fā)現(xiàn)低濃度條件下(<100μmol/L)細(xì)胞周期蛋白E和細(xì)胞周期蛋白A表達(dá)量增加,促進(jìn)A549細(xì)胞增殖,當(dāng)PFOS濃度增至400μmol/L時(shí),兩種細(xì)胞周期蛋白表達(dá)量降低,造成細(xì)胞活性顯著降低.Cui等[32]研究PFOS暴露后人正常肝細(xì)胞HL-7702的蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn),50μmol/L的PFOS可誘導(dǎo)HL-7702細(xì)胞中多種細(xì)胞周期蛋白及相應(yīng)的細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶表達(dá)量增加,從而促進(jìn)細(xì)胞增殖.但當(dāng)PFOS濃度大于200μmol/L時(shí),細(xì)胞活性呈劑量依賴(lài)性降低.同樣的,本文結(jié)果顯示,當(dāng)A549細(xì)胞在50和100μmol/L PFOS中暴露24h后,細(xì)胞活性顯著增加,當(dāng)PFOS濃度大于300μmol/L時(shí)細(xì)胞活性顯著降低,且細(xì)胞活性隨PFOS濃度增大而減小.這說(shuō)明PFOS可能通過(guò)影響細(xì)胞增殖對(duì)肺產(chǎn)生毒性.

    本文結(jié)果顯示PFOS暴露可引起A549細(xì)胞中多個(gè)miRNAs異常表達(dá),這些異常表達(dá)的miRNAs可作用于多個(gè)靶基因,參與Ras、Rap1、ErbB、HIF-1和VEGF等多個(gè)信號(hào)通路.Ras信號(hào)通路協(xié)同下游多個(gè)信號(hào)通路調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化和凋亡[33].Ras基因的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),在30%非小細(xì)胞肺癌中發(fā)現(xiàn)Ras突變[34],因此,Ras被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生的重要因素.Rap1是Ras通路的重要調(diào)節(jié)因子和介質(zhì),其參與的信號(hào)通路與肺癌細(xì)胞的增殖和分化相關(guān)[35].ErbB可促進(jìn)細(xì)胞增殖,激活ErbB通路可能誘發(fā)癌癥.Zhang等[36]研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)抽煙可使人體內(nèi)多個(gè)miRNAs異常表達(dá),進(jìn)而影響ErbB通路促進(jìn)肺癌的發(fā)生. Kruspig等[37]的研究表明,ErbB通過(guò)與Ras通路相互作用促進(jìn)Kras突變肺癌細(xì)胞的增殖,因此,含ErbB抑制劑的藥物可能有利于Kras突變肺癌的治療.VEGF在肺發(fā)育及肺結(jié)構(gòu)形成和維持過(guò)程中具有重要作用,其低表達(dá)會(huì)導(dǎo)致肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能異常[38].Zhang等[39]研究妊娠期PFOS暴露對(duì)子代大鼠肺發(fā)育的影響,發(fā)現(xiàn)PFOS能夠引起子代大鼠肺部炎癥因子白介素-1β和白介素-18的明顯增加,且與炎癥小體相關(guān)的蛋白表達(dá)也顯著升高.同時(shí),在肺泡發(fā)育和肺部血管形成過(guò)程中具有重要作用的VEGF及HIF-1的表達(dá)也受到抑制,誘發(fā)子代大鼠支氣管肺發(fā)育不良.本研究的預(yù)測(cè)結(jié)果說(shuō)明PFOS可能通過(guò)miRNAs調(diào)控Ras、Rap1、ErbB、VEGF和HIF-1等信號(hào)通路影響細(xì)胞增殖、代謝和發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程.

    測(cè)序和RT-qPCR結(jié)果均表明PFOS可引起A549細(xì)胞中miR-4709-5p表達(dá)顯著下降.miR- 4709-5p靶基因KEGG通路分析顯示,miR-4709-5p可參與促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路,在細(xì)胞增殖、分化和凋亡過(guò)程中具有重要作用[40]. MAPK蛋白還參與體內(nèi)多種氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)過(guò)程并發(fā)揮重要調(diào)控作用[41]. Shi等[42]將斑馬魚(yú)胚胎暴露于不同濃度的PFOS中,發(fā)現(xiàn)在斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)中出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng),且與MAPK通路相關(guān)的基因表達(dá)異常,推測(cè)這與PFOS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān).研究表明miR-4709與結(jié)腸癌有關(guān),miR-4709作為一種致癌基因可通過(guò)作用于NR3C2促進(jìn)人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移[43-44].Omidi等[45]通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)miR-4709-5p與紅斑狼瘡疾病相關(guān),可作為一種潛在的生物標(biāo)志物.由于miR-4709-5p與多種疾病的發(fā)生有關(guān),本文推測(cè)PFOS通過(guò)下調(diào)miR- 4709-5p調(diào)控MAPK信號(hào)通路誘發(fā)肺部疾病.

    4 結(jié)論

    4.1 PFOS暴露可影響人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞增殖,低濃度PFOS(<200μmol/L)促進(jìn)A549細(xì)胞增殖,高濃度PFOS抑制細(xì)胞增殖,且抑制作用隨PFOS濃度增大而增大.

    4.2 PFOS暴露可引起A549細(xì)胞中171個(gè)miRNAs異常表達(dá),其中,108個(gè)miRNAs表達(dá)量顯著上調(diào),63個(gè)miRNAs表達(dá)量顯著下調(diào).異常表達(dá)的miRNAs可能通過(guò)調(diào)控Ras、Rap1、ErbB、HIF-1和VEGF等信號(hào)通路影響細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡、代謝和發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程.通過(guò)篩選差異表達(dá)的miRNAs來(lái)預(yù)測(cè)與PFOS肺毒性相關(guān)的靶基因是第一步,還需要進(jìn)一步驗(yàn)證靶基因的準(zhǔn)確性以及作為生物標(biāo)志物進(jìn)行疾病診斷的特異性和靈敏性.

    [1] Paul A G, Jones K C, Sweetman A J. A first global production, emission, and environmental inventory for perfluorooctane sulfonate [J]. Environmental Science & Technology, 2009,43(2):386-392.

    [2] Buck R C, Franklin J, Berger U, et al. Perfluoroalkyl and polyfluoroalkyl substances in the environment: terminology, classification, and origins [J]. Integrated Environmental Assessment and Management, 2011,7(4):513-541.

    [3] Zeng Z T, Song B, Xiao R, et al. Assessing the human health risks of perfluorooctane sulfonate by in vivo and in vitro studies [J]. Environment International, 2019,126:598-610.

    [4] 郭萌萌,崔文杰,劉曉玉,等.黃渤海區(qū)域水產(chǎn)品中全氟烷基物質(zhì)的分布特征 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2020,40(8):3424-3432.

    Guo M M, Cui W J, Liu X Y, et al. Distribution of perfluoroalkyl substances in aquatic products in coastal and adjacent areas of the Yellow Sea and Bohai Sea, China [J]. China Environmental Science, 2020,40(8):3424-3432.

    [5] Giesy J P, Kannan K, Jones P D. Global biomonitoring of perfluorinated organics [J]. The Scientific World Journal, 2001,1: 627-629.

    [6] Wang J H, Pan Y T, Wei X F, et al. Temporal trends in prenatal exposure (1998-2018) to emerging and legacy per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) in cord plasma from the Beijing Cord Blood Bank, China [J]. Environmental Science & Technology, 2020,54(20):12850-12859.

    [7] Ehresman D J, Froehlich J W, Olsem G W, et al. Comparison of human whole blood, plasma, and serum matrices for the determination of perfluorooctanesulfonate (PFOS), perfluorooctanoate (PFOA), and other fluorochemicals [J]. Environmental Research, 2007,103(2): 176-184.

    [8] 孫殿超,龔 平,王小萍,等.拉薩河全氟化合物的時(shí)空分布特征研究 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2018,38(11):4298-4306.

    Sun D C, Gong P, Wang X P, et al. Special distribution and seasonal variation of perfluoroalkyls substances in Lhasa River Basin, China [J]. China Environmental Science, 2018,38(11):4298-4306.

    [9] 劉曉灣,趙 亮,張 鴻,等.深圳市表層土中氟化物組成及分布 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2015,35(2):499-505.

    Liu X W, Zhao L, Zhang H, et al. Composition and distribution of the fluoride compounds in topsoil samples of Shenzhen [J]. China Environmental Science, 2015,35(2):499-505.

    [10] 李 瀟,仝 彤,李 健,等.母乳中全氟化合物的污染水平與嬰兒暴露評(píng)估 [J]. 中國(guó)環(huán)境科學(xué), 2015,35(11):3475-3480.

    Li X, Tong T, Li J, et al. Perfluorinated compounds in human milk from Beijing: levels and exposure assessment of nursing infant [J]. China Environmental Science, 2015,35(11):3475-3480.

    [11] Olsem G W, Huang H Y, Helzlsouer K J, et al. Historical comparison of perfluorooctanesulfonate, perfluorooctanoate, and other fluorochemicals in human blood [J]. Environmental Health Perspectives, 2005,113(5):539-545.

    [12] Han R, Zhang F, Wan C, et al. Effect of perfluorooctane sulphonate- induced Kupffer cell activation on hepatocyte proliferation through the NF-κB/TNF-α/IL-6-dependent pathway [J]. Chemosphere, 2018, 200:283-294.

    [13] Mao Z X, Xia W, Wang J, et al. Perfluorooctane sulfonate induces apoptosis in lung cancer A549 cells through reactive oxygen species- mediated mitochondrion-dependent pathway [J]. Journal of Applied Toxicology, 2013,33(11):1268-1276.

    [14] Chou H C, Wen L L, Chang C C, et al. From the cover: L-carnitine via PPARγ- and Sirt1-dependent mechanisms attenuates epithelial-mesenchymal transition and renal fibrosis caused by perfluorooctanesulfonate [J]. Toxicological Sciences, 2017,160(2):217-229.

    [15] Soloff A C, Wolf B J, White N D, et al. Environmental perfluorooctane sulfonate exposure drives T cell activation in bottlenose dolphins [J]. Journal of Applied Toxicology, 2017,37(9):1108-1116.

    [16] Chen N, Li J, Li D, et al. Chronic exposure to perfluorooctane sulfonate induces behavior defects and neurotoxicity through oxidative damages, in vivo and in vitro [J]. PLoS One, 2014,9(11):e113453.

    [17] Tang L L, Wang J D, Xu T T, et al. Mitochondrial toxicity of perfluorooctane sulfonate in mouse embryonic stem cell-derived cardiomyocytes [J]. Toxicology, 2017,382:108-116.

    [18] Wan H T, Zhao Y G, Wei X, et al. PFOS-induced hepatic steatosis, the mechanistic actions on β-oxidation and lipid transport [J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2012,1820(7):1092-1101.

    [19] Han R, Hu M X, Zhong Q, et al. Perfluorooctane sulphonate induces oxidative hepatic damage via mitochondria-dependent and NF-κB/ TNF-α-mediated pathway [J]. Chemosphere, 2018,191:1056-1064.

    [20] Chen X X, Nie X K, Mao J M, et al. Perfluorooctane sulfonate mediates secretion of IL-1β through PI3K/AKT NF-κB pathway in astrocytes [J]. Neurotoxicology and Teratology, 2018,67:65-75.

    [21] Maestri L, Negri S, Ferrari M, et al. Determination of perfluorooctanoic acid and perfluorooctanesulfonate in human tissues by liquid chromatography/single quadrupole mass spectrometry [J]. Rapid Communication in Mass Spectrometry, 2006,20(18):2728- 2734.

    [22] Humblet O, Diaz-Ramirez L G, Balmes J R, et al. Perfluoroalkyl chemicals and asthma among children 12-19years of age: NHANES (1999-2008) [J]. Environmental Health Perspectives, 2014,122(10): 1129-1133.

    [23] Qin X D, Qian Z M, Dharmage S C, et al. Association of perfluoroalkyl substances exposure with impaired lung function in children [J]. Environmental Research, 2017,155:15-21.

    [24] Sorli J B, Lag M, Ekeren L, et al. Per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) modify lung surfactant function and pro-inflammatory responses in human bronchial epithelial cells [J]. Toxicology in Vitro, 2020,62:104656.

    [25] Sonkar R, Kay M K, Choudhury M. PFOS modulates interactive epigenetic regulation in first-trimester human trophoblast cell line HTR-8/SVneo[J]. Chemical Research in Toxicology, 2019,32(10): 2016-2027.

    [26] Li W, He Q Z, Wu C Q, et al. PFOS disturbs BDNF-ERK-CREB signalling in association with increased microRNA-22 in SH-SY5Y cells [J]. BioMed Research International, 2015,2015:302653.

    [27] Wang F, Liu W, Jin Y H, et al. Prenatal and neonatal exposure to perfluorooctane sulfonic acid results in aberrant changes in miRNA expression profile and levels in developing rat livers [J]. Environmental Toxicology, 2015,30(6):712-723.

    [28] 陳衛(wèi)強(qiáng),戚好文,吳昌歸,等.雙氫青蒿素抗人肺腺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究 [J]. 中國(guó)肺癌雜志, 2005,8(2):85-88.

    Chen W Q, Qi H W, Wu C G, et al. Effect of dihydroartem isinin on proliferation of human lung adenoeareinoma cell line A549 [J]. Chinese Journal of Lung Cancer, 2005,8(2):85-88.

    [29] Xing J L, Wang G, Zhao J C, et al. Toxicity assessment of perfluorooctane sulfonate using acute and subchronic male C57BL/6J mouse models [J]. Environmental Pollution, 2016,210:388-396.

    [30] Evan G I, Vousden K H. Proliferation, cell cycle and apoptosis in cancer [J]. Nature, 2001,411(6835):342-348.

    [31] Jabeen M, Fayyaz M, Irudayaraj J. Epigenetic modifications, and alterations in cell cycle and apoptosis pathway in A549 lung carcinoma cell line upon exposure to perfluoroalkyl substances [J]. Toxics, 2020,8(4):1-18.

    [32] Cui R N, Zhang H G, Guo X J, et al. Proteomic analysis of cell proliferation in a human hepatic cell line (HL-7702) induced by perfluorooctane sulfonate using iTRAQ [J]. Journal of Hazardous Materials, 2015,299:361-370.

    [33] Fang J Y, Richardson B C. The MAPK signalling pathways and colorectal cancer [J]. Lancet Oncology, 2005,6(5):322-327.

    [34] Wang X S, Feng W M, Peng C, et al. Targeting RNA helicase DHX33 blocks Ras-driven lung tumorigenesis in vivo [J]. Cancer Science, 2020,111(10):3564-3575.

    [35] Jin X, Di X, Wang R M, et al. RBM10 inhibits cell proliferation of lung adenocarcinoma via RAP1/AKT/CREB signalling pathway [J]. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 2019,23(6):3897-3904.

    [36] Zhang L M, Wang H L, Wang C L. Persistence of smoking induced non-small cell lung carcinogenesis by decreasing ERBB pathway- related microRNA expression [J]. Thoracic Cancer, 2019,10(4): 890-897.

    [37] Kruspig B, Monteverde T, Neidler S, et al. The ERBB network facilitates KRAS-driven lung tumorigenesis [J]. Science Translational Medicine, 2018,10(446):1-11.

    [38] Myint M Z, Jia J, Adlat S, et al. Effect of low VEGF on lung development and function [J]. Transgenic Research, 2021,30(1):35- 50.

    [39] Zhang H S, Lu H M, Yu L, et al. Effects of gestational exposure to perfluorooctane sulfonate on the lung development of offspring rats [J]. Environmental Pollution, 2020,272:115535.

    [40] Peng Q, Deng Z Y, PAN H, et al. Mitogen-activated protein kinase signaling pathway in oral cancer [J]. Oncology Letters, 2018, 15(2):1379-1388.

    [41] Kim E K, Choi E J. Compromised MAPK signaling in human diseases: an update [J]. Archives of Toxicology, 2015,89(6):867-882.

    [42] Shi X J, Zhou B S. The role of Nrf2 and MAPK pathways in PFOS-induced oxidative stress in zebrafish embryos [J]. Toxicological Sciences, 2010,115(2):391-400.

    [43] Yu M, Yu H L, Li Q H, et al. miR-4709 overexpression facilitates cancer proliferation and invasion via down regulating NR3C2 and is an unfavorable prognosis factor in colon adenocarcinoma [J]. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology, 2019,33(12):e22411.

    [44] Li F X, Li Q, Wu X H. Construction and analysis for differentially expressed long non-coding RNAs and MicroRNAs mediated competing endogenous RNA network in colon cancer [J]. PLoS One, 2018,13(2):e0192494.

    [45] Omidi F, Hosseini S A, Ahmadi A, et al. Discovering the signature of a lupus-related microRNA profile in the gene expression omnibus repository [J]. Lupus, 2020,29(11):1321-1335.

    Impacts of PFOS exposure on signaling pathways in lung cancer cells.

    YU Zhi-hui1, DONG Jing-ying1, WANG Ya-nan2, WANG Xia-yan2*

    (1.Department of Environmental Sciences, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China;2.Center of Excellence for Environmental Safety and Biological Effects, Beijing Key Laboratory for Green Catalysis and Separation, Department of Chemistry and Biology, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China)., 2021,41(10):4878~4884

    The effects of different concentrations of perfluorooctane sulfonate (PFOS) on the viability of A549 cells were determined by the CCK-8 method. The effects of PFOS exposure on miRNAs expression in A549 cells were detected by the next-generation sequencing method to investigate the molecular mechanism of pulmonary toxicity caused by PFOS. Target genes with abnormal expression of miRNAs were predicted, and their involved signaling pathways and potential biological functions were inferred through bioinformatics analysis. The results showed that a low concentration of PFOS (<200μmol/L) promoted the proliferation of A549 cells, while a high concentration of PFOS inhibited the proliferation of A549 cells. The expression levels of 108 miRNAs and 63 miRNAs in A549 cells exposed to 300 μmol/L PFOS for 24 h were significantly up-regulated and down-regulated. Differentially expressed miRNAs participate in biological processes such as cell proliferation, metabolic process, and developmental process through signaling pathways such as Ras, Rap1, HIF-1, ErbB, VEGF and so on. This study suggested that PFOS can threaten the lung by affecting cell proliferation and inducing inflammation.

    perfluorooctane sulfonate (PFOS);miRNA;signaling pathways

    X503.1

    A

    1000-6923(2021)10-4878-07

    于志輝(1961-),女,北京人,教授,博士,主要從事環(huán)境毒理學(xué)和環(huán)境電化學(xué)方面研究.發(fā)表論文10余篇.

    2021-03-03

    北京高校卓越青年科學(xué)家計(jì)劃項(xiàng)目(BJJWZYJH0120191000 5017)

    * 責(zé)任作者, 教授, xiayanwang@bjut.edu.cn

    猜你喜歡
    培養(yǎng)液毒性測(cè)序
    杰 Sir 帶你認(rèn)識(shí)宏基因二代測(cè)序(mNGS)
    新民周刊(2022年27期)2022-08-01 07:04:49
    從一道試題再說(shuō)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的使用
    二代測(cè)序協(xié)助診斷AIDS合并馬爾尼菲籃狀菌腦膜炎1例
    傳染病信息(2021年6期)2021-02-12 01:52:58
    動(dòng)物之最——毒性誰(shuí)最強(qiáng)
    調(diào)整蔗糖、硼酸和pH值可優(yōu)化甜櫻桃花粉萌發(fā)培養(yǎng)液
    不同培養(yǎng)液對(duì)大草履蟲(chóng)生長(zhǎng)與形態(tài)的影響研究
    RGD肽段連接的近紅外量子點(diǎn)對(duì)小鼠的毒性作用
    超級(jí)培養(yǎng)液
    基因捕獲測(cè)序診斷血癌
    PM2.5中煤煙聚集物最具毒性
    欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 最后的刺客免费高清国语| 国产精品国产三级专区第一集| 熟妇人妻不卡中文字幕| 国产伦精品一区二区三区视频9| 水蜜桃什么品种好| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产男女内射视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 多毛熟女@视频| 一级毛片 在线播放| 永久免费av网站大全| 永久免费av网站大全| 亚州av有码| 久久精品国产自在天天线| 久久99精品国语久久久| 日韩av在线免费看完整版不卡| .国产精品久久| 晚上一个人看的免费电影| 人妻少妇偷人精品九色| 国产精品99久久99久久久不卡 | 久久久久久久久久久免费av| 国产成人精品久久久久久| 丝袜喷水一区| 久久这里有精品视频免费| 欧美另类一区| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 22中文网久久字幕| 成人亚洲欧美一区二区av| 男人操女人黄网站| 美女视频免费永久观看网站| 欧美日韩av久久| 久久影院123| 五月玫瑰六月丁香| 高清av免费在线| 精品一区在线观看国产| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 好男人视频免费观看在线| 人妻人人澡人人爽人人| 春色校园在线视频观看| 久久99热6这里只有精品| 亚洲图色成人| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲性久久影院| 国产精品人妻久久久久久| 国产免费现黄频在线看| 国产精品久久久久久久电影| 日韩av在线免费看完整版不卡| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 久久99精品国语久久久| 看非洲黑人一级黄片| 色吧在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 最近2019中文字幕mv第一页| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 99久久人妻综合| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲久久久国产精品| 满18在线观看网站| 国产一区二区在线观看日韩| 有码 亚洲区| av天堂久久9| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲成人手机| 欧美xxxx性猛交bbbb| 国产爽快片一区二区三区| 成人综合一区亚洲| 人妻一区二区av| 亚洲在久久综合| 久久国产精品大桥未久av| 两个人免费观看高清视频| av黄色大香蕉| 国产成人aa在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲国产精品专区欧美| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 免费观看在线日韩| 国产精品成人在线| 中国三级夫妇交换| 欧美另类一区| 一本久久精品| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 我的女老师完整版在线观看| 一级毛片我不卡| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 伦理电影大哥的女人| 欧美bdsm另类| 午夜老司机福利剧场| 国产亚洲精品第一综合不卡 | av免费在线看不卡| 免费观看的影片在线观看| 国产色爽女视频免费观看| 免费观看av网站的网址| 有码 亚洲区| 在线免费观看不下载黄p国产| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲av日韩在线播放| 在线观看免费日韩欧美大片 | 亚洲精品国产av蜜桃| 成人二区视频| 在线观看一区二区三区激情| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 日日啪夜夜爽| h视频一区二区三区| 赤兔流量卡办理| 熟女电影av网| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 黑人高潮一二区| 99热网站在线观看| av免费观看日本| 国产熟女午夜一区二区三区 | 少妇 在线观看| 在线免费观看不下载黄p国产| 两个人免费观看高清视频| 天天操日日干夜夜撸| 欧美少妇被猛烈插入视频| 久久精品国产亚洲网站| 国产在线免费精品| 成人国产av品久久久| 另类亚洲欧美激情| 少妇丰满av| 精品卡一卡二卡四卡免费| 精品亚洲成国产av| 高清黄色对白视频在线免费看| 久久久精品94久久精品| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲国产精品国产精品| 久久久久久久国产电影| 男女啪啪激烈高潮av片| 亚洲美女黄色视频免费看| 精品久久国产蜜桃| 色视频在线一区二区三区| 插阴视频在线观看视频| 另类精品久久| 日日啪夜夜爽| 日韩欧美一区视频在线观看| 国产不卡av网站在线观看| 高清午夜精品一区二区三区| 99视频精品全部免费 在线| 欧美日韩在线观看h| 成人国语在线视频| 亚洲国产精品一区三区| 免费观看的影片在线观看| 美女国产高潮福利片在线看| 日韩亚洲欧美综合| 国产乱来视频区| 我要看黄色一级片免费的| 男女高潮啪啪啪动态图| 一级毛片电影观看| 久久影院123| 午夜福利视频精品| videossex国产| 欧美性感艳星| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| www.色视频.com| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 久久亚洲国产成人精品v| 久久久a久久爽久久v久久| 久热这里只有精品99| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 视频区图区小说| 青青草视频在线视频观看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 久久狼人影院| 欧美亚洲日本最大视频资源| 涩涩av久久男人的天堂| 国产成人freesex在线| 国产精品.久久久| 精品人妻偷拍中文字幕| 成人国产av品久久久| 中文天堂在线官网| av专区在线播放| 九九爱精品视频在线观看| 飞空精品影院首页| videos熟女内射| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲av男天堂| 久久韩国三级中文字幕| 欧美成人精品欧美一级黄| 五月开心婷婷网| 一级片'在线观看视频| 简卡轻食公司| 在线精品无人区一区二区三| 一级毛片 在线播放| 在线 av 中文字幕| 91精品一卡2卡3卡4卡| 亚洲精品亚洲一区二区| 婷婷色综合www| 秋霞伦理黄片| 成人国产麻豆网| 下体分泌物呈黄色| 黑丝袜美女国产一区| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 乱码一卡2卡4卡精品| 中文天堂在线官网| 99久久综合免费| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 黄片无遮挡物在线观看| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 精品一区二区三卡| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 精品久久久久久久久av| 在线观看人妻少妇| av有码第一页| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产免费一级a男人的天堂| 成人漫画全彩无遮挡| 久热久热在线精品观看| 色94色欧美一区二区| 97在线视频观看| 特大巨黑吊av在线直播| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 最近手机中文字幕大全| 日韩成人伦理影院| 成人国语在线视频| 熟妇人妻不卡中文字幕| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 最近中文字幕高清免费大全6| 亚洲av在线观看美女高潮| 人妻夜夜爽99麻豆av| 日本av手机在线免费观看| 老熟女久久久| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 日本黄色日本黄色录像| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲不卡免费看| 久久久亚洲精品成人影院| 高清不卡的av网站| kizo精华| 一本色道久久久久久精品综合| 三级国产精品片| 成人免费观看视频高清| 黄片播放在线免费| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 久久久久视频综合| 99热这里只有精品一区| 中文欧美无线码| videossex国产| 国产伦理片在线播放av一区| 国产精品人妻久久久影院| 性色av一级| 亚洲第一区二区三区不卡| 日本av手机在线免费观看| 老女人水多毛片| 成人黄色视频免费在线看| 日韩亚洲欧美综合| 高清午夜精品一区二区三区| 人人澡人人妻人| 精品一区二区三卡| 国产一区二区在线观看av| 亚洲五月色婷婷综合| 99视频精品全部免费 在线| 天美传媒精品一区二区| 青春草视频在线免费观看| 看非洲黑人一级黄片| 日本欧美国产在线视频| 99视频精品全部免费 在线| xxxhd国产人妻xxx| 成人午夜精彩视频在线观看| 精品一区二区免费观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 一级,二级,三级黄色视频| 亚洲欧美清纯卡通| 国产欧美亚洲国产| 免费大片18禁| 另类亚洲欧美激情| 夫妻午夜视频| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲美女黄色视频免费看| 曰老女人黄片| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲高清免费不卡视频| 国产在线视频一区二区| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 草草在线视频免费看| 免费看av在线观看网站| 亚洲精品,欧美精品| 亚洲四区av| 国产色婷婷99| 视频在线观看一区二区三区| 十分钟在线观看高清视频www| 免费人成在线观看视频色| 日韩人妻高清精品专区| 男女高潮啪啪啪动态图| 自线自在国产av| 我的老师免费观看完整版| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产精品熟女久久久久浪| 国产爽快片一区二区三区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 色哟哟·www| 亚洲国产精品国产精品| 永久免费av网站大全| 有码 亚洲区| 成年av动漫网址| av.在线天堂| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产乱来视频区| 精品人妻在线不人妻| 母亲3免费完整高清在线观看 | 三上悠亚av全集在线观看| 国产欧美亚洲国产| 色5月婷婷丁香| 考比视频在线观看| 在线天堂最新版资源| 国产男人的电影天堂91| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲精品一区蜜桃| 国产成人精品在线电影| 成人国语在线视频| 久久久久网色| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久免费观看电影| 在现免费观看毛片| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 热re99久久国产66热| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 我的女老师完整版在线观看| 91成人精品电影| 亚洲av成人精品一二三区| 性色av一级| freevideosex欧美| 欧美xxxx性猛交bbbb| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产亚洲精品久久久com| 国产av精品麻豆| 亚洲高清免费不卡视频| 97超碰精品成人国产| 国产精品国产三级专区第一集| 国产成人av激情在线播放 | 亚洲无线观看免费| 日韩三级伦理在线观看| 一级黄片播放器| 全区人妻精品视频| 亚洲国产精品一区三区| 久久久国产欧美日韩av| 精品一区在线观看国产| 国产精品久久久久久精品电影小说| 日韩成人伦理影院| 色吧在线观看| 简卡轻食公司| 亚洲无线观看免费| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| av不卡在线播放| 亚洲久久久国产精品| 日韩三级伦理在线观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| .国产精品久久| 男女边吃奶边做爰视频| 涩涩av久久男人的天堂| 国产黄频视频在线观看| 国产片内射在线| 少妇精品久久久久久久| 永久网站在线| a级毛片免费高清观看在线播放| 18禁观看日本| av网站免费在线观看视频| 久久久久久久精品精品| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 精品一区二区三卡| 久久热精品热| 毛片一级片免费看久久久久| 国产深夜福利视频在线观看| 欧美日韩视频精品一区| 成年人午夜在线观看视频| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 欧美少妇被猛烈插入视频| tube8黄色片| av免费观看日本| a级毛片黄视频| 亚洲经典国产精华液单| 国产精品免费大片| 欧美亚洲日本最大视频资源| 熟女电影av网| 一级a做视频免费观看| 亚洲人与动物交配视频| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲综合色惰| 久久青草综合色| videos熟女内射| 插逼视频在线观看| 美女国产视频在线观看| 老司机影院成人| 国产精品人妻久久久久久| 少妇人妻 视频| 熟女人妻精品中文字幕| 久久鲁丝午夜福利片| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 亚洲精品av麻豆狂野| 成年女人在线观看亚洲视频| 多毛熟女@视频| 日韩在线高清观看一区二区三区| 丰满乱子伦码专区| 亚洲精品一二三| 久久ye,这里只有精品| 国产成人午夜福利电影在线观看| 一级片'在线观看视频| 99热这里只有精品一区| 制服诱惑二区| 久久精品国产自在天天线| 久久久亚洲精品成人影院| 中国国产av一级| 久热久热在线精品观看| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 精品人妻在线不人妻| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲少妇的诱惑av| 少妇被粗大猛烈的视频| 妹子高潮喷水视频| av在线观看视频网站免费| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲经典国产精华液单| 国产精品久久久久久av不卡| 看免费成人av毛片| 久久99热这里只频精品6学生| 熟女av电影| 久久ye,这里只有精品| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产精品偷伦视频观看了| 性色avwww在线观看| 成人免费观看视频高清| 国产高清国产精品国产三级| 日日啪夜夜爽| 两个人的视频大全免费| 国产av国产精品国产| 嘟嘟电影网在线观看| 久久亚洲国产成人精品v| 日日撸夜夜添| 免费日韩欧美在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 一本大道久久a久久精品| 欧美精品一区二区大全| 精品人妻熟女av久视频| 成人手机av| 超碰97精品在线观看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 免费观看在线日韩| 22中文网久久字幕| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 51国产日韩欧美| 欧美日韩综合久久久久久| 搡老乐熟女国产| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲av日韩在线播放| 亚洲情色 制服丝袜| av在线老鸭窝| 街头女战士在线观看网站| 热re99久久国产66热| 99久久人妻综合| 七月丁香在线播放| 在线观看一区二区三区激情| 在线观看国产h片| 91精品三级在线观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 久久99一区二区三区| 亚洲精品第二区| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 91精品国产九色| 桃花免费在线播放| 国产午夜精品一二区理论片| 在线观看国产h片| 女人久久www免费人成看片| 热re99久久国产66热| 亚洲av日韩在线播放| 曰老女人黄片| av免费观看日本| 国产在线一区二区三区精| 高清av免费在线| 午夜激情福利司机影院| 街头女战士在线观看网站| 纯流量卡能插随身wifi吗| 亚洲av.av天堂| av视频免费观看在线观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲精品国产av成人精品| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产成人aa在线观看| 如日韩欧美国产精品一区二区三区 | 老女人水多毛片| 激情五月婷婷亚洲| 日本黄色日本黄色录像| 亚洲精品国产av成人精品| 午夜福利网站1000一区二区三区| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产高清三级在线| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 久久国产精品大桥未久av| 熟女人妻精品中文字幕| 99热国产这里只有精品6| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 婷婷成人精品国产| 各种免费的搞黄视频| 热99久久久久精品小说推荐| 嫩草影院入口| 伊人亚洲综合成人网| 免费看av在线观看网站| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| tube8黄色片| 大码成人一级视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 成人二区视频| 精品久久蜜臀av无| 国产精品不卡视频一区二区| 午夜老司机福利剧场| 人妻夜夜爽99麻豆av| 香蕉精品网在线| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 久久久欧美国产精品| 国产av国产精品国产| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 水蜜桃什么品种好| 日韩中字成人| 日韩视频在线欧美| 视频中文字幕在线观看| 欧美最新免费一区二区三区| 欧美精品亚洲一区二区| 日韩伦理黄色片| 亚洲国产精品国产精品| 夫妻午夜视频| 大香蕉久久网| 日本欧美国产在线视频| 日本色播在线视频| 一级爰片在线观看| 青春草亚洲视频在线观看| 黄色一级大片看看| 精品一区二区三区视频在线| 少妇丰满av| 精品人妻在线不人妻| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 日韩人妻高清精品专区| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 99热网站在线观看| 成人综合一区亚洲| 男女高潮啪啪啪动态图| 伦精品一区二区三区| 中文字幕av电影在线播放| 色网站视频免费| 一级毛片我不卡| 全区人妻精品视频| 国产精品嫩草影院av在线观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| a级毛色黄片| 超色免费av| 美女视频免费永久观看网站| www.色视频.com| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲欧洲日产国产| 秋霞伦理黄片| 97在线视频观看| 中文字幕久久专区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 2021少妇久久久久久久久久久| 国产精品.久久久| 国产精品一区二区在线不卡| 尾随美女入室| 18禁在线播放成人免费| 高清视频免费观看一区二区| 日本av手机在线免费观看| 欧美人与善性xxx| 成人漫画全彩无遮挡| 久久久欧美国产精品| av天堂久久9| 国产一区二区三区综合在线观看 | 热99国产精品久久久久久7| 日韩人妻高清精品专区| 啦啦啦啦在线视频资源| 又大又黄又爽视频免费| 婷婷成人精品国产| 七月丁香在线播放| 国产成人午夜福利电影在线观看| 久久午夜福利片| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 国产色爽女视频免费观看| 一级二级三级毛片免费看| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲av综合色区一区| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 久久亚洲国产成人精品v| 99九九在线精品视频| 超色免费av| 日韩视频在线欧美| 免费观看无遮挡的男女| 国产精品 国内视频| 丁香六月天网| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产黄色免费在线视频| 乱人伦中国视频| 视频中文字幕在线观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久久久久久久久久丰满| 桃花免费在线播放| 两个人免费观看高清视频| 久久久久久久精品精品| 看十八女毛片水多多多| 精品久久久精品久久久| 插逼视频在线观看| 午夜福利影视在线免费观看| 九九在线视频观看精品| 久久久久国产精品人妻一区二区| 制服诱惑二区|