先天性巨結(jié)腸患兒不同腸管中SOX-2、SOX-10、GDNF的表達(dá)及其臨床意義*

龐文帥，馬建蘇，劉曉麗，周麗霞，王博，王淼

（邢臺(tái)市人民醫(yī)院，河北 刑臺(tái)054031）

先天性巨結(jié)腸，又稱希爾施普龍?。╤irschsprungs disease,HD）是新生兒常見(jiàn)的先天性發(fā)育停頓疾病，發(fā)病率約為1/5 000，男性發(fā)病率高于女性，為4∶1[1]。病理變化主要是直腸、結(jié)腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如，表現(xiàn)為新生兒出生后胎糞排出延遲、腹脹、結(jié)腸炎、低位性腸梗阻等，不僅影響患兒的生長(zhǎng)發(fā)育，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)危及患兒生命[2]。近年來(lái)流行病學(xué)調(diào)查顯示，HD 的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[3]，因此研究HD 的病因及機(jī)制對(duì)優(yōu)生優(yōu)育十分重要。目前HD 的病因和機(jī)制雖然尚未完全闡明，但隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)有的研究已明確顯示，HD 的發(fā)生與SOX-2、SOX-10、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（glial cell line-derived meurotrophic factor,GDNF）密切相關(guān)[4-5]。本研究運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)SOX-2、SOX-10、GDNF 在HD 患兒狹窄段、擴(kuò)張段、移行段腸管組織及非HD 患兒結(jié)腸中的表達(dá)情況，旨在闡明其在HD 中的作用，進(jìn)一步探討HD 在分子基礎(chǔ)上的發(fā)病機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月—2019年8月邢臺(tái)市人民醫(yī)院手術(shù)治療的HD 患兒85 例作為HD 組，其中，男性71 例，女性14 例，年齡2 個(gè)月～7 歲，平均（3.7±0.6）歲。患兒術(shù)后均經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診為HD。其中，常見(jiàn)型62 例，短段型23 例；患兒均無(wú)HD家族史，均為散發(fā)性，均未合并其他器官先天性畸形。取HD 患兒切除的狹窄段、擴(kuò)張段、移行段組織作為HD 各腸段組，同期選取行結(jié)腸造瘺術(shù)的患兒20 例作為對(duì)照組，其中，男性16 例，女性4 例，年齡4 個(gè)月～6 歲，平均（3.9±0.7）歲，分別為先天性直腸肛管畸形16 例，肛門直腸損傷4 例。兩組患兒年齡、性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 顯微觀察及測(cè)量取HE 染色切片，觀察對(duì)照組、HD 組狹窄段、HD 組擴(kuò)張段、HD 組移行段肌間神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目，用顯微測(cè)量軟件測(cè)量腸肌間神經(jīng)叢直徑、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞直徑、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞質(zhì)/核，每張切片隨機(jī)采集3 個(gè)400 倍視野，錄入Excel 表格，計(jì)算各組平均值。

1.2.2 qRT-PCR取全層腸壁組織，棄去黏膜，用無(wú)菌生理鹽水沖洗后置于Ep 管中，于-80℃冰箱中保存。提取總RNA：檢測(cè)時(shí)取腸組織200 mg，加入1 ml Trizol 后置于冰水上的勻漿器中研磨，按說(shuō)明書步驟提取總RNA。引物設(shè)計(jì)：采用Primer 5.0設(shè)計(jì)，SOX-2、SOX-10、GDNF引物序列見(jiàn)表1。

表1 SOX-2、SOX-10、GDNF引物序列

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA按Fermentas RT-PCR 試劑盒說(shuō)明書操作步驟操作，對(duì)提取的mRNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為RNA 模版2 μl，Oligo（dT）1 μl，逆轉(zhuǎn)錄酶1 μl，5×Buffer 5 PL，dNTP 2 μl，Ribalock抑制劑1 μl，RNase free H2O 調(diào)整總體積至20 μl，GDNF 反應(yīng)條件為70℃預(yù)變性5 min，37℃變性5 min，42℃退火60 min，70℃延伸10 min，共32 個(gè)循環(huán)。SOX-2、SOX-10 反應(yīng)條件為65℃預(yù)變性5 min，42℃變性60 min，70℃退火10 min，共45 個(gè)循環(huán)。PCR 檢測(cè)：引物通過(guò)GenBank 查找SOX-2、SOX-10、GDNF 的mRNA 序列，計(jì)算機(jī)自動(dòng)輸出每個(gè)cDNA 模版標(biāo)本的擴(kuò)增曲線、CT 值和拷貝數(shù)。

1.3 觀察指標(biāo)

比較對(duì)照組、HD 組狹窄段、HD 組擴(kuò)張段和HD 組移行段肌間神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)、肌間神經(jīng)叢直徑、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞直徑、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞質(zhì)/核；比較對(duì)照組、HD 組狹窄段、HD 組擴(kuò)張段和HD 組移行段SOX-2、SOX-10、GDNF mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腸肌間神經(jīng)叢直徑等相關(guān)指標(biāo)比較

各組肌間神經(jīng)叢直徑、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞直徑、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞質(zhì)/核比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。其中，腸肌間神經(jīng)叢直徑：HD 組狹窄段＜HD 組移行段＜HD 組擴(kuò)張段和對(duì)照組；神經(jīng)節(jié)細(xì)胞直徑、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞質(zhì)/核比：HD 組移行段＜HD 組擴(kuò)張段和對(duì)照組。見(jiàn)表2。

表2 對(duì)照組與HD組各腸段肌間神經(jīng)叢直徑，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)、直徑、質(zhì)/核情況 （±s）

表2 對(duì)照組與HD組各腸段肌間神經(jīng)叢直徑，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)、直徑、質(zhì)/核情況 （±s）

注：HD組狹窄段神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如。①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與HD組擴(kuò)張段比較，P ＜0.05。

組別對(duì)照組HD組擴(kuò)張段HD組移行段HD組狹窄段F 值P 值n 20 85 85 85肌間神經(jīng)叢直徑/μm 58.67±11.72 57.13±10.86 34.28±7.63①②30.59±6.24 11.073 0.000神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)/個(gè)5.72±1.16 5.62±1.24 1.86±0.32①②-24.637 0.000神經(jīng)節(jié)細(xì)胞直徑/μm 16.57±3.61 16.02±3.52 11.82±2.76①②-19.286 0.000神經(jīng)節(jié)細(xì)胞質(zhì)/核2.33±0.43 2.20±0.51 1.60±0.33①②-29.763 0.000

2.2 各組SOX-2、SOX-10、GDNF mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較

各組SOX-2、SOX-10、GDNF mRNA 相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較，HD 組狹窄段＜HD 組移行段＜HD 組擴(kuò)張段和對(duì)照組（P＜0.05）。對(duì)照組與HD組擴(kuò)張段比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 對(duì)照組與HD組各腸段SOX-2、SOX-10、GDNF mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

表3 對(duì)照組與HD組各腸段SOX-2、SOX-10、GDNF mRNA的相對(duì)表達(dá)量比較 （±s）

注：①與對(duì)照組比較，P ＜0.05；②與HD組擴(kuò)張段比較，P ＜0.05；③與HD組移行段比較，P ＜0.05。

組別對(duì)照組HD組擴(kuò)張段HD組移行段HD組狹窄段F 值P 值n 20 85 85 85 SOX-2 mRNA 33.69±7.85 32.84±6.29 31.13±7.05①②30.04±5.42①②③9.672 0.000 SOX-10 mRNA 1.34±0.28 1.33±0.36 1.30±0.34①②1.08±0.26①②③8.054 0.000 GDNF mRNA 1.31±0.21 1.19±0.18 0.89±0.13①②0.68±0.11①②③11.072 0.000

3 討論

HD 是常見(jiàn)的先天性畸形之一,有研究顯示，HD 的病因與腸神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移形成腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system,ENS）的過(guò)程異常有關(guān)[6-8]。ENS 由致密的神經(jīng)纖維將特殊的膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞相互連接,組成一個(gè)獨(dú)立完整的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，對(duì)腸道的血液循環(huán)、蠕動(dòng)、吸收等進(jìn)行調(diào)節(jié)[9]。本研究運(yùn)用顯微測(cè)量的方法測(cè)量對(duì)照組，HD 組狹窄段、擴(kuò)張段和移行段肌間神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)、肌間神經(jīng)叢直徑、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞直徑、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞質(zhì)/核，結(jié)果顯示，腸肌間神經(jīng)叢直徑：HD 組狹窄段＜HD組移行段＜HD 組擴(kuò)張段和對(duì)照組；神經(jīng)節(jié)細(xì)胞直徑、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞質(zhì)/核：HD 組移行段＜HD 組擴(kuò)張段和對(duì)照組。說(shuō)明HD 患兒部分腸段神經(jīng)節(jié)細(xì)胞缺如，導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育停頓,但原因迄今未明。

Dom SOX-10是雜合子動(dòng)物中唯一被認(rèn)識(shí)的產(chǎn)生致死性ENS 表型的突變基因，其可改變正常讀碼框，導(dǎo)致一種截?cái)嗟牡鞍桩a(chǎn)物[10-11]。近年來(lái)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，在顯性巨結(jié)腸突變大鼠中SOX-10基因缺乏，導(dǎo)致ENS 發(fā)育停頓，可能是神經(jīng)嵴細(xì)胞突變后在移行早期過(guò)量死亡所致[12-14]。由此可見(jiàn)SOX-10基因可能參與腸神經(jīng)元的發(fā)育。本研究結(jié)果顯示，各組SOX-10 mRNA 相對(duì)表達(dá)量有差異。其中HD 組狹窄段SOX-10 mRNA 相對(duì)表達(dá)量低于HD 組移行段；HD 組狹窄段和移行段均低于HD 組擴(kuò)張段和對(duì)照組。對(duì)照組、HD 組擴(kuò)張段SOX-10 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量無(wú)差異。說(shuō)明SOX-10 mRNA在病變腸段中表達(dá)逐漸減少，特別是在無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的狹窄腸段中表達(dá)減少得更加明顯，分析原因由于狹窄腸管內(nèi)缺乏正常表達(dá)SOX-10 mRNA 的肌間神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，可能在HD 患兒腸管狹窄段中存在能被SOX-10 處理的乙酞膽堿醋酶受體或神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，從而刺激無(wú)神經(jīng)節(jié)細(xì)胞腸管中的其他興奮性神經(jīng)纖維生長(zhǎng)，致神經(jīng)纖維異常增生引起腸管狹窄痙攣和腸功能障礙[15-17]。同時(shí)也說(shuō)明SOX-10可能是維持腸神經(jīng)功能的重要基因。

SOX-2 分子量約為35 kD，是多潛能性干細(xì)胞標(biāo)志物，其轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域?yàn)镃 末端，包含一段富含核苷酸的序列，SOX-2與SOX-10一樣，均為SOX基因家族成員。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，不僅在生殖細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞中表達(dá)，而且在正常腸道神經(jīng)嵴細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞衍生物中均廣泛表達(dá)[18-20]，并參與廣泛的發(fā)育調(diào)節(jié)。本研究結(jié)果顯示，SOX-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量為狹窄段＜移行段＜擴(kuò)張段。原因可能為SOX-2 呈低表達(dá)時(shí)，不能很好地發(fā)揮發(fā)育調(diào)節(jié)作用，所以導(dǎo)致腸管狹窄。GDNF 是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）2B 超家族的新亞族，是REX 的配基之一[21-23]。既往研究認(rèn)為GDNF 的突變不足以引發(fā)HD，但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，REX 基因突變是HD 眾多基因突變之一[18]。GDNF 對(duì)胃腸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、周圍自主神經(jīng)、感覺(jué)神經(jīng)等多種神經(jīng)元均有營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)作用，與多種神經(jīng)元的分化和生存支持有關(guān)[24]。胡曉麗等[25]應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)HD 患兒狹窄段、移行段和擴(kuò)張段GDNF 分布，結(jié)果顯示狹窄段GDNF 分布明顯少于移行段和擴(kuò)張段。本研究從轉(zhuǎn)錄水平研究HD 患兒不同腸段GDNF mRNA 的表達(dá)，結(jié)果顯示，狹窄段＜移行段＜擴(kuò)張段。與胡曉麗等結(jié)果基本相符，提示SOX-2、GDNF、SOX-10 可能參與了ENS 發(fā)育。

綜上所述，HD 的發(fā)生可能與多種基因一起導(dǎo)致病變腸段SOX-2、SOX-10等基因突變后，SOX-2、SOX-10、GDNF 表達(dá)減少有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，HD患兒病變腸管組織SOX-2、SOX-10、GDNF mRNA 相對(duì)表達(dá)量擴(kuò)張段、移行段、狹窄段逐漸降低，說(shuō)明SOX-2、SOX-10、GDNF可能是維持腸神經(jīng)系統(tǒng)功能正常的必要基因，如果上述基因表達(dá)降低，則可能引起腸管狹窄出現(xiàn)功能障礙，但上述基因在HD 發(fā)生中的作用尚有待進(jìn)一步研究。