基于纖維骨架空間統(tǒng)計(jì)方法對(duì)雷特綜合征患兒腦白質(zhì)結(jié)構(gòu)與疾病嚴(yán)重度和發(fā)育水平的病例對(duì)照研究

李冬蘊(yùn) 李慧萍 朱國(guó)青 張 穎 魯 萍 張凱峰 喬中偉 徐 瓊 徐 秀

雷特綜合征(RTT; OMIM 312750)是一種X染色體連鎖顯性遺傳性神經(jīng)發(fā)育障礙，病因復(fù)雜且機(jī)制不明，癥狀重且預(yù)后極差，缺乏有效治療方法。典型RTT患兒中，95%由MECP2基因突變或缺失導(dǎo)致。在細(xì)胞水平研究中發(fā)現(xiàn)，MECP2缺陷神經(jīng)元表現(xiàn)出樹(shù)突形態(tài)發(fā)生受損和樹(shù)突棘密度減低，這些結(jié)構(gòu)缺陷可能與突觸傳遞和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)活動(dòng)改變有關(guān)[1, 2]。Mecp2基因敲除小鼠模型大腦神經(jīng)元體積減少且更加密集成團(tuán)，突觸數(shù)目減少，突觸復(fù)雜性降低，部分腦區(qū)存在自發(fā)性興奮性和抑制性比例失衡[3, 4]。有學(xué)者提出RTT的發(fā)病機(jī)制是突觸連接功能障礙導(dǎo)致神經(jīng)回路及連接受損[5-8]。病理解剖學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，RTT患者的大腦重量輕于正常對(duì)照組[9]，這種腦容量的降低并不是全腦范圍內(nèi)的，其中大腦左右半球的容量減低顯著多于小腦。有學(xué)者指出,在RTT患者大腦中發(fā)現(xiàn)的腦容量減少不是因?yàn)槟X萎縮所致[10]，而是因?yàn)闃?shù)突狀細(xì)胞分支化不良所致細(xì)胞衰減增加及神經(jīng)元連接障礙[9, 11～13]。

MR研究發(fā)現(xiàn)，RTT患者灰質(zhì)腦容量的減少呈區(qū)域性分布，多在枕葉及頂葉后部[14, 15]，大腦白質(zhì)容量呈整體性的減低[16]，因既往白質(zhì)研究方法多為肉眼觀察及手動(dòng)興趣區(qū)測(cè)量，故缺乏較為精確的白質(zhì)參數(shù)異常的腦區(qū)報(bào)道。彌散張量成像(DTI)可以通過(guò)測(cè)量組織內(nèi)水分子的擴(kuò)散能力及相關(guān)參數(shù)來(lái)反映白質(zhì)結(jié)構(gòu)及連接異常，是活體無(wú)創(chuàng)性研究白質(zhì)纖維的主要手段[16]。單一的某項(xiàng)白質(zhì)參數(shù)可能受髓鞘化程度、軸索密度、軸索直徑及纖維素在體素水平的連貫性影響，若想更為精準(zhǔn)地了解神經(jīng)病理機(jī)制，有必要對(duì)DTI掃描圖像獲得腦白質(zhì)纖維束的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行綜合分析，包括各向異性(FA)、平均彌散量(MD)、軸向彌散率(DA)和徑向彌散率(DR)[17]。本研究基于纖維骨架的空間統(tǒng)計(jì)學(xué)(TBSS)方法，提取重要的白質(zhì)纖維束骨架進(jìn)行精確配準(zhǔn)和比較，綜合RTT患兒的DTI多項(xiàng)參數(shù)指標(biāo)(FA、MD、DA、DR)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以更加準(zhǔn)確地對(duì)差異區(qū)定位，提高組間比較的精準(zhǔn)度，為解釋其神經(jīng)病理機(jī)制及臨床癥狀提供新的理論依據(jù)，為RTT的診斷及靶向治療提供新的線索。

1 方法

1.1 研究設(shè)計(jì) 病例對(duì)照研究。以符合典型RTT診斷且MECP2基因突變或缺失的患兒為病例組(RTT組)，以正常發(fā)育兒童為對(duì)照組(TD組)，基于TBSS分析白質(zhì)參數(shù)指標(biāo)與RTT嚴(yán)重度和發(fā)育水平的相關(guān)性。

1.2 倫理和知情同意 本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院(我院)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號(hào)：復(fù)兒倫審[2014125號(hào)]。RTT組患兒均以書(shū)面形式被告知本研究?jī)?nèi)容，并由監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書(shū)，TD組兒童由監(jiān)護(hù)人簽署MR檢查知情同意書(shū)。

1.3 典型RTT診斷標(biāo)準(zhǔn)[18]滿足以下4項(xiàng)主要癥狀，且此4項(xiàng)癥狀有一段倒退期，之后恢復(fù)或穩(wěn)定，①已習(xí)得的目的性手技能部分或完全喪失，②已習(xí)得的口語(yǔ)能力部分或完全喪失，③步態(tài)異常(能力受損或沒(méi)有能力)，④手刻板動(dòng)作，例如絞手/緊握手、拍手/輕敲手、吃手、洗手樣/搓手自動(dòng)癥；且排除：①繼發(fā)于創(chuàng)傷(圍生期或出生后)的腦損傷、神經(jīng)代謝性疾病或引起神經(jīng)系統(tǒng)異常的嚴(yán)重感染，②出生后6個(gè)月內(nèi)出現(xiàn)明顯的精神運(yùn)動(dòng)發(fā)育異常。

1.4 RTT組納入標(biāo)準(zhǔn) 同時(shí)滿足以下5項(xiàng)：①我院符合典型RTT診斷；②存在MECP2基因突變或缺失；③年齡 2～6歲；④行頭顱MR常規(guī)掃描；⑤行Griffith精神發(fā)育量表-中文版(GDS-C)測(cè)評(píng)[19]和RTT嚴(yán)重程度評(píng)分(RSSS)[20]。

1.5 TD組納入標(biāo)準(zhǔn) 同時(shí)滿足以下4項(xiàng)：①與病例組同期在我院兒?？苹蛏窠?jīng)內(nèi)科因主訴頭暈、頭痛就診并行頭顱MR平掃且未發(fā)現(xiàn)局灶性和彌漫性顱內(nèi)病變的女孩；②年齡 2～6歲；③告知本研究?jī)?nèi)容，取得家長(zhǎng)同意后，在我院行中國(guó)常模標(biāo)準(zhǔn)化丹佛發(fā)育篩查(DST)量表[21]篩查結(jié)果為正常；④排除有顱腦外傷、器質(zhì)性病變或神經(jīng)精神疾病。

1.6MECP2基因檢測(cè) RTT組血標(biāo)本處理、測(cè)序、變異分析和結(jié)果解讀均參照我院分子診斷中心建立的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析和臨床診斷流程2.0[22]。①基因測(cè)序：PCR擴(kuò)增檢測(cè)MECP2基因編碼區(qū)外顯子，比對(duì)序列為NM_004992.3。②基因組DNA多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)：使用P015C試劑盒(MRC-Holland,Amsterdam,Netherlands)檢測(cè)MECP2基因的拷貝數(shù)變異(基因缺失/重復(fù))。③全基因組芯片分析(array-CGH)：應(yīng)用Agilent aCGH4×180K定制芯片檢測(cè)全基因組范圍的基因組不平衡現(xiàn)象，參比序列為GRCh37/hg19。

1.7 行為評(píng)估 GDS-C、RSSS和DST測(cè)評(píng)均在我院兒童保健科完成，測(cè)評(píng)時(shí)間與MR檢查相距≤1個(gè)月。需要說(shuō)明的是，RSSS測(cè)評(píng)由3名兒童保健科醫(yī)生完成，保證RTT組每例患兒至少有2名醫(yī)生同時(shí)測(cè)評(píng)，即有2個(gè)RSSS測(cè)評(píng)結(jié)果，取其平均值。

1.7.1 GDS-C測(cè)評(píng) 對(duì)GDS-C的5個(gè)能區(qū)(ADQ：運(yùn)動(dòng)能區(qū)發(fā)育商，BDQ：個(gè)人-社會(huì)能區(qū)發(fā)育商，CDQ：聽(tīng)力-語(yǔ)言能區(qū)發(fā)育商，DDQ：手眼協(xié)調(diào)能區(qū)發(fā)育商，EDQ：表現(xiàn)能區(qū)發(fā)育商)的發(fā)育情況進(jìn)行測(cè)評(píng)；發(fā)育商(DQ)=發(fā)育齡/實(shí)際年齡×100。

1.7.2 RSSS測(cè)評(píng) 對(duì)7種臨床表現(xiàn)(抽搐發(fā)作頻率及控制情況、呼吸異常、脊柱側(cè)彎、行走能力、手的功用、語(yǔ)言能力、睡眠)進(jìn)行嚴(yán)重程度評(píng)分，每種臨床表現(xiàn)按照從輕至重的詳細(xì)癥狀描述賦0～3分。

1.7.3 DST測(cè)評(píng) 采用中國(guó)常模標(biāo)準(zhǔn)化的“0～6歲兒童智能發(fā)育篩查測(cè)驗(yàn)”量表對(duì)運(yùn)動(dòng)、社會(huì)適應(yīng)及智能3個(gè)能區(qū)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，結(jié)果以DQ表示。

1.8 MR檢查

1.8.1 設(shè)備和參數(shù)設(shè)置 統(tǒng)一使用我院放射科GE Discovery MR750 3.0T MR機(jī)，頭顱32通道矩陣線圈，掃描序列為DTI序列(SE-EPI)。配合檢查者，直接行MR掃描；不能配合檢查者，檢查前于我院鎮(zhèn)靜中心在醫(yī)生監(jiān)管下口服10%水合氯醛(50 mg·kg-1)，待其熟睡后行影像學(xué)檢查。DTI SE-EPI序列掃描參數(shù)：TR 4 600 ms，TE 87.4 ms，F(xiàn)OV 240 mm，矩陣 128×128，像素2mm×2mm×4 mm，間距0，b值分別為0、1 000 s·mm-2，彌散敏感梯度方向?yàn)?5個(gè)。

1.8.2 影像數(shù)據(jù)預(yù)處理 ①格式轉(zhuǎn)換：將圖像原始Dicom格式轉(zhuǎn)換為nii格式，使用MRIcron軟件(www.mricro.com)檢查圖像質(zhì)量，剔除偽影、錯(cuò)層等缺陷的被試。②頭動(dòng)和渦流校正：使用FSL軟件[23]中的FDT工具包對(duì)DTI圖像進(jìn)行頭動(dòng)校正和渦流校正，提取B0圖，使用BET工具包去頭皮、提取大腦信息(閾值=0.4)。③計(jì)算彌散張量：使用DTIFit工具包計(jì)算得到DTI圖像的相關(guān)參數(shù)，包括FA、MD、DA和DR，并生成相應(yīng)每個(gè)被試的參數(shù)圖。

1.8.3 TBSS ①非線性配準(zhǔn)：通過(guò)FSL軟件，使用非線性配準(zhǔn)算法將每個(gè)被試的數(shù)據(jù)配準(zhǔn)到目標(biāo)模板，后對(duì)齊至MNI標(biāo)準(zhǔn)空間，檢查每個(gè)被試FA圖像，保證準(zhǔn)確配準(zhǔn)。②提取白質(zhì)骨架：將所有配準(zhǔn)的被試FA圖制作平均FA模板，計(jì)算并提取白質(zhì)纖維骨架，F(xiàn)A閾值設(shè)定為0.2，將每個(gè)被試白質(zhì)纖維配準(zhǔn)到平均FA模板纖維骨架上，提取得到每個(gè)個(gè)體的FA纖維骨架圖，并分別疊加在各自的結(jié)構(gòu)像上，空間位置坐標(biāo)轉(zhuǎn)換至MNI標(biāo)準(zhǔn)空間解剖定位。體素值：是指具有顯著性差異的團(tuán)塊的大小，是包含有多少個(gè)體素的大小。體素峰值坐標(biāo)：是指t值最大的位點(diǎn)的MNI坐標(biāo)系坐標(biāo)值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 人口統(tǒng)計(jì)學(xué)和臨床數(shù)據(jù)使用統(tǒng)計(jì)軟件包 SPSS 20.0分析。TBSS數(shù)據(jù)分析先將FA、MD、DA、DR值的組間差異通過(guò)非參數(shù)置換檢驗(yàn)進(jìn)行分析，組間數(shù)據(jù)使用無(wú)閾限的團(tuán)塊增強(qiáng)處理(TFCE)的置換檢驗(yàn)，之后組間再行事后t檢驗(yàn)，年齡、DQ和腦容量作為協(xié)變量，顯著性水平設(shè)置為P<0.05(FDR 校正)。白質(zhì)參數(shù)異常區(qū)域在每個(gè)被試中提取相應(yīng)參數(shù)，采用多元線性回歸分析評(píng)價(jià)RTT白質(zhì)異常腦區(qū)參數(shù)值與RSSS得分及GDS-C各能區(qū)DQ值的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 2014年6月至2021年6月符合本文RTT組納入標(biāo)準(zhǔn)22例，符合TD組納入和排除標(biāo)準(zhǔn)23例，均為女童，兩組年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。RTT組RSSS 測(cè)評(píng)5.5±1.3、GDS-C總DQ為15.8±6.8，其中ADQ為30.2±10.6、BDQ為14.6±9.1、CDQ為15±7.7、DDQ為9.9±6.2、EDQ為9.2±3.9。TD組DST測(cè)評(píng)總DQ為103±7(94～118)。表1顯示白質(zhì)參數(shù)總體結(jié)果，F(xiàn)A值RTT組低于TD組，MD值和DR值RTT組高于TD組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；DA值兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 兩組年齡和總體白質(zhì)參數(shù)比較

2.2 兩組基于TBSS的白質(zhì)參數(shù)值比較 表2和圖1顯示，RTT組較TD組FA值減低的纖維束主要包括：胼胝體的輻射線額部(從胼胝體前方膝部傳入額葉的部分)及胼胝體壓部(胼胝體后側(cè)的部分)、雙側(cè)上縱束、左側(cè)下縱束、內(nèi)囊后肢及鉤形束(額葉眶皮質(zhì)和海馬、杏仁體的聯(lián)合纖維束)。RTT組較TD組MD值升高的纖維束主要位于胼胝體體部(胼胝體中間主體部分)。RTT組較TD組DR值升高的纖維束主要包括：胼胝體膝部(胼胝體前方部分)和壓部及右側(cè)矢狀層。RTT組較TD組DA值升高的纖維束主要位于胼胝體體部和壓部。需要說(shuō)明的是，兩組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的纖維束無(wú)法標(biāo)注具體體素和坐標(biāo)。

2.3 RTT組白質(zhì)參數(shù)異常區(qū)域與RSSS測(cè)評(píng)分及GDS-C能區(qū)DQ值的相關(guān)性 表3顯示，RTT的RSSS得分與胼胝體輻射線額部和左側(cè)上縱束的FA值呈負(fù)相關(guān)，與胼胝體體部MD值、DR值和DA值呈正相關(guān)。內(nèi)囊后肢FA值與GDS-C總DQ、A～E能區(qū)的DQ均呈正相關(guān)。右側(cè)矢狀層DR值與GDS-C總DQ、A～E能區(qū)的DQ均呈負(fù)相關(guān)。

表2 兩組基于TBSS方法比較參數(shù)值差異的白質(zhì)纖維分布

圖1 雷特綜合征組相對(duì)于正常發(fā)育對(duì)照組

3 討論

本研究利用MR的DTI成像結(jié)合TBSS分析技術(shù)，提取重要的白質(zhì)纖維束骨架進(jìn)行精確配準(zhǔn)和比較，更加準(zhǔn)確地進(jìn)行組間比較及纖維束定位。本文發(fā)現(xiàn)，在RTT患兒中，胼胝體的輻射線額部和壓部、雙側(cè)上縱束、左側(cè)下縱束、內(nèi)囊后肢及鉤形束的FA值明顯減少，胼胝體體部MD值明顯升高，胼胝體膝部和壓部的DR和DA值均升高。在成熟障礙和發(fā)育異常的大腦中，DTI的各項(xiàng)參數(shù)會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的變化。FA值反映的是水分子各向異性成分占整個(gè)彌散張量的比例，間接反映白質(zhì)纖維束的完整性，F(xiàn)A值減低提示纖維束完整性下降；MD值反映的是分子整體彌散水平，升高可能提示退行性改變導(dǎo)致的細(xì)胞膜密度減低；DR值升高可能提示退行性改變導(dǎo)致的髓鞘完整性被破壞，這種病理機(jī)制使晚髓鞘化的纖維束(如額葉纖維束、胼胝體膝部)較早受到損害；DA值異常提示軸索完整性被破壞[24]。

表3 RTT組白質(zhì)參數(shù)異常區(qū)域與RSSS測(cè)評(píng)分及GDS-C能區(qū)DQ值的相關(guān)性分析

胼胝體是大腦兩半球間最主要纖維連接集合體，其髓鞘化異?？赡荛g接反映RTT患兒存在左右腦連接不良。本研究結(jié)果還顯示RTT組的上下縱束、內(nèi)囊后肢及鉤形束均存在FA值顯著性下降。上下縱束主要連接同一側(cè)大腦半球內(nèi)的額葉、枕葉和顳葉；內(nèi)囊后肢包含基底節(jié)連接至額葉、顳葉、頂葉纖維束；鉤形束是邊緣系統(tǒng)主要連接額葉眶皮質(zhì)和海馬、杏仁體的聯(lián)合纖維束[28]。這些結(jié)果可能均提示RTT兒童不但存在左右腦之間的連接不良，同時(shí)存在同一側(cè)各腦區(qū)間連接不良，即廣泛的大腦連接不良，但仍需網(wǎng)絡(luò)連接的直接證據(jù)證實(shí)該假說(shuō)。

本研究提示，RTT患兒的內(nèi)囊后肢FA值及右側(cè)矢狀層DR值與GDS-C總DQ及各能區(qū)DQ均呈顯著性相關(guān)。內(nèi)囊后肢纖維束及矢狀層纖維束主要由連接基底節(jié)和腦干等皮層下結(jié)構(gòu)與大腦皮層的感知覺(jué)傳導(dǎo)纖維組成[29, 30]。研究發(fā)現(xiàn)，皮層下-皮層環(huán)路主要參與了認(rèn)知功能的發(fā)育，多種神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病與皮層下-皮層環(huán)路的結(jié)構(gòu)及連接異常相關(guān)[31, 32]。在ASD患兒中，影像學(xué)研究發(fā)現(xiàn)皮層下區(qū)域(如基底節(jié)和小腦)與大腦皮層區(qū)域存在代謝產(chǎn)物異常、結(jié)構(gòu)及功能連接異常[33, 34]。近期在Mecp2基因敲除小鼠模型中，研究者同時(shí)發(fā)現(xiàn)在皮層下(主要包括基底節(jié)及相關(guān)白質(zhì)纖維束)和皮層部分腦區(qū)均有結(jié)構(gòu)異常，且這些結(jié)構(gòu)異常與小鼠的行為學(xué)及表型改變相關(guān)[35]。本研究結(jié)果與該結(jié)論較為一致，提示在RTT患兒中可能也存在多種神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病與皮層下-皮層環(huán)路的結(jié)構(gòu)及連接異常，但仍需進(jìn)一步行腦網(wǎng)絡(luò)研究，以得到支持該環(huán)路功能受損的直接證據(jù)。

本研究樣本量較少，未來(lái)多中心大樣本的縱向研究尤為重要，對(duì)RTT患兒的臨床表現(xiàn)、合并癥、嚴(yán)重程度、發(fā)育情況、結(jié)構(gòu)MR指標(biāo)以及功能MR指標(biāo)進(jìn)行縱向定期評(píng)估和監(jiān)控，以期對(duì)RTT的發(fā)病機(jī)制、基因型、表型、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)機(jī)制進(jìn)一步探討。