不同濃度樺木酸對人胃癌MGC-803細(xì)胞凋亡的影響*

樊 華， 邵淑麗,2Δ， 何孟奇， 黃 鑫,2， 張偉偉,2， 張珍珠,2

(1. 齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院, 黑龍江 齊齊哈爾 161006; 2. 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點實驗室, 黑龍江 齊齊哈爾 161006)

胃癌是由上皮組織癌變產(chǎn)生的惡性腫瘤，每年有近一百萬新增的胃癌病例，使其成為全球癌癥致死第三大主要原因[1]。目前，一般采用放療、化療和手術(shù)治療胃癌，但大多數(shù)國家中其5年的生存率仍低于30%[2]。天然產(chǎn)物由于毒副作用小已廣泛應(yīng)用于臨床中。一些天然藥物成分可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用，據(jù)報道，紫花牡荊素通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑上調(diào)CHOP,eIF2α和GRP78/BiP基因表達(dá)，誘導(dǎo)胃癌BGC-823細(xì)胞凋亡[3]；類黃酮槲皮素通過下調(diào)P53基因表達(dá)，抑制酪氨酸激酶，抑制熱休克蛋白和誘導(dǎo)II型雌激素受體表達(dá)從而誘導(dǎo)癌癥干細(xì)胞凋亡，可以作為靶向癌細(xì)胞的潛在藥物[4]。因此，開發(fā)新型有效的天然抗癌藥物具有良好的應(yīng)用前景。

樺木酸(Betulinic acid, BA)是一種萃取自白樺樹的天然的多功能小分子，以游離糖苷和糖基衍生物形式存在于不同的植物器官中，具有抗病毒[5]、抗糖尿病[6]、抗高血脂[7]、抗炎[8]和抗腫瘤活性[9]。在抗腫瘤方面，樺木酸可通過線粒體途徑觸發(fā)腎癌細(xì)胞凋亡，并顯著抑制人腎癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[10]，還可以通過調(diào)節(jié)人宮頸癌細(xì)胞中的PI3K / Akt信號傳導(dǎo)和線粒體途徑來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。然而，樺木酸在對抗胃癌細(xì)胞凋亡方面的研究尚未見報道。本研究通過不同濃度樺木酸作用于人胃癌MGC-803細(xì)胞系，檢測樺木酸對細(xì)胞形態(tài)、Caspase-3和Caspase-9活性檢測、細(xì)胞線粒體膜電位以及凋亡相關(guān)基因mRNA及蛋白表達(dá)的影響，探究樺木酸對胃癌細(xì)胞的凋亡作用，為樺木酸的開發(fā)和利用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料、試劑及使用儀器

人胃癌MGC-803細(xì)胞系購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所。樺木酸購自北京漢博生物有限公司；胎牛血清購自以色列BI公司；Caspase-3和Caspase-9活性檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；總RNA 提取試劑盒購自賽默飛世爾科技有限公司；Western及IP細(xì)胞裂解液、PI染液均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Caspase-3、Caspase-9、Cyt c和β-actin一抗購自Cell Signaling Technology；二抗購自美國LI-COR有限公司；TCSSP8激光共聚焦顯微鏡購自德國Leica公司；Cytomics FC500-MCL流式細(xì)胞儀購自美國Beckman coulter公司；Pealplex4四通道實時熒光定量PCR儀購自美國Eppendorf 公司；Spark 10M多功能酶標(biāo)儀購自瑞士Tecan公司; DYCZ-24D雙垂直電泳槽、DYY-6C電泳儀均購自美國Bio-rad公司；Odyssey IR雙紅外熒光成像儀購自美國LI-COR公司；

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理

人胃癌MGC-803細(xì)胞系采用10%胎牛血清RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)基中需添加1×105U/L青霉素和100 μg/ml鏈霉素。細(xì)胞培養(yǎng)箱環(huán)境為37℃、5%CO2飽和濕度。將細(xì)胞密度為1.2×106的人胃癌MGC-803細(xì)胞系接種至6孔板并培養(yǎng)至細(xì)胞密度為70%時，分別使用加入終濃度為0、10、20、30 μg/ml的樺木酸培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48 h后，收集樣品用于后續(xù)實驗。

1.3 激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)

將處理好的細(xì)胞800 r/min離心10 min并收集細(xì)胞，用提前預(yù)冷的PBS洗3次，0.5 mg/ml吖啶橙37℃孵育10 min后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4 Caspase-3和Caspase-9活性檢測

將收集好的細(xì)胞加入裂解液冰浴裂解，離心后取上清配制標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，取60 μl反應(yīng)緩沖液、35 μl待測樣品和5 μl DEVD-pNA底物混合均勻，37℃避光孵育2 h，使用酶標(biāo)儀檢測A405指標(biāo)并記錄結(jié)果。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測線粒體膜電位

將IPLJC-1加入到500 μl預(yù)熱好的1×Incubation Buffer配成JC-1工作液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，2 000 r/min離心3 min，并用制好的JC-1工作液懸浮細(xì)胞，制成1×106cells/ml細(xì)胞懸液并置于37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min。孵育完成后，2 000 r/min離心10 min，再洗滌細(xì)胞2次，用500 μl 1×Incubation Buffer重懸細(xì)胞，并使用400目篩網(wǎng)過濾，通過流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 qRT-PCR檢測凋亡相關(guān)基因mRNA的表達(dá)

將樺木酸處理好的細(xì)胞提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板，凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Caspase-9和Cytc基因的引物(表1)，β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行qRT-PCR檢測。每組實驗重復(fù)3次，擴增結(jié)束后以2-ΔΔCt方法計算目的基因mRNA相對表達(dá)量。

Tab. 1 Primers for qRT-PCR analysis

1.7 Western blot檢測凋亡相關(guān)基因蛋白的表達(dá)

將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束用立春紅染色。封閉1 h后進(jìn)行一抗，4℃搖床過夜。PBST洗滌3次，每次15 min，再避光進(jìn)行二抗孵育2 h，PBST再洗滌3次，每次15 min，使用Odyssey IR成像儀避光掃描蛋白條帶，并使用ImageJ軟件檢測各條帶的灰度值，將目的蛋白條帶灰度值和內(nèi)參蛋白條帶灰度值之比表示蛋白相對蛋白表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 樺木酸對MGC-803細(xì)胞形態(tài)的影響

正常人胃癌MGC-803細(xì)胞經(jīng)過吖啶橙染色后在激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)如圖1A所示：所呈現(xiàn)均勻一致的綠色熒光，經(jīng)染色的核呈圓形，包膜完整。當(dāng)用不同濃度樺木酸處理人胃癌MGC-803細(xì)胞48 h后，細(xì)胞形態(tài)如圖1B、1C、1D所示：部分染色體出現(xiàn)濃縮現(xiàn)象，高度聚集，部分細(xì)胞核裂解成碎片。

Fig. 1 Cell morphology of MGC-803 cells treated with betulinic acid for 48 h under a laser confocal microscope (acridine orange ×200， bar=10 μm)

2.2 樺木酸對MGC-803細(xì)胞Caspase-3和Caspase-9活性影響

樺木酸對人胃癌MGC-803細(xì)胞Caspase-3和Caspase-9活性檢測如表1所示：經(jīng)過不同濃度的樺木酸作用細(xì)胞48 h后，Caspase-3和Caspase-9相對活性隨著藥物濃度增大而升高，并在20 μg/ml樺木酸時活性最高，與對照組相比具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 樺木酸對MGC-803細(xì)胞線粒體膜電位影響

分別加入濃度為0、10、20、30 μg/ml樺木酸作用人胃癌MGC-803細(xì)胞48 h后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞線粒體膜電位變化，結(jié)果如圖2所示：對照組細(xì)胞線粒體膜電位為99.0±1.2，終濃度為10、20、30 μg/ml樺木酸處理后細(xì)胞線粒體膜電位分別為： 81.7±1.47、37.5±1.35和71.5±0.96。與對照組相比，各處理組線粒體膜電位均降低，且當(dāng)樺木酸濃度為20 μg/ml時，線粒體膜電位最低(P<0.05，P< 0.01,表2)。

Tab. 1 The effects of betulinic acid on Caspase-3 and Caspase-8 activities in MGC-803 cells n=3)

2.4 樺木酸對MGC-803細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響

qRT-PCR檢測不同濃度樺木酸作用人胃癌MGC-803細(xì)胞48 h凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Caspase-9和CytcmRNA的表達(dá)。經(jīng)過處理的細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9和CytcmRNA的表達(dá)顯著增加且樺木酸濃度為20 μg/ml時表達(dá)量最高(P<0.01，表2)。

Tab. 2 Mitochondrial membrane potential and the expressions of Cyt c，Caspase-3 and Caspase-9 mRNA in MGC-803 cells n=3)

2.5 樺木酸對MGC-803細(xì)胞凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測不同濃度樺木酸作用人胃癌MGC-803細(xì)胞48 h后對Caspase-3、Caspase-9和Cyt c蛋白表達(dá)影響。如圖3所示：經(jīng)過處理的細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9和Cyt c的蛋白表達(dá)顯著增加且樺木酸濃度為20 μg/ml時表達(dá)量最高(P<0.01，表3)。

Tab. 3 The effects of betulinic acid on protein levels of Caspase-3, Caspase-9 and Cyt c n=3)

Fig. 3 The effects of betulinic acid on protein levels of Caspase-3, Caspase-9 and Cyt c (n=3)

3 討論

胃癌是全球死亡率較高的癌癥之一，盡管外科手術(shù)和輔助療法有所改善，但胃癌患者的5年總生存率仍然很低。預(yù)后不良與胃癌高轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率密切相關(guān)。此外，由于耐藥性等多種因素的影響，化療和放療的療效有限[12]。近年來天然產(chǎn)物對癌癥的治療已成為人們的研究熱點，據(jù)報道冬蟲夏草的乙醇提取物可以抑制胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并將細(xì)胞周期阻滯在S期[13]；傳統(tǒng)中草藥顯齒蛇葡萄(又名藤茶)的主要活性成分二氫楊梅素通過 JNK 通路下調(diào)MMP-2 蛋白表達(dá)水平、逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，具有抑制人胃癌 MKN-45 細(xì)胞遷移及侵襲的作用[14]；白花蛇舌草(注射液)能夠使人胃癌MKN-45線粒體膜電位降低，上調(diào)Cyt c、Caspase-3和Caspase-9基因表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)而發(fā)揮抗胃癌的作用[15]。樺木酸是一種天然存在的五環(huán)戊烷型三萜化合物，可以抑制胰腺癌細(xì)胞增殖，將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期[16]且通過抑制STAT3的活化提高胰腺癌細(xì)胞對吉非替尼的敏感性，抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。本實驗以樺木酸為材料，探究樺木酸對胃癌細(xì)胞MGC-803的作用及作用機制。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的高度調(diào)控的過程，為了犧牲特定細(xì)胞以獲得更大機體益處而做出的合理而積極的決定。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，很多利用小分子藥物刺激誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡治療癌癥的方法十分有效[18]。Caspase-3、Caspase-9和Cytc基因是與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的三個基因，Caspase-3和Caspase-9是胱天蛋白酶家族成員，凋亡途徑起始于被激活的胱天蛋白酶，而Caspase-3的激活意味著細(xì)胞凋亡是不可逆的[19]。細(xì)胞色素c(cytochrome c，Cyt c)是屬于c型細(xì)胞色素家族I類的蛋白質(zhì)，與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，當(dāng)Cyt c被釋放到細(xì)胞質(zhì)中與APAF-1結(jié)合，激活Caspase-9，并觸發(fā)導(dǎo)致細(xì)胞死亡的酶聯(lián)級聯(lián)反應(yīng)[20]。本實驗結(jié)果證明了在終濃度為10 ～30 μg/ml濃度范圍內(nèi)的樺木酸作用人胃癌MGC-803細(xì)胞48 h后出現(xiàn)凋亡特征，Caspase-3和Caspase-9活性隨樺木酸濃度增加顯著升高，且在樺木酸濃度為20 μg/ml時，Caspase-3和Caspase-9活性最高，線粒體膜電位顯著降低并且凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Caspase-9和CytcmRNA和蛋白表達(dá)升高，且當(dāng)樺木酸濃度為20 μg/ml時表達(dá)量最高。

綜上所述，在終濃度為10 ～30 μg/ml濃度范圍內(nèi)，樺木酸通過上調(diào)凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Caspase-9和Cytc的表達(dá)誘導(dǎo)人胃癌MGC-803細(xì)胞凋亡，且當(dāng)濃度為20 μg/ml時樺木酸的促凋亡作用最佳。