GPR81激動(dòng)劑對(duì)非酒精性脂肪肝病大鼠胰島素抵抗的影響*

張 瑜， 路青華， 曹海芳， 張生榮， 王虎德

(1. 青海省第四人民醫(yī)院肝病一科， 2. 科教科， 西寧 810000)

非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種以肝臟脂類代謝異常，肝細(xì)胞內(nèi)脂肪類物質(zhì)蓄積過(guò)多而呈現(xiàn)彌漫性的肝脂肪變性為主要病理特征的一類臨床綜合征[1]。目前，NAFLD的發(fā)病機(jī)制包括胰島素抵抗、線粒體功能障礙、炎癥因子、氧化應(yīng)激等，其中胰島素抵抗被認(rèn)為是NAFLD病理生理基礎(chǔ)的中心環(huán)節(jié)，而炎癥細(xì)胞因子是影響胰島素敏感性的重要因素[2]。有研究表明，NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3, NLRP3)炎癥小體的形成，可介導(dǎo)IL-1β和IL-18的分泌，從而引起肝脂肪變性和胰島素抵抗，參與NAFLD的發(fā)病過(guò)程[3]。

G蛋白偶聯(lián)受體81(G protein-coupled receptor 81，GPR81)是乳酸受體，其功能異常通常與肥胖、血脂異常、胰島素抵抗和2型糖尿病密切相關(guān)[4]。據(jù)報(bào)道，GPR81可調(diào)節(jié)炎癥，下調(diào)關(guān)鍵的促炎癥基因，從而發(fā)揮抗炎作用[5]。研究指出GRP81可負(fù)性調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)的IL-1β產(chǎn)生，具有抑制炎癥激活和器官損傷的作用[6]。然而目前對(duì)于GPR81調(diào)控NLRP3炎癥小體在NAFLD中的作用研究較少，因此本研究通過(guò)探討過(guò)表達(dá)GPR81對(duì)NAFLD大鼠胰島素抵抗的作用，并初步闡明其作用機(jī)制，作為NAFLD新的治療手段提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、建模及分組

選擇清潔級(jí)SD雄性大鼠30只，8～12周，體重200～240 g，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所(合格證號(hào)：SCXK(滇)K2016-0001)。將動(dòng)物隨機(jī)分為3組，對(duì)照組、模型組(NAFLD)、GPR81激動(dòng)劑組(NAFLD+GPR81激動(dòng)劑)，每組10只。對(duì)照組：基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)；NAFLD組：用高脂飲食建立大鼠脂肪肝模型。根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]，NAFLD組給予改良高脂飼料(80%的基礎(chǔ)飼料+20%蔗糖)建立脂肪肝模型，造模12周；NAFLD+GPR81激動(dòng)劑組：自造模開始，每周給予腹腔注射GPR81特異性乳酸激動(dòng)劑(50 nmol/L)，每周1次，共12周。對(duì)照組及NAFLD組每周給予腹腔注射等量生理鹽水，每周1次，共12周。造模12周后麻醉處死取大鼠肝臟及外周血。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑

GPR81激動(dòng)劑(Sigma公司)；DAB顯色試劑盒(碧云天生物科技有限公司)；Trizol(Invitrogen公司)；NLRP3、含CARD結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶1(cysteinyl aspartate specific proteinase-1, caspase-1)、胰島素受體底物-1(insulin receptor substrate 1，IRS-1)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)、β-actin普通PCR上下游引物(上海生工公司)；NLRP3兔抗鼠單抗(美國(guó)Abcam公司)；ASC兔抗鼠單抗、caspase-1兔抗鼠單抗、IRS-1兔抗鼠單抗、GLUT4兔抗鼠單抗、抗羊抗Tyr抗體、抗兔抗Ser抗體、山羊抗兔、兔抗山羊二抗(均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruze公司)；大鼠白細(xì)胞介素-1β(interleukin 1β，IL-1β)和大鼠白細(xì)胞介素-18(interleukin 18，IL-18)ELISA試劑盒(均購(gòu)自南京建成生物工程研究所)。

1.3 主要儀器

血糖儀(德國(guó)羅氏診斷公司)；全自動(dòng)生化分析儀(日本Olympus)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)；Z216MK型冷凍離心機(jī)(德國(guó)HERMLE公司)；酶標(biāo)儀(Thermo公司)；石蠟切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司)；正置光學(xué)顯微鏡、成像系統(tǒng)(日本尼康)。

1.4 肝生化指標(biāo)、空腹血糖及胰島素檢測(cè)

采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)甘油三酯(triglyceride，TG)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransfease，ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransfease，AST)；采用血糖儀檢測(cè)空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)、采用ELISA檢測(cè)空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)，并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)，計(jì)算公式[8]：HOMA-IR=FPG×FINS/22.5。

1.5 采用HE染色，光鏡下觀察各組大鼠肝臟組織病理形態(tài)學(xué)改變

將肝組織用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片后蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肝組織病理學(xué)改變。

1.6 采用ELISA法檢測(cè)各組大鼠肝組織及血清中細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的表達(dá)水平

將肝組織按體重體積比1∶9加入生理鹽水在冰浴中充分研磨，制成10%肝勻漿，然后5 000 r/min離心15 min取上清；采集大鼠外周血，2 500 r/min離心15 min取上清；根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書操作，使用波長(zhǎng)450 nm酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)出各組大鼠肝勻漿及血清中IL-1β和IL-18的表達(dá)水平。

1.7 采用Western blot檢測(cè)肝組織中NLRP3、ASC、caspase-1、IRS-1、Tyr465-IRS-1、Ser636-IRS-1、GLUT4的蛋白表達(dá)

取肝組織加入RIPA 裂解液裂解后提取肝組織中總蛋白，每組按40 μg蛋白上樣量經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h；分別加入一抗(1∶500稀釋)，孵育12 h；加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶1 000稀釋)，室溫孵育1 h，加入ECL化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，以β-actin為內(nèi)參，應(yīng)用Quantity One軟件成像及定量分析。

1.8 采用qRT-PCR法檢測(cè)肝組織NLRP3、ASC、caspase-1、IRS-1、GLUT4 mRNA表達(dá)水平

Trizol法提取肝組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)各組肝組織NLRP3、ASC、caspase-1、IRS-1、GLUT4基因的表達(dá)水平。引物由上海生工公司設(shè)計(jì)合成，引物設(shè)計(jì)見表1。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5 min。每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次。以β-actin為內(nèi)參，每組基因的相對(duì)表達(dá)量按公式(2-△△Ct法)計(jì)算。

Tab. 1 Primer sequences for amplification of various genes by PCR

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝生化指標(biāo)、空腹血糖及胰島素的比較

與對(duì)照組相比，NAFLD組大鼠血清肝生化指標(biāo)TG、ALT、AST、FPG、FINS和HOMA-IR值均顯著升高(P<0.05)；與NAFLD組相比，GPR81激動(dòng)劑組大鼠血清TG、ALT、AST、FPG、FINS和HOMA-IR值均顯著降低(P<0.05，表2)。

2.2 各組大鼠肝臟組織病理形態(tài)學(xué)的比較

光鏡結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠肝臟形態(tài)正常，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，排列正常，細(xì)胞中央有大而圓的細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)均勻；NAFLD組大鼠肝細(xì)胞體積增大，排列不規(guī)則，可見明顯的肝細(xì)胞脂肪變性，肝細(xì)胞有脂肪滴，存在明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；GPR81激動(dòng)劑組大鼠肝細(xì)胞脂肪變性較NAFLD組明顯減輕，脂肪滴及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少(圖1)。

Tab. 2 Liver biochemical indexes, fasting blood glucose and insulin in each group n=10)

Fig. 1 Histopathology of liver in each group (HE ×200)

2.3 各組大鼠肝組織中NLRP3信號(hào)通路相關(guān)基因的蛋白表達(dá)的比較

NAFLD組肝組織中NLRP3、ASC、caspase-1、Ser636-IRS-1的蛋白表達(dá)與對(duì)照組相比顯著升高，而IRS-1、Tyr465-IRS-1、GLUT4的蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與NAFLD組相比，GPR81激動(dòng)劑組大鼠肝組織NLRP3、ASC、caspase-1、Ser636-IRS-1的蛋白表達(dá)水平顯著降低而IRS-1、Tyr465-IRS-1、GLUT4的蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05，圖2，表3)。

Fig. 2 Protein expressions of NLRP3, ASC, caspase-1, IRS-1, p-IRS-1 and GLUT4 in liver tissue

2.4 各組大鼠肝組織NLRP3、ASC、caspase-1、IRS-1、GLUT4 mRNA表達(dá)水平的比較

與對(duì)照組相比，NAFLD組肝組織NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA表達(dá)水平顯著升高，而IRS-1、GLUT4 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與NAFLD組相比，GPR81激動(dòng)劑組大鼠肝組織NLRP3、ASC、caspase-1 mRNA表達(dá)水平降低而IRS-1、GLUT4 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05，表4)。

2.5 各組大鼠肝組織及血清細(xì)胞因子IL-1β和IL-18含量的比較

與對(duì)照組相比，NAFLD組和GPR81激動(dòng)劑組大鼠肝組織及血清中IL-1β和IL-18的含量均顯著升高(P<0.05)；與NAFLD組相比，GPR81激動(dòng)劑組大鼠肝組織及血清中IL-1β和IL-18的含量顯著降低(P<0.05，表5)。

3 討論

NAFLD往往與代謝性疾病并存，如肥胖、2型糖尿病、高脂血癥、代謝綜合征等。胰島素抵抗參與NAFLD發(fā)病的理論已被公認(rèn)，它對(duì)血糖穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞合成代謝和器官葡萄糖攝取產(chǎn)生影響[9]。胰島素抵抗可導(dǎo)致脂肪肝發(fā)生，而脂肪肝又可加重胰島素抵抗[10]。有研究表明，NAFLD模型組小鼠血清空腹血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)、ALT和AST均明顯高于對(duì)照組，且胰島素抵抗在NAFLD發(fā)病中起重要作用[11]。本研究用高脂飲食建立非酒精性脂肪肝大鼠胰島素模型，結(jié)果表明與對(duì)照組相比，NAFLD組大鼠血清肝生化指標(biāo)TG、ALT和AST及FPG、FINS和HOMA-IR值均顯著升高；病理結(jié)果表明NAFLD組大鼠肝細(xì)胞體積增大，排列不規(guī)則，可見明顯的肝細(xì)胞脂肪變性，肝細(xì)胞有脂肪滴，存在明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，提示NAFLD組大鼠在脂肪變性的過(guò)程中發(fā)生了胰島素抵抗，NAFLD大鼠模型建立成功。

Tab. 3 The expression levels of NLRP3 signaling pathway related proteins in liver tissues in each group n=3)

Tab. 4 The mRNA expression levels of NLRP3 signaling pathway related genes in liver tissues in each group n=10)

Tab. 5 The contents of IL-1β and IL-18 in liver tissue and serum of rats in each group n=10)

代謝性炎癥在非酒精性脂肪性肝炎的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，NLRP3的激活促進(jìn)IL-1β和IL-18的分泌與非酒精性脂肪性肝炎密切相關(guān)，而NLRP3炎癥小體的激活又與高脂飲食脂肪酸的大量攝入有關(guān)[12]。IRS-1是胰島素底物受體，在介導(dǎo)胰島素作用方面起著重要作用。除了通過(guò)基因表達(dá)調(diào)節(jié)外，IRS-1的活性主要由其磷酸化調(diào)節(jié)[13]。在病理狀態(tài)下，炎癥通路被激活，釋放炎癥因子并通過(guò)抑制胰島素通路蛋白表達(dá)和信號(hào)傳遞影響對(duì)葡萄糖的吸收、IRS-1蛋白表達(dá)減少，導(dǎo)致胰島素敏感性降低[14]。有研究報(bào)道，IRS-1酪氨酸磷酸化使胰島素下游信號(hào)通路激活，胰島素發(fā)揮作用；絲氨酸磷酸化抑制胰島素下游信號(hào)引起胰島素抵抗；而炎癥細(xì)胞因子、缺氧和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可通過(guò)抑制IRS-1和IRS-2絲氨酸的磷酸化直接抑制胰島素作用[15]。GLUT4是一種重要的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，能促進(jìn)機(jī)體對(duì)葡萄糖的吸收，GLUT4表達(dá)下降可誘導(dǎo)發(fā)生胰島素抵抗。有研究表明，抑制NLRP3炎癥小體的激活及炎癥因子的產(chǎn)生，降低p-IRS-1的表達(dá)，促進(jìn)IRS-1和GLUT4的表達(dá)，從而改善高脂飲食小鼠肝臟和骨骼肌的胰島素抵抗[16]。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，NAFLD組肝組織NLRP3、ASC、caspase-1的表達(dá)水平及Ser636-IRS-1的蛋白表達(dá)水平均顯著升高，且肝組織及血清中IL-1β和IL-18的含量升高；而IRS-1、Tyr465-IRS-1、GLUT4的表達(dá)水平顯著降低；結(jié)果提示NAFLD組大鼠肝臟炎性水平顯著升高，NAFLD大鼠發(fā)生胰島素抵抗。

GPR81是乳酸的特異性受體，具有調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞發(fā)育和分化、抑制脂肪分解、抑制炎性反應(yīng)等生物學(xué)功能[17]。GPR81激動(dòng)劑能抑制嚙齒動(dòng)物的空腹血漿游離脂肪酸水平，并降低胰島素抵抗和糖尿病小鼠模型的胰島素敏感性[18]。有研究表明，GPR81激活可以通過(guò)降低氧化應(yīng)激和細(xì)胞因子表達(dá)，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化起到保護(hù)作用[19]。本研究結(jié)果表明，GPR81激動(dòng)劑組大鼠血清肝生化指標(biāo)較NAFLD組均顯著降低；光鏡結(jié)果顯示，GPR81激動(dòng)劑組大鼠肝脂肪變較NAFLD組明顯減輕，脂肪滴及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少；與NAFLD組相比，GPR81激動(dòng)劑組大鼠肝組織及血清中IL-1β和IL-18的含量降低，且肝組織NLRP3信號(hào)通路相關(guān)基因表達(dá)水平改善；上述結(jié)果提示，GPR81激動(dòng)劑可抑制細(xì)胞因子的釋放，降低IRS-1的磷酸化水平，促進(jìn)IRS-1和GLUT4的表達(dá)水平，從而改善NAFLD大鼠胰島素抵抗和肝脂肪變，可能與GPR81激動(dòng)劑抑制NLRP3信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD中，NLRP3信號(hào)通路參與NAFLD胰島素抵抗，GPR81激動(dòng)劑可抑制NLRP3信號(hào)通路的激活，還可以改善炎癥反應(yīng)引起的NAFLD胰島素抵抗，對(duì)NAFLD具有保護(hù)作用，表明NLRP3信號(hào)通路活化介導(dǎo)炎癥因子產(chǎn)生促進(jìn)了NAFLD的發(fā)生發(fā)展。