黨參總皂苷對(duì)TNBS誘導(dǎo)的大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的保護(hù)作用及其機(jī)制*

劉雪楓， 喬 婧， 高建德,3， 陳正君， 劉 雄△

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院， 蘭州 730000； 2. 甘肅省中藏藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 蘭州 730000；3. 甘肅省中藥質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 蘭州 730000)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)是一種以腹瀉、腹痛、血便為主要臨床癥狀的非特異性慢性炎癥性腸病，病變部位主要在直腸和結(jié)腸的粘膜或粘膜下層，常見(jiàn)于30～40歲的成年人。其發(fā)病機(jī)制為多因素所致，包括遺傳易感性、上皮屏障缺陷、免疫反應(yīng)失調(diào)和環(huán)境因素等[1]。該病治療難度高、易反復(fù)發(fā)作，病程綿長(zhǎng)，是世界衛(wèi)生組織公認(rèn)的難治性疾病[2]。 目前UC的治療藥物包括5-氨基水楊酸類(lèi)、類(lèi)固醇類(lèi)和免疫抑制劑等，但副作用大，易出現(xiàn)停藥反應(yīng)。中藥因其整體治療和安全性方面的獨(dú)到優(yōu)勢(shì)在治療UC時(shí)展現(xiàn)出了良好的前景。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為UC屬于“腸癖”范疇，主要致病邪氣為濕熱，是脾胃虛弱、濕熱內(nèi)蘊(yùn)、腎陽(yáng)不足、瘀血阻滯等多個(gè)因素作用的結(jié)果[3]。黨參是我國(guó)傳統(tǒng)的補(bǔ)益藥，為桔?？泣h參Codonopsispilosula( Franeh. ) Nannf. 、素花黨參CodonopsispilosulaNannf. Var.modesta( Nannf. )L. T. Shen 或川黨參CodonopsistangshenOliv. 的干燥根，具有補(bǔ)中益氣、健脾益肺的功效，臨床上常用于脾肺氣虛、咳嗽虛喘、內(nèi)熱消渴等癥[4]。長(zhǎng)久以來(lái)，以黨參為主藥的方劑在臨床上廣泛應(yīng)用于發(fā)作期、緩解期潰瘍性結(jié)腸炎的治療[5]。查閱文獻(xiàn)，至目前為止尚未見(jiàn)黨參對(duì)UC模型的治療作用及機(jī)制研究的相關(guān)報(bào)道。黨參總皂苷是黨參中重要的生物活性成分之一，現(xiàn)代藥理研究表明其具有抗炎、抗氧化、抗?jié)?、抗腫瘤、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、免疫調(diào)節(jié)等重要的臨床應(yīng)用價(jià)值[6-7]。因此，本研究屬首次探索黨參總皂苷對(duì)大鼠UC模型的保護(hù)作用及其可能機(jī)制，為黨參的臨床開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑和主要儀器

SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠(220±10)g， 50只，購(gòu)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心(合格證號(hào)：SYXK(甘)2015-0005)。在22～24℃，相對(duì)濕度 40%～60 % 環(huán)境下，普通飼料、純凈水飼養(yǎng)。

黨參藥材購(gòu)于蘭州復(fù)興厚中藥飲片有限公司，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)王明偉副教授鑒定為桔梗科植物黨參(Codonopsispilosula(Franch.)Nannf.)的根；柳氮磺胺吡啶(SASP，上海信誼天平制藥廠(chǎng))；2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS，天津大茂化學(xué)試劑廠(chǎng))；水合氯醛(鄭州市德眾化學(xué)試劑廠(chǎng))；超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；RNA 提取試劑盒，cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司，批號(hào)分別為157042224、160017598、157056248)；小鼠SP試劑盒、兔SP試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋科技有限公司，批號(hào)分別為SP-9002、SP-9001、ZLI-9018)；細(xì)胞核內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)一抗(美國(guó)Genetex公司，GTX107678)；白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)引物序列均由上海生工生物公司合成，引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1。

Tab. 1 Primer sequences and product length

Primo高速離心機(jī)(德國(guó) Heraeus公司)；KD-BM包埋機(jī)(浙江省金華市科迪儀器)；切片機(jī)(德國(guó)萊卡公司)；iMark酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio Rad公司)；RX50顯微鏡(寧波舜宇儀器有限公司)；NanoDrop核酸濃度測(cè)量?jī)x(美國(guó)Thermo公司)；DM7500實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)Agilent公司)；AE-240 電子天平(梅特勒-托利多儀器上海分公司)。

黨參總皂苷(TSC)制備采取冷浸加超聲法提?。悍鬯楹蟮狞h參藥材浸泡23 h，加入無(wú)水乙醇使體積分?jǐn)?shù)為71.5%，料液比1∶31，超聲溫度39.6℃，超聲提取29 min，TSC得率為1.616%，具體方法詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)[7]。

1.2 動(dòng)物造模、分組及處理

50只 Wistar雄性大鼠，按體重隨機(jī)分為5組，分別為對(duì)照組、模型組、柳氮磺胺吡啶(SASP)組 (0.3 g/kg)、TSC高、低劑量組(分別為1.2 g/kg， 0.4 g/kg，按生藥量計(jì)算，為成人臨床劑量的30，10倍)。各組動(dòng)物繼續(xù)給予相應(yīng)藥物灌胃，每日1次，連續(xù)5 d后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物禁食36 h，水合氯醛麻醉，正常組以生理鹽水灌腸，其余各組以100 mg/kg TNBS和50%乙醇溶液0.25 ml/只緩慢注入結(jié)腸約8 cm處進(jìn)行灌腸[8]。造模后，連續(xù)3 d根據(jù)造模后大鼠體重下降率、糞便性狀及大便隱血情況進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分，DAI>0.5即代表造模成功，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)參照文獻(xiàn)[9]。造模成功后，各組動(dòng)物繼續(xù)給藥21 d。末次給藥后，大鼠禁食不禁水36 h，水合氯醛麻醉解剖，取從肛門(mén)向上至8 cm處的結(jié)腸組織，將結(jié)腸組織凍于液氮中，后續(xù)檢測(cè)使用。

1.3 大鼠癥狀及體征觀(guān)察

給藥期間，觀(guān)察各組大鼠體重變化，飲食飲水、自主活動(dòng)是否正常，毛色有無(wú)光澤以及是否有腹瀉便血出現(xiàn)。

1.4 大鼠結(jié)腸粘膜損傷評(píng)價(jià)[10]

將結(jié)腸組織縱向剖開(kāi)，生理鹽水洗凈，平鋪固定觀(guān)察結(jié)腸黏膜，根據(jù)文獻(xiàn)方法進(jìn)行結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)評(píng)價(jià)(CMDI)。0分：無(wú)損傷；1分，黏膜輕度充血水腫，表面光滑，無(wú)糜爛或潰瘍；2分，黏膜粗糙呈顆粒狀，充血水腫，有糜爛或腸粘連；3分，黏膜表面有壞死及潰瘍形成，高度充血水腫，潰瘍最大縱徑小于1.0 cm，腸壁增厚或表面有壞死及炎癥；4分，在3分基礎(chǔ)上潰瘍最大縱徑大于1.0 cm或大鼠死亡。

1.5 大鼠結(jié)腸病理學(xué)組織觀(guān)察

取1 cm結(jié)腸組織4 %多聚甲醛固定，梯度酒精脫水，常規(guī)石蠟包埋、切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀(guān)察組織病理學(xué)形態(tài)變化。

1.6 大鼠結(jié)腸組織生化指標(biāo)檢測(cè)

取適量結(jié)腸組織，加入生理鹽水制備成10%勻漿，離心取上清后按照試劑盒方法檢測(cè)結(jié)腸組織中超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量。

1.7 大鼠結(jié)腸組織中IL-6、IL-10、TNF-α mRNA表達(dá)的測(cè)定

取各組大鼠結(jié)腸組織適量，加入液氮研磨，按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA，采用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定樣品的濃度。在PCR擴(kuò)增儀上將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，之后進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火60 s，72℃延伸5 min，共40個(gè)循環(huán)。應(yīng)用2-ΔΔCT方法計(jì)算各基因相對(duì)含量，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)四次。

1.8 大鼠結(jié)腸組織中NF-κB 蛋白的表達(dá)

采用免疫組化法觀(guān)察結(jié)腸組織中NF-κB 蛋白的表達(dá)。切取3 mm大小的結(jié)腸組織，石蠟包埋后切制成5 μm厚的切片。切片常規(guī)脫蠟，梯度 70%乙醇水化，檸檬酸鈉熱修復(fù)兩次后，3%的過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；山羊血清封閉液封閉 30 min。每張切片滴加一抗 NF-κB(1∶200)，4℃ 冰箱過(guò)夜，PBS 緩沖液沖洗后滴加聚合 HRP 標(biāo)記抗兔 Ig G 37℃孵育 30 min，PBS 緩沖液沖洗后 DAB 顯色10 min 左右，室溫下蘇木素復(fù)染90 s，自來(lái)水沖洗后，梯度乙醇脫水，二甲苯Ⅰ、Ⅱ各 25 min，中性樹(shù)膠封片。顯微鏡下觀(guān)察 NF-κB 蛋白表達(dá)情況。取同等倍數(shù)下的4個(gè)不同視野進(jìn)行拍照，用Image Pro Plus軟件計(jì)算。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 UC大鼠癥狀及體征觀(guān)察

對(duì)照組大鼠一般情況良好，自主活動(dòng)正常，飲食正常，毛色有光澤，無(wú)腹瀉便血發(fā)生；造模后，模型組大鼠出現(xiàn)懶動(dòng)，豎毛，厭食癥狀，有明顯腹瀉，甚至出現(xiàn)便血，體質(zhì)量下降(P<0.01)；SASP組、TSC高低劑量組一般情況較模型組好，大鼠毛色有光澤，自主活動(dòng)增加，大鼠腹瀉發(fā)生率低于模型組，體質(zhì)量恢復(fù)正常(P<0.05)。從DAI評(píng)分來(lái)看，造模3 d后，與對(duì)照組比較，各組DAI評(píng)分顯著增加(P<0.01)，說(shuō)明造模成功。給藥21 d后，與模型組比較，SASP組和TSC組大鼠DAI評(píng)分顯著下降，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。TSC高劑量組DAI評(píng)分略低于低劑量組，但結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

Tab. 2 DAI, CMDI scores of UC n=10)

2.2 UC大鼠結(jié)腸粘膜損傷情況

動(dòng)物處死解剖后，肉眼觀(guān)察可見(jiàn)對(duì)照組大鼠結(jié)腸顏色淡紅，表面光滑，腸壁厚薄適中，黏膜皺襞清晰完整；模型組大鼠腸壁紅腫充血，潰瘍明顯，潰瘍面積較正常組顯著增加(P<0.01，表2)；SASP組、TSC組亦可見(jiàn)結(jié)腸水腫、充血或黏膜粗糙，但較模型組有很大程度改善。

2.3 UC大鼠結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)變化

HE染色結(jié)果顯示(圖1)，對(duì)照組染色均勻，細(xì)胞核形態(tài)正常，腸粘膜以及基層清晰可見(jiàn)。模型組與對(duì)照組相比較，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，粘膜層損傷嚴(yán)重，基層分界線(xiàn)消失。與模型組比較，SASP組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，粘膜損傷較模型組減輕；TSC高劑量組與模型組相比較，炎性細(xì)胞明顯減少，粘膜層損傷較輕，基層較清晰。

Fig. 1 Histopathological changes of colonic mucosa in rats stained with HE under light microscope(× 200)

2.4 UC大鼠結(jié)腸組織中SOD和MDA含量

如表3所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠結(jié)腸黏膜組織 SOD活力顯著下降，MDA含量顯著升高 (P<0.01)；與模型組比較，SASP組大鼠結(jié)腸黏膜組織SOD活力升高，MDA含量下降，但結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；TSC高低劑量組均能提高結(jié)腸黏膜中SOD活力，降低MDA含量(P<0.05)，且TSC高劑量組MDA含量顯著低于SASP組和TSC低劑量組(P< 0.05)。

Tab. 3 SOD and MDA contents in colon tissues of UC n=10)

2.5 UC大鼠結(jié)腸組織中IL-6、IL-10、TNF-α mRNA表達(dá)

如表4所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠IL-6、TNF-α mRNA的表達(dá)量顯著升高(P<0.01)，IL-10 mRNA的表達(dá)量顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，SASP組、TSC高低劑量組均能降低UC大鼠結(jié)腸組織中IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá)水平，并提高抗炎細(xì)胞因子IL-10 mRNA的表達(dá)水平(P<0.05)；TSC高劑量組降低IL-6 mRNA表達(dá)、升高IL-10 mRNA表達(dá)的能力優(yōu)于SASP組和TSC低劑量組(P<0.05)。

Tab. 4 Expressions of IL-6, IL-10, TNF-α mRNA and NF-κB protein in colon n=10)

2.6 UC大鼠結(jié)腸組織中NF-κB 蛋白表達(dá)

如圖2所示，通過(guò)免疫組化法，進(jìn)一步觀(guān)察了TSC及SASP對(duì)UC大鼠結(jié)腸組織中NF-кB蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果顯示與對(duì)照組比較，模型組大鼠結(jié)腸粘膜中NF-кB蛋白表達(dá)顯著升高，而TSC高低劑量組能明顯減少NF-кB蛋白的表達(dá)，作用比SASP組更加顯著，且降低作用與給藥劑量正相關(guān)(P< 0.05，表4)。

Fig. 2 Immunohistochemical detection of NF-κB protein expression in rat colon tissues(× 200)

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種侵襲結(jié)腸黏膜的慢性非特異性炎性疾病，以反復(fù)發(fā)作、易癌變?yōu)樘卣鱗1]，目前臨床上尚無(wú)良好的治療藥物。UC發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與多種因素有關(guān)。因此，要選擇有效治療UC的藥物必須考慮多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)、多途徑的治療策略。中藥作為我國(guó)幾千年傳統(tǒng)文化的瑰寶，其作用靶點(diǎn)多、安全性高，在臨床治療多種疾病中確有獨(dú)特之處。有學(xué)者通過(guò)對(duì)2000～2015年期刊文獻(xiàn)中記載臨床治療潰瘍性結(jié)腸炎的處方進(jìn)行頻次統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)黨參等三種中藥出現(xiàn)頻次均在100次以上[11]。黨參是甘肅省大宗道地藥材，具有補(bǔ)中益氣、健脾益肺之效[4]。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，黨參調(diào)節(jié)胃腸功能的研究主要集中在對(duì)胃潰瘍動(dòng)物模型的影響和改善胃腸動(dòng)力方面[6]，而鮮有對(duì)UC的治療作用研究，并尚缺乏黨參對(duì)UC的保護(hù)作用研究。因此，本研究觀(guān)察了黨參總皂苷(TSC)對(duì)UC模型大鼠的保護(hù)作用及其可能作用機(jī)制。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，模型組大鼠結(jié)腸黏膜潰瘍明顯，疾病活動(dòng)指數(shù)、結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)顯著升高，結(jié)腸組織中SOD活力下降、MDA含量升高，IL-6、TNF-α mRNA表達(dá)升高，IL-10 mRNA表達(dá)降低；免疫組化觀(guān)察結(jié)腸組織NF-κB蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，模型組NF-κB蛋白含量明顯比對(duì)照組大鼠增加，以上結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[12]，說(shuō)明模型復(fù)制成功。MDA的產(chǎn)生是由細(xì)胞膜上的多不飽和脂肪酸進(jìn)行脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)而來(lái)，該產(chǎn)物水平的高低反映了機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的程度[13]，而SOD是體內(nèi)消除超氧陰離子的主要抗氧化酶系，其水平常作為臨床上觀(guān)察結(jié)腸黏膜損傷水平以及抗炎水平的重要指標(biāo)[14]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TSC對(duì)UC大鼠的疾病活動(dòng)指數(shù)、結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)及結(jié)腸黏膜形態(tài)均有明顯改善，并使結(jié)腸中SOD活力增加、MDA含量下降，說(shuō)明了TSC對(duì)UC模型大鼠的保護(hù)作用可能與抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抗炎有關(guān)。有研究表明，IL-6和TNF-α 能直接介入急性期炎癥損傷過(guò)程，誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)UC的發(fā)生。相反，IL-10作為抗炎細(xì)胞因子，能夠抑制TNF-α和IL-6等促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生[15]。NF-κB在UC發(fā)病過(guò)程中具重要作用，是各種致病因子釋放和表達(dá)的關(guān)鍵。NF-κB被激活后轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因的啟動(dòng)子結(jié)合，編碼多種炎性因子的基因表達(dá)，包括IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α等，從而進(jìn)一步加速炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[16]。給予TSC干預(yù)后，TSC高低劑量組均可以通過(guò)降低NF-кB的蛋白表達(dá)，降低結(jié)腸炎癥因子IL-6、TNF-α mRNA水平，促進(jìn)抗炎因子IL-10 mRNA表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)中SASP與TSC低劑量組對(duì)UC大鼠的保護(hù)作用相當(dāng)，TSC高劑量組保護(hù)作用優(yōu)于二組，這可能是由于TSC在治療UC時(shí)體現(xiàn)了多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)、多途徑的治療策略，故其療效略?xún)?yōu)于陽(yáng)性藥SASP，具體機(jī)制還需進(jìn)一步探討。

綜上所述，TSC通過(guò)抗脂質(zhì)過(guò)氧化、改善結(jié)腸黏膜損傷，抑制NF-κB的活化從而減少I(mǎi)L-6 和 TNF-α 等炎性因子的釋放，增強(qiáng)抗炎因子IL-10的釋放來(lái)發(fā)揮對(duì)UC大鼠的保護(hù)作用。