樺木酸提取、合成及藥理作用的研究進(jìn)展*

王 悅 張 強(qiáng) 李美秋 寇曉涵 鄭 健

（東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 黑龍江哈爾濱 150040）

樺木酸（betulinic acid，BA）又稱(chēng)白樺脂酸，是一種羽扇豆烷型五環(huán)三萜類(lèi)化合物，為一種三萜烯，E 環(huán)為五元碳環(huán)，C-3 位上的羥基為β-OH，28位為羧基，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。樺木酸易溶于吡啶、四氫呋喃，溶于甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、氯仿等溶劑中，不溶于水。樺木酸具有廣泛的藥理作用，包括抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激、抗艾滋病病毒、抗菌、抗炎、抗寄生蟲(chóng)，并在改善免疫力、調(diào)節(jié)血糖方面也有一定功效，且安全性高。雖然樺木酸廣泛存在于樺樹(shù)（圖2）等多種植物中，但含量較低，水溶性差，因此，樺木酸提取及合成的相關(guān)研究，對(duì)腫瘤等疾病的治療及生物活性利用都具有重要的意義。

圖1 樺木酸結(jié)構(gòu)

圖2 樺樹(shù)

1 樺木酸提取及合成

樺木酸廣泛存在于樺木屬植物白樺中，桉樹(shù)球、胡蘆巴、桑白皮、酸棗仁、杜仲、柿蒂、睡菜葉、迷迭香、匙萼金絲桃及蘋(píng)果等植物中也發(fā)現(xiàn)樺木酸的存在。近年來(lái)，在其他植物中也檢測(cè)到樺木酸。徐凌玉等［1］采用多種柱色譜技術(shù)對(duì)薄荷提取得到的天然產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，利用波譜分析方法鑒定，分離得到11 個(gè)化合物，其中包括樺木酸。王麗華等［2］檢測(cè)暴馬丁香中樺木酸的含量發(fā)現(xiàn)，枝條中樺木酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，樹(shù)皮中次之，葉片中最低。王宇等［3］利用超聲輔助提取工藝從澤蘭中提取并測(cè)定了樺木酸含量為（5.31±0.04）mg／g，高于酸棗仁。

樺木酸的制備方法已取得一定進(jìn)展，獲得方式一般有直接提取法、化學(xué)合成法及生物合成法。

1.1 直接提取法 直接提取法即以甲醇、乙醇、氯仿等有機(jī)溶劑作為溶劑進(jìn)行提取，再將獲得的粗品純化，從而獲得純品的方法。例如，從烏骨藤中提取樺木酸時(shí)，用數(shù)量倍的70%乙醇將烏骨藤加熱回流2～3 次，將提取液減壓蒸干，依次通過(guò)石油醚、乙酸乙酯、飽和正丁醇萃取劑進(jìn)行萃取，再將萃取液減壓蒸干，經(jīng)柱層析梯度洗脫，再經(jīng)液相色譜儀純化，即可得到樺木酸純品。Djamen 等［4］在真空中濃縮黃花苜蓿小枝的甲醇提取物，然后通過(guò)硅膠柱色譜分離，得到3 種新的五環(huán)三萜類(lèi)化合物和14 種已知的代謝物，其中包括樺木酸。目前，直接提取法包括以下方式：加壓液體萃取法、超臨界萃取法、亞臨界水提取、超聲波提取法。

1）加壓液體萃取法。加壓液體萃取法是在較高的溫度和壓力下，用溶劑對(duì)固體或半固體樣品進(jìn)行萃取的技術(shù)，其萃取是在一個(gè)加壓并配備溶劑控制器的萃取系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行。Pinilla 等［5］依次用甲醇、乙酸乙酯作為萃取劑萃取，經(jīng)過(guò)多次階梯式升溫得到萃取液，最后利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干得到樺木酸粗品。此方法提取過(guò)程自動(dòng)化，極大縮短萃取時(shí)間，節(jié)約人力，明顯降低萃取溶劑使用量，成本較小，且萃取過(guò)程在密閉系統(tǒng)中進(jìn)行，減少溶劑揮發(fā)和對(duì)人體的危害，減少環(huán)境污染，但是樣品收率低。

2）超臨界萃取法。超臨界萃取法具有萃取和分離的雙重作用，目前，此技術(shù)在去除有害成分、提取有效成分的研究上，已取得明顯的成果。Krasutsky 等［6］利用超臨界萃取法，從樺樹(shù)皮中提取樺木酸，純度可高達(dá)95%。Plander 等［7］將超臨界流體超高性能收斂色譜系統(tǒng)與蒸發(fā)光散射檢測(cè)器結(jié)合，從梧桐樹(shù)樹(shù)皮中提取出樺木酸。超臨界萃取法環(huán)保高效，成本低，應(yīng)用前景十分廣泛。

3）亞臨界水提取。亞臨界水提取技術(shù)是通過(guò)改變萃取溫度改變水的極性、表面張力和粘度，進(jìn)而從樺樹(shù)皮中選擇性地萃取樺木酸。Liu 等［8］利用亞臨界水提取法從樺樹(shù)皮中提取樺木酸，收率高于傳統(tǒng)提取方法，且提取物中的雜質(zhì)更少。此方法通常用于萃取難萃取的天然產(chǎn)物，在短時(shí)間內(nèi)完成，并可連續(xù)處理。由于提取時(shí)間短、成本低、無(wú)污染，又稱(chēng)為“綠色的處理法”。

4）超聲波提取法。超聲波提取法可從植物中提取生物活性物質(zhì)，將化學(xué)試劑與原料按一定的比例混合，置于已設(shè)定頻率和溫度的超聲容器內(nèi)，在一定的溫度下，內(nèi)容物釋放，并溶解于化學(xué)試劑中。Hossain 等［9］以懸鈴木樹(shù)皮為原料，將乙酸乙酯與樹(shù)皮混合后置于超聲容器中，獲得樺木酸。Song 等［10］從棗果中使用超聲法提取了總?cè)祁?lèi)化合物，其中包括樺木酸。超聲波提取法高效節(jié)能，制備工藝簡(jiǎn)單，應(yīng)用也較廣泛。

1.2 化學(xué)合成法 化學(xué)合成法包括直接合成法和半步合成法。

1）直接合成法。直接合成法是在利用乙醇等有機(jī)溶劑提取樺木醇的同時(shí)，將四甲基哌啶等氧化劑附著在固體載體上，在50℃下氧化提取物，即可得到樺木酸。由于直接合成法同時(shí)提取樺木醇和制備樺木酸，雜質(zhì)種類(lèi)及含量較多，由此影響樺木酸純度，產(chǎn)率也很低，產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用困難。

2）半步合成法。半步合成法有2 種方式，一種是以樺木醛為中間體制備樺木酸，另一種以樺木酮酸為中間體制備樺木酸。Pichette 等［11］采用第1種方式，將氧化劑CrO3吸附在硅膠上，在SiO2的催化下，樺木醇氧化為樺木醛，再以高錳酸鉀作為氧化劑、丙酮作為溶劑將樺木醛氧化為樺木酸。此方法產(chǎn)物復(fù)雜，難以分離純化，且產(chǎn)率較低，因此，基本不使用這種方法。第2 種方式是用瓊斯試劑作為氧化劑、丙酮作為溶劑，將樺木醇氧化為樺木酮酸，再以硼氫化鈉作為還原劑、THF 作為溶劑，將樺木酮酸還原得到樺木酸［12］。此方法操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)條件較溫和，適用于大規(guī)模生產(chǎn)。Hossain 等［9］用IBX作為氧化劑，在DMSO 和THF 混合溶劑中，樺木醇氧化為樺木酮醛，然后在四丁基高錳酸銨作用下，將樺木酮醛氧化為樺木酮酸，最后，樺木酮酸在硼氫化鈉的作用下還原為樺木酸。此方法操作簡(jiǎn)單，樺木酸的收率較高。謝洋等［13］以樺木醇作為原料，在丙酮溶液中與K2CrO7-H2SO4進(jìn)行催化氧化成樺木酮酸，再以NaBH4為還原劑合成樺木酸。陶冉等［14］對(duì)樺木醇C-28 和C-29 位進(jìn)行修飾，引入醛基，得到C-28 位和C-29 位樺木酸。此法相比于樺木醇半合成法工藝更簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)化率和樺木酸純度都較高，應(yīng)用前景較好。

1.3 生物合成法 樺木酸廣泛分布于多種植物中，雖然化學(xué)合成法是獲取樺木酸的主要方法，但存在收率低、高耗能等問(wèn)題。三萜酸類(lèi)化合物的生物合成途徑過(guò)程一般有3 個(gè)階段，分別為中間體異戊烯基焦磷酸（IPP）和異構(gòu)體二甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP）的生成、基本前體物質(zhì)鯊烯的生成，以及三萜酸類(lèi)化合物的生成。在某些植物細(xì)胞中，羽扇豆醇合成酶（LUP）催化2，3-環(huán)氧鯊烯生成羽扇豆醇，再由CYP716A 亞家族C-28 氧化酶及其還原伴侶（CPR）催化羽扇豆醇在C-28 位發(fā)生3 次連續(xù)氧化，依次轉(zhuǎn)化成樺木醇、樺木醛，最后生成樺木酸［15］。

Chen 等［16］發(fā)現(xiàn)樺木酸可能通過(guò)微生物降解，經(jīng)氧化后可生成樺木酸或其他代謝產(chǎn)物，經(jīng)實(shí)驗(yàn)，他們從8 個(gè)菌株中篩選出樺木酸收率最好的菌株——臭曲霉菌；Feng 等［17］將小克銀漢霉菌和蜜環(huán)菌在含有樺木醇的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在這2 種菌的代謝產(chǎn)物上都分離得到了樺木酸；Li 等［18］發(fā)現(xiàn)，釀酒酵母可通過(guò)平衡脂肪酸和樺木酸生物轉(zhuǎn)化機(jī)制提高樺木酸產(chǎn)率。王冬［15］首先在三萜底盤(pán)細(xì)胞BYT3 的rDNA 多拷貝位點(diǎn)引入來(lái)自烏拉爾甘草的羽扇豆醇合酶基因，以及MVP 途徑限速酶3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶基因，從而獲得樺木酸前體羽扇豆醇的底盤(pán)細(xì)胞BY-LUP02，經(jīng)過(guò)篩選7 種細(xì)胞色素P450 還原酶，得到效果最佳的擬南芥細(xì)胞色素P450 還原酶2，最終獲得高產(chǎn)樺木酸的細(xì)胞工廠BY-BA42。黃嘉鍵［19］將擬南芥中的羽扇豆醇合成酶基因AtLUPs及RoCYP-34445，導(dǎo)入至釀酒酵母BY4741 細(xì)胞中，在酵母體內(nèi)構(gòu)建了樺木酸生物合成途徑。從目前研究來(lái)看，雖然生物轉(zhuǎn)化機(jī)制較為復(fù)雜，但成本低，反應(yīng)條件溫和，安全環(huán)保，因此受到人們關(guān)注，仍需進(jìn)一步研究。

除了以上幾種獲取樺木酸的方法之外，還有一些新興方法，例如，通過(guò)生物活性引導(dǎo)的分級(jí)分離法等。

2 樺木酸的藥理活性

樺木酸具有多種藥理活性，主要包括抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激、抗菌消炎等，對(duì)于治療艾滋病及改善免疫力等方面也有顯著效果。

2.1 樺木酸抗腫瘤的研究 最早Pisha 等［20］發(fā)現(xiàn)樺木酸會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)而抑制黑色素瘤生長(zhǎng)。目前，已取得的研究結(jié)果顯示，樺木酸及其衍生物對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有廣泛的作用，例如，對(duì)乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、食道癌、肝癌、成膠質(zhì)瘤、骨肉瘤及橫紋肌肉瘤等均有抑制作用。樺木酸有一定的毒性，但毒性極低，研究發(fā)現(xiàn)即使劑量高達(dá)500 mg／kg 時(shí)，小鼠也并未出現(xiàn)任何毒性反應(yīng)，且對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制毒殺效應(yīng)，而目前臨床上常用的腫瘤藥物細(xì)胞毒性較大，因此，樺木酸用做抗腫瘤藥物具有廣闊的應(yīng)用前景。研究發(fā)現(xiàn)，樺木酸抗腫瘤作用的機(jī)理包括改變?nèi)旧w的特征、直接作用于DNA、增強(qiáng)免疫機(jī)制及鈣泵活性、抑制酶類(lèi)及影響細(xì)胞周期，以發(fā)揮其抗腫瘤的作用。

對(duì)于頭頸癌，樺木酸是通過(guò)增強(qiáng)caspase 的活性，抑制前細(xì)胞凋亡蛋白進(jìn)而毒殺瘤細(xì)胞。研究表明，樺木酸作用于神經(jīng)內(nèi)胚層瘤的線粒體，使其釋放凋亡因子，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤凋亡［21］。由于樺木酸對(duì)人肺癌A549 和Lewis 肺癌小鼠有明顯的抗腫瘤作用，閔雨［22］通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，以抑瘤率為指標(biāo)，研究樺木酸的最佳劑量?；熕幬锿ǔ?huì)產(chǎn)生耐藥性，Zhan 等［23］研究了樺木酸對(duì)紫杉醇抗性肺癌細(xì)胞系（H460）的抗癌潛力，結(jié)果表明，樺木酸可能是治療耐藥性肺癌的有用藥物。Yang 等［24］評(píng)估樺木酸在體外和體內(nèi)對(duì)人腎癌細(xì)胞的抗癌活性，證明了BA 在人腎癌細(xì)胞中的抗癌潛力是通過(guò)觸發(fā)細(xì)胞凋亡并抑制其遷移和侵襲實(shí)現(xiàn)的。

2.2 樺木酸抗氧化應(yīng)激的研究 自然界有很多天然活性物質(zhì)能調(diào)控機(jī)體的氧化應(yīng)激和免疫反應(yīng)，保障機(jī)體穩(wěn)態(tài)及正常的生理機(jī)能。研究表明，樺木酸對(duì)機(jī)體具有抗氧化應(yīng)激作用。黃淑賢等［25］發(fā)現(xiàn)樺木酸能提高大鼠胃粘膜組織中SOD、GSHPx活性，降低MAD 含量，說(shuō)明樺木酸能保護(hù)胃黏膜損傷、增強(qiáng)胃粘膜抗氧化能力及抑制自由基。地塞米松（Dex）是一種有效的抗炎及免疫抑制劑，已被證明可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，Zhu 等［26］發(fā)現(xiàn)BA可有效減輕Dex 誘導(dǎo)的氧化損傷。這些保護(hù)作用可能部分通過(guò)JNK-P38 MAPK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)，BA 可能由于其抗氧化特性而成為潛在的治療劑。易想煉等［27］通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，樺木酸能改善環(huán)磷酰胺引起的小鼠免疫器官的氧化應(yīng)激反應(yīng)，且對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的氧化損傷有預(yù)防性的保護(hù)作用。

2.3 樺木酸抗艾滋病的研究 艾滋病又稱(chēng)獲得性免疫缺陷綜合征，目前臨床治療方法主要是應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑。但有60%的患者由于藥物毒性和耐藥性而導(dǎo)致治療失敗，因此，研制新的抗病毒藥物十分迫切。研究表明，樺木酸類(lèi)衍生物抗艾滋病主要有3 種方式：樺木酸抑制病毒與細(xì)胞膜融合過(guò)程中的后結(jié)合、作為HIV 成熟抑制劑，以及同時(shí)作為HIV-1 融合和成熟抑制劑。與目前所使用的抗HIV-1 藥物相比，樺木酸針對(duì)性更強(qiáng)，不良反應(yīng)較小，有很大的應(yīng)用前景。

2.4 樺木酸免疫調(diào)節(jié)的研究 樺木酸最主要的作用還包括免疫調(diào)節(jié)。Freysdottir 等［28］發(fā)現(xiàn)樺木酸可調(diào)節(jié)人單核細(xì)胞衍生的樹(shù)突細(xì)胞，使其與T 細(xì)胞相互作用，進(jìn)而發(fā)生免疫作用。易金娥等［29］在體外測(cè)定了小鼠腹腔巨噬細(xì)胞能量代謝水平、吞噬能力、腫瘤壞死因子分泌量與谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性、胞外NO 釋放量及SOD 與溶菌酶活性的影響，對(duì)比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樺木酸能激活巨噬細(xì)胞，提高其吞噬能力和能量代謝水平，增強(qiáng)抗氧化能力，提高機(jī)體的免疫力。

2.5 樺木酸抗菌、抗炎的研究 研究發(fā)現(xiàn)，樺木酸在體外能降低微生物的活性，例如，枯草桿菌、大腸桿菌、微球菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌及結(jié)核分支桿菌等，但對(duì)橘青霉無(wú)任何毒性作用［30］。樺木酸對(duì)血清素和角叉菜膠所引起的大鼠足底腫脹也有明顯的抑制作用［31］。樺木酸還可減輕銀屑病癥狀和炎性皮膚病變［32］。除了對(duì)實(shí)驗(yàn)性炎癥模型有明顯的抗炎作用之外，樺木酸與其他天然產(chǎn)物還有協(xié)同抗炎的作用［33］。

2.6 樺木酸抗寄生蟲(chóng)的研究 樺木酸能在體外抑制惡性瘧原蟲(chóng)，且對(duì)紅細(xì)胞期的瘧原蟲(chóng)抑制效果更強(qiáng)，樺木酸C-3 和C-28 衍生物可在體外抗瘧原蟲(chóng)，并表現(xiàn)出較強(qiáng)的活性［34］，但體內(nèi)試驗(yàn)并無(wú)明顯作用。研究發(fā)現(xiàn)用乙酸乙酯提取的樺木酸培養(yǎng)蠕蟲(chóng)7 d，其死亡率高達(dá)98%，效果十分明顯［35］。

2.7 其他藥理活性的研究 樺木酸具有很高的抗糖尿病活性，通過(guò)激活電生理機(jī)制刺激胰島素的分泌，并誘導(dǎo)與代謝生化作用相關(guān)的細(xì)胞去極化，進(jìn)而激活PKC 并確保胰島素的分泌［36］。眾所周知，糖尿病會(huì)導(dǎo)致許多并發(fā)癥，其中糖尿病引起的肝臟病變最為常見(jiàn)，包括非酒精性脂肪肝及肝纖維化。劉妙娜等［37］對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)雄性大鼠肝纖維化的小鼠進(jìn)行樺木酸干預(yù)治療，并以秋水仙素作為對(duì)照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)樺木酸具有抗肝纖維化的活性。最新研究表明，樺木酸還有可通過(guò)保護(hù)微循環(huán)，減輕炎癥反應(yīng)和上調(diào)BDNF 表達(dá)而在老年性癡呆（AD）的治療中發(fā)揮作用［38］。血管性癡呆（VaD）是老年性癡呆的第2 種最常見(jiàn)形式，樺木酸能保護(hù)神經(jīng)，并具有恢復(fù)認(rèn)知障礙和海馬神經(jīng)化學(xué)的能力［39］。此外，樺木酸還具有鎮(zhèn)痛、抗焦慮、驅(qū)蠕蟲(chóng)、抗?jié)?、抗HSV-1 的作用。

3 展望

樺木酸的合成及其藥理作用一直是研究的熱點(diǎn)，樺木酸及衍生物對(duì)于抗腫瘤、抗艾滋、抗菌、抗炎、抗寄生蟲(chóng)等具有較強(qiáng)的生物活性，且毒性低，安全性高，應(yīng)用前景廣闊。隨著研究的深入和科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，樺木酸制備方法也在不斷優(yōu)化，這為樺木酸藥理作用的應(yīng)用也起到了推動(dòng)作用。目前，研究人員利用納米技術(shù)，不僅保留樺木酸的生物活性，還解決了樺木酸水溶性差的缺點(diǎn)；此外，人們也致力于合成多種樺木酸的衍生物，以改善樺木酸的缺點(diǎn)，提高其應(yīng)用前景。雖然樺木酸研究廣泛，但樺木酸在抗炎抗菌等藥理方面應(yīng)用還很少，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。