王 偉, 張翠云, 李金英, 宮月嬌, 康曉靜
(秦皇島市工人醫(yī)院1.婦產(chǎn)科,2.內(nèi)科, 3.超聲科,河北省秦皇島市 066200)
多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是一種復雜異質(zhì)性的內(nèi)分泌疾病,占生育年齡婦女的5%~10%,其特征是慢性無排卵、多囊卵巢和高雄激素血癥[1-3]。PCOS的病因尚不明確,其發(fā)病機制可能是環(huán)境因素與遺傳因素相互作用的結(jié)果。根據(jù)以往的研究,miRNAs參與了包括細胞增殖、分化、凋亡、代謝等過程[4-5]。因此,miRNAs在控制生殖內(nèi)分泌中可能起重要作用,尤其是在卵泡形成和卵母細胞成熟過程中起作用[6]。miR-146a位于人的第5號染色體上,在人體分泌代謝中發(fā)揮核心作用[7]。相對健康女性,PCOS患者中miR-146a的表達水平顯著增加[8]。Pre-miRNA的某些多態(tài)性會影響成熟miRNA的表達或生物學功能發(fā)生變化,顯示miR-146a-5p基因多態(tài)性與多種腫瘤的進展關(guān)系密切[9]。miR-146a在PCOS患者的血漿、卵泡液和顆粒細胞中被上調(diào)[10],提示miR-146a與PCOS存在一定關(guān)系,鑒定其基因多態(tài)性有助于闡明疾病的發(fā)病機制。本研究旨在探討miR-146a-5p基因多態(tài)性與PCOS發(fā)病風險的關(guān)系,以期為PCOS患者臨床治療提供遺傳學依據(jù)。
選取2018年6月—2019年12月本院婦科確診為多囊卵巢綜合征患者122例作為觀察組,年齡22~39歲,平均(27.9±4.7)歲。PCOS的診斷采用2003年鹿特丹診斷標準:①稀發(fā)排卵或無排卵;②高雄激素的臨床表現(xiàn)和(或)高雄激素血癥;③PCO超聲提示:一側(cè)或雙側(cè)卵巢直徑2~9 mm的卵泡≥12個,和(或)卵巢體積≥10 mL。符合以上2條即可診斷為PCOS,排除其他高雄多囊卵巢綜合征疾病如先天性腎上腺皮質(zhì)增生、分泌雄激素的腫瘤、柯興氏綜合征等。選取同期本院體檢正常者110例作為對照組,年齡20~38歲,平均(28.5±4.8)歲。對照組納入標準:正常月經(jīng)周期;內(nèi)分泌值正常;經(jīng)陰超檢查正常周期顯示子宮和卵巢無器質(zhì)性病變,且卵巢無多囊樣表現(xiàn);近3個月內(nèi)未用過激素類藥物病史;排除標準:內(nèi)分泌異常、高血壓、糖尿??;有糖尿病家族史。兩組研究對象在年齡、身高比較差異無顯著性(P>0.05),具有可比性。
研究對象提供外周靜脈血標本后,即刻置于真空抗凝釆血管內(nèi),顛倒混勻防止凝血。采用EDTA抗凝處理,提取血液基因組DNA,血液基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司。
從生物信息學數(shù)據(jù)庫中選擇候選基因位點rs2910164,引物和探針由上海生工生物科技有限公司合成。引物序列:上游引物:5′-TCTACCATACACATCCCCTACA-3′,下游引物:5′-CACACTCCTTATACCTTACGAGC-3′。探針序列:G allele:5′-GTTGTGTCAGTGTCAGACGTC-3′,C allele:5′-CCAGCTGAA GAACTGAATTTGAC-3′。PCR反應體系為20 μL,包括5 μL 10×buffer,8 μL ddH2O,50 mg/L的DNA模板2.0 μL,2 mmol/L脫氧三磷酸核糖核苷(d NTP)2.5 μL,引物(1×10-5mol/L)各1.0 μL和0.5 μL rTaq酶。反應條件:預變性95 ℃ 5 min;變性95 ℃30 s,退火60 ℃30 s,延伸72 ℃ 30 s,共35個循環(huán),終止72 ℃ 10 min。對PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠進行電泳,溴化乙錠染色,分析基因型。
應用SPSS 20.0軟件處理數(shù)據(jù),計量資料采用獨立樣本獨立t檢驗。各組間基因型頻率和等位基因頻率分布差異均采用χ2檢驗。P<0.05表示差異基因型有統(tǒng)計學意義。
觀察組體質(zhì)量、BMI高于對照組(P<0.05);兩組年齡、身高差異無顯著性(P>0.05;表1)。
表1 兩組基本臨床資料比較
觀察組和對照組miR-146a-5p的基因型分布差異有顯著性(P<0.05);miR-146a-5p的基因型在兩組間的分布符合Hardy-Weinberg平衡,具有群體代表性(均P>0.05;表2)。
表2 兩組miR-146a-5p基因型分布 單位:例(%)
觀察組和對照組之間的CG基因型分布存在差異(OR=2.16,95%CI為1.19~3.70,P=0.004)。觀察組中的C等位基因頻率顯著高于對照組(OR=1.78,95%CI為1.15~2.36,P=0.001)。CC+CG基因型顯著增加了PCOS的風險(OR=1.91,95%CI為1.42~2.75,P=0.001)。對年齡和BMI進行調(diào)整后,共顯性、顯性和隱性模型的基因型在OR中均未顯示任何顯著變化(表3)。
表3 兩組miR-146a-5p基因型的頻率分布
以PCOS的發(fā)生風險為因變量,以體質(zhì)量、BMI和miR-146a-5p基因型為自變量,進行Logistic回歸分析,miR-146a-5p rs2910164、體質(zhì)量、BMI是PCOS的獨立危險因素(P<0.05;表4)。
表4 PCOS影響因素的Logistic回歸分析
單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms,SNP)在人類基因組中的發(fā)生核苷酸多態(tài)性頻率比較高,大約每1 000個堿基中就有一個多態(tài)位點[11]。編碼區(qū)中的SNP可能導致同義和非同義變化,非同義變化則會導致氨基酸變化或引入終止密碼子,從而可導致人類疾病,據(jù)研究預測,至少25%的非同義SNP會對蛋白質(zhì)功能產(chǎn)生負面影響[12]。研究表明,F(xiàn)etuin-A基因rs1071592多態(tài)位點與PCOS遺傳易感性存在相關(guān)性[13]。研究發(fā)現(xiàn),血管內(nèi)皮生長因子的rs2010963位點G/C多態(tài)性與多囊卵巢發(fā)病風險綜合征的發(fā)病風險顯著相關(guān),攜帶C等核苷酸位基因(GC+CC)的婦女多囊卵巢綜合征患PCOS風險比GG基因多態(tài)性型較低[14]。在PCOS疾病的發(fā)生過程中可能會有一些miRNAs表達改變,在一定程度上會影響患者卵母細胞質(zhì)量,可能造成不良助孕等影響[15]。rs2910164位于miR-146a前體(Pre-miR-146a)多態(tài)性序列上,堿基G/C的多態(tài)性突變可能導致miR-146a前體的莖結(jié)構(gòu)從G∶U不匹配變?yōu)镃∶U不匹配,可能影響成熟miR-146a的表達及對靶基因的調(diào)控功能[16]。miR-146a的rs2910164位點主要研究多態(tài)性與多種疾病的關(guān)系,miR-146a rs2910164 C等位多態(tài)性核苷酸基因可干擾pre-miR-146a與轉(zhuǎn)錄核因子的結(jié)合DNA,減少pre-miR-146a和核苷酸成熟miR-146a的表達量[17]。
研究表明,肥胖為PCOS發(fā)病的獨立危險因素[18]。miR-146a-5p可參與脂肪形成過程胰島素信號傳導途徑,通過作用多肽蛋白與胰島素受體轉(zhuǎn)氨酶在脂肪形成的過多態(tài)性基因程發(fā)揮重要作用[18]。本研究發(fā)現(xiàn),兩組miR-146a-5p基因rs2910164位點均有CC、CG和GG三種基因型,等位基因頻率在兩組間的分布符合Hardy-Weinberg平衡。miR-146a-5p的rs2910164位點突變與PCOS密切相關(guān)。研究結(jié)果表明,miR-146a-5p rs2910164、體質(zhì)量、BMI是PCOS的獨立危險因素。提示檢測miR-146a-5p中的rs2910164位點的多態(tài)性可以評估婦女PCOS發(fā)病風險。
綜上所述,miR-146a-5p的rs2910164位點C等位基因與PCOS發(fā)病風險增加有關(guān),可以作為預測PCOS發(fā)病風險的潛在生物標志物。