HPLC法同時(shí)測(cè)定蟾靈膏中華蟾毒精、酯蟾毒配基和蟾毒靈成分的含量

柏永淞，魯 杰，陳 庚，葉定勛，杜典河，熊意陵，謝 丹，阮婧華

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550025；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550001)

蟾靈膏是國(guó)醫(yī)大師劉尚義教授的臨床常用膏方，是貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的特色膏方，該方在葛根散的基礎(chǔ)上加用了蟾皮、威靈仙等中藥，具有養(yǎng)陰活血，散結(jié)化癥的功效[1]。蟾皮為蟾蜍科動(dòng)物中華大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor的干燥皮。蟾皮性涼、味辛，有微毒性，有較強(qiáng)的藥理活性，具有止毒消腫，止痛、開(kāi)竅醒神、抗腫瘤等作用，在臨床的應(yīng)用較為廣泛[2]。蟾皮作為蟾靈膏中的君藥，其化學(xué)成分復(fù)雜，主要有蟾蜍甾二烯類(lèi)、吲哚堿類(lèi)、甾醇類(lèi)化合物[2]。其中蟾蜍甾二烯類(lèi)是蟾皮的主要化學(xué)成分，主要包括酯蟾毒配基、蟾毒靈、華蟾毒精等化合物，此類(lèi)成分具有升高血壓、使呼吸興奮的作用，還可治療原發(fā)性肝癌、肺癌、腸癌[3-4]。本文旨對(duì)蟾靈膏中的三種有效成分華蟾毒精、酯蟾毒配基和蟾毒靈采用HPLC法進(jìn)行含量測(cè)定，為蟾靈膏的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀(Agilent Technologies 1260 Infinity Ⅱ)。甲醇(分析純)乙腈(色譜純)乙酸(色譜純)。對(duì)照品：華蟾毒精(四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)：wkq20041609，純度：HPLC≥98%)，酯蟾毒配基(四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)：wkq20062403，純度：HPLC≥98%)，蟾毒靈(四川省維克奇生物科技有限公司，批號(hào)：wkq20061908，純度：HPLC≥98%)。樣品：蟾靈膏(批號(hào)：20200610、20200710、20200810)由貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品的制備 精密稱(chēng)取經(jīng)60℃干燥24 h后的對(duì)照品華蟾毒精1.015 mg、酯蟾毒配基1.002 mg、蟾毒靈0.998 mg，用甲醇溶解并定容至2 ml容量瓶中，過(guò)0.45 μm微孔濾膜得標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照液。

2.2 樣品液的制備 稱(chēng)取三批次蟾靈膏20 g置100 ml具塞錐形瓶中，加入50 ml甲醇80℃回流提取1 h，過(guò)濾，濾液揮干，加入60 ml水飽和正丁醇萃取三次，每次20 ml，合并正丁醇層，將正丁醇層水浴揮干，加入甲醇溶解并定容至10 ml容量瓶中，過(guò)0.45 μm微孔濾膜即得樣品液。

2.3 含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件 Eclipse XDB-C18(5 μm 4.6×250 mm)色譜柱，流動(dòng)相為乙腈(A)-0.3%乙酸溶液(B)(46∶54)等度洗脫(0～20 min 46%A)，柱溫為30℃，流速為1 ml/min，進(jìn)樣量為10 μl，檢測(cè)波長(zhǎng)為296 nm。

2.3.2 線(xiàn)性關(guān)系考察 分別取“2.1”項(xiàng)定容后的對(duì)照品，分別將華蟾毒精、酯蟾毒配基、蟾毒靈用甲醇稀釋到不同濃度。按“2.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析處理，以對(duì)照品峰面積A對(duì)濃度C進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程，見(jiàn)表1。

表1 華蟾毒精、酯蟾毒配基、蟾毒靈線(xiàn)性回歸方程

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別取“2.1”項(xiàng)定容后的對(duì)照品，按“2.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析處理，進(jìn)樣量10 μl，于0、2、4、6、8、10、12 h進(jìn)樣，12 h內(nèi)按“2.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析處理，測(cè)得華蟾毒精、酯蟾毒配基和蟾毒靈峰面積積分值的RSD值分別為2.77%、2.59%、1.99%，表明穩(wěn)定性良好。

取“2.2”項(xiàng)樣品，按“2.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析處理，進(jìn)樣量10 μl，分別于0、2、4、8、16、32 h進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得三批樣品峰面積積分值的RSD值分別為2.87%、2.64%、2.07%，均小于3%，表明樣品32 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 精密度試驗(yàn) 取“2.1”項(xiàng)樣品，按“2.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析處理，與1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算精密度值，結(jié)果表明華蟾毒精、酯蟾毒配基和蟾毒靈精密度分別為1.92%、2.18%、1.88%，RSD值均小于3%，表明精密度良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一份樣品6份，按“2.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析處理，結(jié)果表明華蟾毒精、酯蟾毒配基和蟾毒靈RSD值分別為1.76%、1.89%、1.64%，均小于3%，表明實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性良好。

2.3.6 加樣回收試驗(yàn) 精密稱(chēng)取3批蟾靈膏5 g，并按“2.2”項(xiàng)下方法處理樣品得樣品液，分別加入華蟾毒精、酯蟾毒配基和蟾毒靈對(duì)照品0.03 mg，制成供試品溶液。將供試品溶液按“2.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析處理，進(jìn)樣量10 μl，測(cè)得華蟾毒精、酯蟾毒配基和蟾毒靈平均回收率分別為99.90%、102.60%、99.90%。表明本方法測(cè)得華蟾毒精、酯蟾毒配基和蟾毒靈的準(zhǔn)確性良好。

2.3.7 樣品含量測(cè)定 精密吸取“2.1”項(xiàng)對(duì)照品，將3批蟾靈膏按“2.2”項(xiàng)樣品處理方法處理得3批樣品液，按“2.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行分析處理，進(jìn)樣量10 μl，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 蟾靈膏中3種成分測(cè)定(mg/g)

3 討論

3.1 液相色譜條件的選擇 參照《中國(guó)藥典》2020版第一部“蟾酥”含量測(cè)定項(xiàng)下色譜條件：以乙腈：0.3%乙酸溶液(46:54)為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為296 nm，結(jié)果3種成分對(duì)照峰能夠完全分離，理論塔板數(shù)n>4 000,因此采用本法等度洗脫。采集的混合對(duì)照品如圖所示，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品HPLC圖

3.2 供試品提取方法的選擇 本次實(shí)驗(yàn)對(duì)蟾靈膏中蟾蜍甾二烯類(lèi)提取曾用過(guò)不同的提取溶劑：水、甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇。結(jié)合不同提取的提取方式：超聲提取、索氏回流提取。結(jié)果表明甲醇為溶劑提取效率最高，經(jīng)過(guò)水飽和正丁醇萃取后提取效率更高。并且索氏回流提取法比超聲提取法提取效率高。

考察了不同索氏回流提取時(shí)間15、30、45、60 min，結(jié)果表明15 min時(shí)提取完全不夠，60 min提取效率最高，所以選擇提取60 min。采集的樣品如圖所示，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 蟾靈膏樣品HPLC圖

干蟾皮是中華大蟾蜍的干燥皮，其有效成分與蟾酥類(lèi)似，但是對(duì)于治療癌癥方面蟾皮的療效由于蟾酥[5]，因此本院特色膏方——蟾靈膏以干蟾皮入藥，原因于此。干蟾皮中所含的華蟾毒精、酯蟾毒配基和蟾毒靈既是毒性成分又是有效成分，過(guò)量服用會(huì)對(duì)機(jī)體造成傷害，因此對(duì)其含量要把握準(zhǔn)確，本實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好、專(zhuān)屬性高，結(jié)果也較為理想。該實(shí)驗(yàn)為蟾靈膏的質(zhì)量控制提供參考。