31例兒童脊髓性肌萎縮癥臨床與基因分析

陳瑜毅 韓蘊麗 李 杏 黃詩琴

1.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院（廣西南寧 530021）；2.廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院（廣西南寧 530003）

脊髓性肌萎縮癥（spinal muscular atrophy，SMA）是一種常染色體隱性遺傳病，是由于脊髓前角運動神經元變性，導致肌肉無力和萎縮。臨床表現(xiàn)為累及肢體近端的進行性、對稱性的弛緩性癱瘓與肌萎縮?；町a嬰兒中SMA 的發(fā)生率是1/10000～1/6000，人群攜帶率為1/50[1]，國內人群攜帶率約為1/42[2]。本文對31例SMA 患兒的臨床資料進行回顧性分析，總結SMA 的臨床和基因診斷，探討SMN基因與臨床表型的關系，以提高對SMA的認識，為臨床干預和遺傳咨詢提供幫助。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2014 年2 月至2019 年5 月在廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院診斷的31例SMA患兒及其父母的臨床資料以及基因分析結果。研究對象排除其他以肌無力為特征的相關疾病，包括各種類型的肌營養(yǎng)不良性疾病、腦性癱瘓遲緩型、先天性重癥肌無力、先天性肌病、線粒體肌病、遺傳性感覺運動神經病、脊髓延髓肌萎縮癥等疾病以及臨床資料不完整，未完善神經電生理檢查及基因檢測者。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料收集

收集患兒的起病年齡、性別、肌力、肌張力、運動里程碑發(fā)育等臨床資料，總結臨床及基因分析 結果。

1.2.2 遺傳學檢查

分別采集患兒及父母的外周靜脈血各2 mL 行EDTA 抗凝處理。用QIAmp DNA Blood Mini Kit 提取基因組DNA，分離純化、洗脫收集DNA，提取的DNA 片段進行分子量、濃度和純度等檢測。為避免DNA 分解先進行分裝，置-20℃保存。采用多重連接依賴性探針擴增技術（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA）進行檢測，嚴格按照SALSA MLPA probemix p060-B2 SMA試劑盒（荷蘭 MRC-Holland 公司）說明進行DNA 標本變性、雜交、連接、PCR擴增、片段分離。應用Coffalyser.NET軟件（MRC-Holland，www.mlpa.com-MLPA）進行數據分析。根據試劑盒說明，Ratio值為0時表明沒有拷貝數，為純合缺失；Ratio值為0.40～0.65時拷貝數為1，為雜合缺失；Ratio值為0.80～1.20時拷貝數為2，表示正常；Ratio值為1.30～1.65時拷貝數為3；Ratio值為1.75～2.15時拷貝數為4；Ratio值多于2個拷貝數的即為重復。

1.2.3 SMA分型

入選研究對象按2006 年世界神經病學聯(lián)盟神經肌肉疾病研究組制訂的臨床診斷標準及分型標 準[3]，主要依據起病年齡、病情進展情況及運動發(fā)育里程碑分為4 種主要常見類型。脊髓性肌萎縮癥1型(Werdnig-Hoffman 病)，嬰兒型或嚴重型，一般在生后6個月內起病，生后即出現(xiàn)活動少，肌張力低，抬頭不穩(wěn)，可有宮內胎動減少史，通常在2 歲前死亡，是最嚴重的類型；脊髓性肌萎縮癥2型（Dubowitz ?。瑸橹虚g型，生后6～18 個月起病，患兒能獨坐，但不能獨立行走，可有關節(jié)攣縮和脊柱后凸，生存期一般在2 年以上，多數可活到成年；脊髓性肌萎縮癥3型(Kugelberg-Welander病)，為青少年型，多于生后18個月起病，能夠獨立行走，隨著病情緩慢進展，逐漸出現(xiàn)肌無力癥狀，可伴有骨質疏松和脊柱側彎，生存期可至成年；脊髓性肌萎縮癥4型，晚發(fā)型，亦稱成年型，通常在30歲或更晚起病，起病與進展較隱匿，是最輕的一種類型，運動功能可以達到終身正常行走且生存期與正常人無異。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計學軟件進行數據分析。計數資料以百分比表示，樣本率的比較采用χ2檢驗及Fisher精確檢驗，P<0.05提示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

31例SMA患兒中，男性20例、女性11例，男女比例1.8:1。6月齡內起病12例，占38.7%，年齡中位數為2.5個月；7～18月齡起病17例，占54.8%（17/31），年齡中位數為9 個月；18 月齡后起病2例，占6.5%，年齡中位數為48個月。1型SMA 12例（38.7%），2型17例（54.8%），3型2例（6.5%）。

患兒首發(fā)癥狀均為運動發(fā)育遲緩，13例（41.9%）肌張力低下，9例（29.0%）肌力下降，5例（16.1%）步態(tài)異常，4例（12.9%）生長發(fā)育遲緩。以近端肢體出現(xiàn)肌無力為主，下肢較上肢嚴重，腱反射減弱或消失；患兒均無感覺和認知變化。31例SMA 患兒的臨床資料見表1。

表1 31例SMA患兒臨床資料

2.2 各型SMA患兒SMN1基因第7和/或8外顯子缺失情況

31例臨床診斷SMA患兒中，SMN1第7和8外顯子純合缺失29例，占93.5%，包括1型12例，2型15例，3型2例；僅有第7外顯子缺失者2例，占6.5%（2/31），均為2型SMA。不同類型SMA 的臨床表型與SMN 1基因缺失類型之間差異無統(tǒng)計學意義（P=0.415）。見 表2。

2.3 各型SMA患兒SMN2基因拷貝數變化情況

SMN 2基因拷貝數2 為12例（38.7%），其中1型SMA 10例（83.3%），2型SMA 2例（16.7%）；拷貝數3 或4（重復）為19例（61.3%），其中1型SMA 2例（10.5%），2型SMA 15例（79.0%），3型SMA 2例（10.5%）。本組患兒中，2型和3型SMA患兒的SMN2基因拷貝數顯著高于1型SMA 患兒，3型SMA 患兒的SMN 2基因拷貝數明顯高于2型SMA 患兒，不同SMA 臨床表型與SMN 2拷貝數差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

2.4 SMA患兒父母親SMN1、SMN2基因拷貝數情況

30例（96.8%）患兒的父母親均明確診斷為SMN 1基因雜合缺失；1例（3.2%）患兒父親明確診斷為SMN 1雜合缺失，母親SMN 1基因未檢測到純合或雜合缺失。即有61例（98.4%）雙親攜帶1個SMN 1基因拷貝數，提示為SMA 致病基因攜帶者。包括SMN 1缺失（SMN 1:SMN 2=1:1，16例；SMN 1:SMN 2=1:2，20例）產生的攜帶者36例，占59.1%；SMN1轉換為SMN2（SMN1:SMN2=1:3，13例；SMN 1:SMN 2=1:4，12例）產生的攜帶者25例，占40.9%。1例（1.6%）患兒母親攜帶2 個SMN 1和SMN2基因拷貝數。見表4。

3 討論

根據2006 年世界神經病學聯(lián)盟神經肌肉疾病研究組制訂的SMA 診斷標準及分型標準[3]，依據起病年齡、病情進展情況及運動發(fā)育里程碑，可將SMA分為4型，分別為SMA-1型、SMA-2型、SMA-3型、SMA-4型。因SMA-4型在成人期起病，根據年齡劃分，兒童時期SMA主要為SMA-1型（嬰兒型）、SMA-2型（中間型）及SMA-3型（青少年型）。在臨床上，各型SMA 嚴重程度差別大，起病年齡可從新生兒期至成人期，運動發(fā)育障礙從不能抬頭至可獨立行走，存活期可到嬰幼兒至成年不等。本組31例SMA 患兒中，SMA-1型12例(38.7%)，2型SMA 17例(54.8%)，3型SMA 2例(6.5%)。首發(fā)癥狀包括肌張力低下、肌力下降、步態(tài)異常、生長發(fā)育遲緩等。各類型間在首發(fā)臨床表現(xiàn)中有重疊現(xiàn)象，因此在臨床分型中，還需觀察有無其他臨床表現(xiàn)以及在病情進展過程中患兒運動功能獲得情況作為分型依據。

近年來，隨著分子遺傳學研究迅速發(fā)展，SMA患兒可以通過基因檢測得到明確診斷。運動神經元存活1基因（survival motor neuronal gene 1,SMN1）于1995 年由法國學者Lefebvre 等[4]首次克隆成功，定位于5 q 11.2-13.3 區(qū)域內，該基因缺失是脊髓性肌萎縮癥的致病基礎，其突變導致運動神經元存活蛋白（survival motor neuron，SMN）表達水平降低或功能喪失。體內多數細胞都能耐受低水平的SMN蛋白，但脊髓前角運動神經元不能耐受低水平SMN 蛋白，最終導致疾病的發(fā)生[5]。人類SMN基因有兩個高度同源的拷貝，即SMN1和SMN2；兩者具有5個核苷酸的差異，但在編碼區(qū)僅有1個核苷酸的差異（c.840C>T），導致SMN 2基因轉錄剪切中發(fā)生跳躍，其缺少外顯子7 編碼的核心功能區(qū)，只表達為全長SMN蛋白（FL-SMN）的10%～20%，且大部分編碼1個不具生物功能、極不穩(wěn)定且易分解的截短蛋白（?7-SMN）[6]。因此，SMN2基因只有在SMN1基因缺失情況下才起到劑量補償的作用。

在國內人群中，約95%的SMA 患兒存在SMN 1基因第7外顯子和/或第8外顯子的純合缺失[7]，且大多數同時缺失外顯子7和外顯子8，只有少部分患兒僅缺失外顯子7。本研究采用MLPA技術進行基因檢測。SMN1外顯子7和8純合缺失者有29例，占93.5%，包括1型SMA 12例（41.4%），2型SMA 15例（51.7%），3型SMA 2例（6.9%）；僅外顯子7 缺失者有2例（全部為2型SMA），占6.5%。本組SMA患兒中未發(fā)現(xiàn)只有外顯子8缺失的病例。其原因為SMN基因的終止密碼子位于外顯子7 的末端附近，外顯子8 并不編碼氨基酸。SMA患兒正是由于外顯子7編碼的核心功能區(qū)缺失和SMN 1基因重要功能喪失所致。本研究表明，不同SMA 臨床表型與SMN 1基因缺失類型之間差異無統(tǒng)計學意義，因此，SMN 1基因缺失的測定在各型SMA患兒中具有相同的臨床價值。該結論與Fang等[8]的報道一致。

本研究中，2型和3型SMA 患兒的SMN 2基因拷貝數顯著高于1型患兒，3型SMA 患兒SMN 2基因拷貝數明顯高于2型患兒，表明不同SMA 臨床表型與SMN 2拷貝數有顯著差異，提示SMN 2基因拷貝數與疾病的臨床表型嚴重程度相關。SMN 2基因通常被認為是脊髓性肌萎縮的修飾基因。當SMN1基因缺失時，SMN 2基因通過轉換部分補償了表達全長SMN 蛋白的功能。該結果與Qu等[9]報道一致。另外，相同拷貝數的SMN 2基因可存在于各類型的SMA 患兒中。本研究中SMN2基因拷貝數2為12例，其中1型SMA 10例，2型SMA 2例；拷貝數3或4（重復）為19例，其中1型SMA 2例，2型SMA 15例，3型SMA 2例。因此，雖然SMN2基因的拷貝數可解釋大多數SMA的表型變化，但應該注意的是，SMN 2基因的拷貝數并不能完全預測表型的嚴重程度[10]。這是因為在SMA患兒中還有其他的修飾基因，如神經元凋亡抑制蛋白(neuronal apoptosis inhibitory protein，NAIP）基因、基本轉錄因子2p44 (basal transcription factor 2p44,BTF2p44)基因和H4F5基因。另外在王旻晉等[11]研究中發(fā)現(xiàn)，SMN 2在3型SMA 中有更多的拷貝數5 或6。本研究中沒有發(fā)現(xiàn)更多的SMN2拷貝數，考慮與樣本數量少有關。

另一項研究顯示，約5%的SMA患兒存在SMN1基因復合雜合突變[12]，即存在一個SMN 1基因缺失，并伴有另一個SMN 1基因內的點突變。如果患兒臨床表型與SMA 一致，但未能檢測出SMN 1第7 外顯子純合缺失，有必要再次進行臨床評估，另外應考慮存在SMN1基因點突變的可能性，并需進一步的基因測序證實，從而確定是否為復合雜合突變的SMA 患兒。2個SMN1基因均發(fā)生點突變者極少，國內尚無報道[10]。本研究中31例SMA患兒經MLPA檢測均為純合缺失，未發(fā)現(xiàn)復合雜合突變。這與納入的病例數少 有關。

本研究中有30例（96.8%）患兒父母親明確為SMN 1基因雜合缺失，1例（3.2%）患兒父親明確診斷為SMN 1雜合缺失，母親SMN 1基因未檢測到純合缺失或雜合缺失。即有98.4%的父/母親攜帶1個拷貝數的SMN 1基因，表明他們均為SMA 致病基因攜帶者，其中SMN 1缺失（SMN 1:SMN 2=1:1 和SMN 1:SMN 2=1:2）引起的占59.1%，SMN 1轉換為SMN 2（SMN 1:SMN 2=1:3 和SMN 1:SMN 2=1:4）引起的占40.9%。1例（1.6%）患兒母親攜帶2 個拷貝數的SMN 1基因。推測可能是SMN 1基因“2+0”型（即含2 個拷貝數的SMN 1基因位于同一條染色體上，另一條同源染色體缺失SMN 1基因）、“1+1 D”型（即含1 個拷貝數的SMN 1基因位于一條染色體上，另一條同源染色體發(fā)生點突變）或無義突變等所致。龔波等[13]發(fā)現(xiàn)SMA 攜帶者中有1 個拷貝數的SMN 1和0 個拷貝數的SMN 2個體。但在本研究中并沒有發(fā)現(xiàn)該比值的攜帶者，考慮與研究病例數少 有關。

本研究僅應用MLPA技術進行基因檢測，該方法未能檢測到上述突變。這也需要通過進一步連鎖分析或基因測序來確認。應該對此類父母進行產前遺傳咨詢。因此產前診斷是減少SMA 患兒出生、降低SMA發(fā)生率的一種手段，是減輕社會和家庭負擔最有效的途徑[14]。在部分國家中，SMA檢測方法已被納入孕前篩查[15-17]，特別是對防止先證者家庭再次生育SMA子女具有重要意義。

本研究受檢測條件限制，未對除SMN2以外的修飾基因及可能發(fā)生SMN1復合雜合變異類型進行更深入研究，有待今后聯(lián)合其他檢測方法進一步研究。