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    基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的“當(dāng)歸-川芎”藥對(duì)作用機(jī)制研究

    2021-10-21 02:40:08袁可欣張成玲韋佳慧戴雪杉徐曉玉
    關(guān)鍵詞:川芎內(nèi)酯靶點(diǎn)

    袁可欣,譚 藝,張成玲,韋佳慧,戴雪杉,徐曉玉,陳 怡

    西南大學(xué) 藥學(xué)院中醫(yī)藥學(xué)院/重慶市高校中藥新藥篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/藥學(xué)國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,重慶 400715

    當(dāng)歸性溫味甘,歸肝、 心、 脾經(jīng),具有補(bǔ)血調(diào)經(jīng)、 活血止痛的功效; 川芎性溫味辛,歸肝、 膽、 心包經(jīng),具有活血行氣、 祛風(fēng)止痛的功效.“當(dāng)歸-川芎”常形成藥對(duì)增強(qiáng)其行氣活血、 補(bǔ)血養(yǎng)血的作用,如四物湯、 佛手散、 血府逐瘀湯、 補(bǔ)陽還五湯、 溫經(jīng)湯和生化湯等經(jīng)典名方[1-3],但“當(dāng)歸-川芎”藥對(duì)的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制尚未闡明.網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是融合了系統(tǒng)生物學(xué)、 生物信息學(xué)的新興交叉學(xué)科,近年來,被廣泛應(yīng)用于中藥的研究中,它通過構(gòu)建“藥物-靶點(diǎn)-通路”多層次網(wǎng)絡(luò),系統(tǒng)綜合地觀察中藥對(duì)整個(gè)疾病網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控作用,有利于闡明中藥多成分、 多靶點(diǎn)、 多途徑協(xié)同作用的機(jī)制[4-5].

    本研究通過TCMSP,SEA數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)檢索,收集“當(dāng)歸-川芎”藥對(duì)活性成分及其靶點(diǎn),構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),分析得到關(guān)鍵靶點(diǎn),尋找其與美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)藥物靶點(diǎn)的共同靶點(diǎn),利用TTD和TCMSP數(shù)據(jù)庫分析與共同靶點(diǎn)相關(guān)的疾病,建立“共同靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò).對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行基因功能和KEGG通路分析,將活性成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證.

    1 材料與方法

    1.1 “當(dāng)歸川芎”藥對(duì)活性成分的篩選

    通過檢索TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/index.php),SEA(http://sea.bkslab.org/)數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn),收集“當(dāng)歸-川芎”藥對(duì)中當(dāng)歸、 川芎所含成分,然后利用藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),即口服生物利用度OB≥30%,類藥性DL≥0.18及小腸上皮細(xì)胞滲透率Caco-2≥-0.40,篩選出當(dāng)歸、 川芎的活性成分.

    1.2 “當(dāng)歸川芎”藥對(duì)“成分靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選

    通過檢索TCMSP,SEA數(shù)據(jù)庫,獲得當(dāng)歸、 川芎活性成分的靶點(diǎn),利用蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫UniProt(http://www.uniprot.org/)的搜索功能,將靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為UniProt ID導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫,進(jìn)行成分-靶點(diǎn)間關(guān)聯(lián)性分析,運(yùn)用Cytoscape 3.5.0軟件構(gòu)建出“當(dāng)歸-川芎”藥對(duì)“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò).使用中間介數(shù)、 接近中間度、 度值3個(gè)指標(biāo),對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析,選擇3個(gè)指標(biāo)均大于平均值的靶點(diǎn)作為網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn).

    1.3 共同靶點(diǎn)的篩選以及相關(guān)疾病分析

    利用Drug Bank (https://www.drugbank.ca/)和TTD(https://db.idrblab.org/ttd/)數(shù)據(jù)庫,收集FDA批準(zhǔn)藥物靶點(diǎn),篩選得到關(guān)鍵靶點(diǎn)和藥物靶點(diǎn)的共同靶點(diǎn).利用TCMSP和TTD數(shù)據(jù)庫獲得共同靶點(diǎn)相關(guān)疾病,按照醫(yī)學(xué)主題詞表MeSH(http://www.nlm.nih.gov/mesh/)將疾病分類,運(yùn)用Cytoscape 3.5.0軟件構(gòu)建出“共同靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò).

    1.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)的富集分析和分子對(duì)接

    將關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/),進(jìn)行基因功能和KEGG通路富集分析.從Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中獲取“當(dāng)歸-川芎”藥對(duì)活性成分的分子結(jié)構(gòu),將其與關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入Systems Dock Web Site(http://systemsdock.unit.ois.jp/iddp/home/index)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分子對(duì)接.對(duì)接分?jǐn)?shù)為實(shí)驗(yàn)解離/抑制常數(shù)值(pKd/pKi)的負(fù)對(duì)數(shù),大于4.25,表明分子與靶點(diǎn)具有一定的結(jié)合活性; 大于5.0,表明分子與靶點(diǎn)結(jié)合活性較好; 大于7.0,表明分子與靶點(diǎn)具有強(qiáng)烈的穩(wěn)定性及活性.

    2 結(jié) 果

    2.1 “當(dāng)歸川芎”藥對(duì)的活性成分

    通過檢索TCMSP,SEA數(shù)據(jù)庫,獲得當(dāng)歸成分125個(gè),川芎成分189個(gè),閾值設(shè)定為OB≥30%,DL≥0.18以及Caco-2≥-0.40,共篩選出候選活性成分8個(gè),其中當(dāng)歸2個(gè),川芎6個(gè).通過查閱文獻(xiàn)獲得10個(gè)活性成分,其中當(dāng)歸4個(gè),川芎6個(gè).去除重復(fù)成分,最終得到14個(gè)活性成分,其中川芎和當(dāng)歸共有活性成分4個(gè),分別是咖啡酸、 阿魏酸、 洋川芎內(nèi)酯I、 藁本內(nèi)酯(表1).

    表1 “川芎當(dāng)歸”藥對(duì)的活性成分

    2.2 “當(dāng)歸-川芎”藥對(duì)的“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

    利用TCMSP,SEA數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)川芎12個(gè)活性成分對(duì)應(yīng)127個(gè)靶點(diǎn),當(dāng)歸6個(gè)活性成分對(duì)應(yīng)337個(gè)靶點(diǎn),刪除重復(fù)的靶點(diǎn),“當(dāng)歸-川芎”藥對(duì)14個(gè)活性成分對(duì)應(yīng)257個(gè)靶點(diǎn).“當(dāng)歸-川芎”藥對(duì)的“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)包含257個(gè)節(jié)點(diǎn)和2 388條邊(圖1).分析網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的中間介數(shù)、 接近中間度及度值的平均值,分別為0.003 5,0.441 1,16.925 3,篩選3個(gè)指標(biāo)均大于等于平均值的靶點(diǎn),得到54個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn),其中11個(gè)是當(dāng)歸和川芎共有靶點(diǎn),分別是PTGS1,VDR,PTGS2,CDC25A,CYP19A1,NR1H4,PRKACA,AR,ESR2,ADRB2,NCOA2,這些靶點(diǎn)可能是川芎和當(dāng)歸協(xié)同作用的物質(zhì)基礎(chǔ).

    兩邊的六邊形分別表示川芎和當(dāng)歸的有效成分,其中淺紫色的表示當(dāng)歸和川芎的共有成分,中間的橙色圓形表示“當(dāng)歸-川芎”藥對(duì)的靶點(diǎn),紫色圓形表示關(guān)鍵靶點(diǎn),黃色圓形表示關(guān)鍵靶點(diǎn)中的共有靶點(diǎn).圖1 “當(dāng)歸川芎”藥對(duì)“成分靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

    2.3 “共同靶點(diǎn)疾病”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

    通過TTD和Drug Bank數(shù)據(jù)庫,獲得1 215個(gè)FDA批準(zhǔn)藥物靶點(diǎn),54個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)和FDA批準(zhǔn)藥物靶點(diǎn)有34個(gè)共同靶點(diǎn).通過TTD和TCMSP數(shù)據(jù)庫分析,構(gòu)建的“共同靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)由168個(gè)點(diǎn)和264條邊組成,共同靶點(diǎn)與21組共113種疾病相關(guān),包括腫瘤(14.2%)、 神經(jīng)系統(tǒng)疾病(12.4%)、 心血管疾病(8.8%)、 心理疾病(8.8%)、 病理狀況(7.1%)和女性生殖系統(tǒng)疾病(5.9%)等(圖2),這可能是“當(dāng)歸-川芎”藥對(duì)潛在的治療靶點(diǎn)和對(duì)應(yīng)的疾病.

    紅色橢圓代表關(guān)鍵靶點(diǎn)和FDA批準(zhǔn)藥物靶點(diǎn)的共同靶點(diǎn),紫色菱形代表疾病,黃色長方形代表疾病所屬大類,根據(jù)MeSH分為21組.圖2 關(guān)鍵靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

    2.4 基因功能及KEGG通路富集分析

    34個(gè)共同靶點(diǎn)提示的是“當(dāng)歸-川芎”藥對(duì)潛在作用的疾病,而54個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)能更全面地反映“當(dāng)歸-川芎”藥對(duì)的成分靶點(diǎn),因此將54個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫,從生物學(xué)過程、 分子功能和細(xì)胞組分3個(gè)不同的方面對(duì)基因功能進(jìn)行分析.結(jié)果顯示,54個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)共涉及155個(gè)生物過程、 29個(gè)細(xì)胞組分和66個(gè)分子功能,其中生物過程中排名前5的有Positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter(19個(gè)靶點(diǎn)/35.2%),Transcription DNA-templated(14個(gè)靶點(diǎn)/25.9%),Signal transduction(13個(gè)靶點(diǎn)/24.1%),Negative regulation of transcription from RNA polymerase II promoter(12個(gè)靶點(diǎn)/22.2%),Response to drug(11個(gè)靶點(diǎn)/20.4%).細(xì)胞組分中排名前5的有Nucleus(34個(gè)靶點(diǎn)/63%),Plasma membrane(27個(gè)靶點(diǎn)/50.0%),Nucleoplasm(24個(gè)靶點(diǎn)/44.4%),Cytosol(23個(gè)靶點(diǎn)/42.6%),Cytoplasm(23個(gè)靶點(diǎn)/42.6%).分子功能中排名前5的有Protein binding(46個(gè)靶點(diǎn)/85.2%),Enzyme binding(19個(gè)靶點(diǎn)/35.2%),Transcription factor activity,Sequence-specific DNA binding(13個(gè)靶點(diǎn)/24.1%),DNA binding(13個(gè)靶點(diǎn)/24.1%),Protein homodimerization activity(12個(gè)靶點(diǎn)/22.2%)(圖3).這表明“當(dāng)歸-川芎”藥對(duì)可能參與了人體內(nèi)的多種生物過程.

    圖3 排名前5的基因功能分析

    KEGG通路富集分析結(jié)果顯示,54個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)共參與58條信號(hào)通路過程,其中包括Pathways in cancer,Estrogen signaling pathway,Proteoglycans in cancer,Calcium signaling pathway,HIF-1 signaling pathway等,涉及癌癥、 黏附、 細(xì)胞周期、 炎癥、 細(xì)胞凋亡、 血管生成及激素調(diào)節(jié)等,表2展示了涉及靶點(diǎn)數(shù)目排名前20的通路信息.

    表2 排名前20的KEGG通路信息

    2.5 “當(dāng)歸川芎”藥對(duì)活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)有結(jié)合活性

    將“當(dāng)歸-川芎”藥對(duì)活性成分豆甾醇、 β-谷甾醇、 洋川芎內(nèi)酯A、 藁本內(nèi)酯、 阿魏酸和4-羥基-3-丁基苯酞與度值排名前10的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接.結(jié)果表明,6個(gè)活性成分與7個(gè)靶點(diǎn)對(duì)接成功,其中豆甾醇、 β-谷甾醇、 洋川芎內(nèi)酯A、 藁本內(nèi)酯與NCOA2,ESR2,EP300,ESR1等靶點(diǎn)有較好的結(jié)合活性以及穩(wěn)定性(表3).

    表3 “當(dāng)歸川芎”藥對(duì)活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接

    3 討 論

    當(dāng)歸、 川芎都是血分之主藥,當(dāng)歸味甘,具有養(yǎng)血活血之功效,川芎味辛,是血中氣藥,具有活血祛瘀、 行血散血的功效,兩者相使配伍同用,可增強(qiáng)活血化瘀、 養(yǎng)血活血之功效,因此“當(dāng)歸-川芎”常作為活血化瘀的藥對(duì)使用,但它們配伍增效的物質(zhì)基礎(chǔ)并未闡明,我們通過數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)檢索獲得川芎和當(dāng)歸14個(gè)有效成分,其中4個(gè)共有成分,分別是咖啡酸、 阿魏酸、 洋川芎內(nèi)酯I、 藁本內(nèi)酯.其中咖啡酸和阿魏酸是酚酸類成分,咖啡酸在機(jī)體內(nèi)兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下可轉(zhuǎn)化成阿魏酸,而阿魏酸具有抗氧化、 抗血栓、 降血脂、 降低心肌缺氧、 抗菌、 抗腫瘤和腦保護(hù)等多種藥理作用[6-7].洋川芎內(nèi)酯I和藁本內(nèi)酯是苯酞類成分,洋川芎內(nèi)酯I具有保護(hù)腦、 抗凝血作用,藁本內(nèi)酯具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、 抗炎鎮(zhèn)痛、 抗老年癡呆、 抗腦缺血、 抗腫瘤、 抗脂質(zhì)過氧化、 改善微循環(huán)等作用[8-9].這些共有成分可能是“當(dāng)歸-川芎”藥對(duì)配伍增效的物質(zhì)基礎(chǔ),可以進(jìn)一步通過成分敲出、 敲入等技術(shù)來驗(yàn)證.

    “當(dāng)歸-川芎”常常配對(duì)使用,尤其多見于一些治療婦科疾病的名方,比如四物湯、 佛手散、 血府逐瘀湯、 溫經(jīng)湯等.通過數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn),構(gòu)建和分析“當(dāng)歸-川芎”藥對(duì)的“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),獲得54個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn),其中11個(gè)是川芎和當(dāng)歸共有靶點(diǎn),分別是PTGS1,VDR,PTGS2,CDC25A,CYP19A1,NR1H4,PRKACA,AR,ESR2,ADRB2,NCOA2.有研究發(fā)現(xiàn)PTGS2是FDA批準(zhǔn)的治療子宮內(nèi)膜異位癥的靶點(diǎn)之一[10],而且“當(dāng)歸-川芎”藥對(duì)中的阿魏酸和川芎嗪能抑制PTGS2的表達(dá)[11-14].CYP19A1參與雌激素合成,ESR2是雌激素受體,分子對(duì)接結(jié)果中,豆甾醇、 β-谷甾醇、 洋川芎內(nèi)酯A、 藁本內(nèi)酯與ESR2有較好的結(jié)合活性,也有研究發(fā)現(xiàn)阿魏酸和川芎嗪能抑制雌激素水平[4,10],但是“當(dāng)歸-川芎”藥對(duì)及其活性成分對(duì)CYP19A1和ESR2的作用還未見報(bào)道,值得研究.其中34個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)也是FDA批準(zhǔn)藥物靶點(diǎn),PTGS2,ESR2可作為治療女性生殖系統(tǒng)疾病及妊娠并發(fā)癥的靶點(diǎn),進(jìn)一步KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn),關(guān)鍵靶點(diǎn)調(diào)控多條與雌激素、 孕激素相關(guān)的通路,包括Estrogen signaling pathway,Oxytocin signaling pathway,Progesterone-mediated oocyte maturation,GnRH signaling pathway,Endocrine and other factor-regulated calcium reabsorption,這可能是“當(dāng)歸-川芎”配對(duì)用于治療婦科疾病的機(jī)制,值得進(jìn)一步深入研究.

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