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    雌激素及其受體ERβ在氰戊菊酯所致雄性大鼠生殖毒性中的作用

    2021-10-21 02:40:16李興元孔德營

    郭 茂,陳 琰,李興元,孔德營

    遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室,貴州 遵義 563000

    氰戊菊酯(Fenvalerate,F(xiàn)en)是一種Ⅱ型擬除蟲菊酯類農(nóng)藥,因其具有高效、 低毒、 低殘留等特點,而被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和家庭生活中,但其對人類的生殖健康具有明顯的危害性.研究表明,氰戊菊酯是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物[1],具有明顯的雄性生殖毒性,可通過影響睪酮合成相關(guān)酶和蛋白的表達而影響雄性體內(nèi)睪酮的含量,以及影響支持細胞和間質(zhì)細胞的功能來干擾下丘腦-垂體-性腺軸的調(diào)節(jié)作用[2-5],使雄性生精過程受損,導(dǎo)致精子數(shù)量減少及活力降低.此外,研究表明,雄性體內(nèi)的雌激素對雄性生殖功能也具有重要調(diào)節(jié)作用[6],氰戊菊酯在干擾睪酮分泌的同時,是否也干擾了雄性體內(nèi)的雌激素分泌以及其受體的表達從而產(chǎn)生生殖毒性?為了驗證我們的猜想,本研究擬通過分析雌激素及其受體ERβ在Fen染毒后的表達情況,探討Fen等擬除蟲菊酯類農(nóng)藥殺蟲劑所致雄性生殖毒性的相關(guān)機制.

    1 材料與方法

    1.1 材 料

    1.1.1 主要試劑

    Fen原藥(純度98.80%),北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司產(chǎn)品; HE染色試劑盒,北京索萊寶科技有限公司; 雌二醇(E2) ELISA試劑盒,上海江萊生物科技有限公司; BCA蛋白濃度測定試劑盒,北京索萊寶科技有限公司; CYP19A1,Caspase 3,Caspase 9抗體,英國Abcam公司; ERβ,Bax,Bcl-2抗體,武漢三鷹生物技術(shù)有限公司; RNA逆轉(zhuǎn)試劑盒和SYBR Premix Ex Taq,日本Takara 公司; TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(增強型綠光),武漢伊萊瑞特生物科技公司.

    1.1.2 儀 器

    低溫高速離心機,美國Thermo公司; 分光光度計(ND2000C型),美國Thermo公司; 酶標儀,美國Bio-Rad公司; 顯影儀,美國Syngene公司; PCR儀,美國Life Technogies公司; 熒光顯微鏡,日本Olympus公司.

    1.2 方 法

    1.2.1 實驗動物與處理

    體質(zhì)量220~250 g健康性成熟的雄性SD大鼠24只,購自重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司,動物許可證號:SCXK(遼)2015-0001.大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后采用隨機數(shù)表法將大鼠分為對照組(Fen 0 mg/kg)、 低劑量Fen染毒組(20 mg/kg)、 高劑量Fen染毒組(40 mg/kg),每組8只.染毒組以玉米油溶解配制成不同濃度的Fen溶液等體積灌胃,灌胃量為每100 g體質(zhì)量0.5 mL,每日1次,灌胃前后大鼠自由攝食、 飲水,連續(xù)染毒30 d(大鼠的一個生精上皮周期為12~15 d),對照組給予等量玉米油.大鼠按12 h白晝的節(jié)律調(diào)節(jié)光照,保持適宜溫度(22±2 ℃)和相對濕度(60%±5%).連續(xù)染毒30 d后,將大鼠稱質(zhì)量后麻醉,心臟采集血樣,然后迅速分離雙側(cè)附睪和睪丸.采集的血液待其凝固后離心(常溫,1 100 r/min,20 min),吸取上清液分裝后于-80 ℃保存,用于檢測血清雌激素水平; 分離的附睪和睪丸迅速稱其質(zhì)量,然后用生理鹽水沖洗表面的血污,附睪立即用于精子計數(shù)及活力檢測,右側(cè)睪丸經(jīng)液氮速凍,-80 ℃凍存,用于測定睪丸雌激素水平,檢測CYP19A1,ERβ,Bax,Bcl-2,Caspase 3及Caspase 9 mRNA和蛋白的表達情況,左側(cè)睪丸用4%甲醛固定后用于病理結(jié)構(gòu)觀察和生殖細胞凋亡檢測.

    1.2.2 精子計數(shù)、 活力及畸形檢測

    參照Kong等[7]的方法并稍作調(diào)整檢測雄鼠附睪精子數(shù)量及活力情況.取單側(cè)附睪尾制備精子懸液,將懸液放入含0.1%牛血清白蛋白的Ham ’s F-12培養(yǎng)基中,放入37 ℃,5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育20 min,光學(xué)顯微鏡下(400×)計數(shù)400個精子中各級活力(a級:快速直線運動; b級:慢速直線運動; c級:原地打轉(zhuǎn)或運動遲緩; d級:無活動)的精子數(shù),計算各級精子活力和活動率.于60 ℃水浴中處死精子,用血細胞計數(shù)法計數(shù)每克附睪中的精子總數(shù).吸取10 μL精子懸液于載玻片上涂片,涼干,甲醇固定30 min,伊紅染液染色10 min,自來水沖洗玻片,涼干后鏡檢,每個樣本計數(shù)1 000個精子,統(tǒng)計正常與畸形精子數(shù),計算精子畸形率.

    1.2.3 睪丸組織病理形態(tài)學(xué)檢查

    取固定于4%甲醛的睪丸組織,經(jīng)梯度乙醇脫水、 浸蠟、 石蠟包埋、 切片(厚4 μm),每只動物隨機選擇4張切片,經(jīng)HE染色,中性樹膠封片,然后于光鏡下觀察其形態(tài)學(xué)變化,如曲細精管的完整性、 生殖細胞的數(shù)量等.

    1.2.4 血清及睪丸雌二醇(E2)檢測

    睪丸組織勻漿制備:用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液PBS(0.01 mol/L,pH值為7.4)沖洗睪丸組織,去除殘留血液,稱質(zhì)量后將組織剪碎.將剪碎的組織按每克的組織樣品加入5 mL的PBS,于冰上充分研磨.最后將勻漿液離心(4 ℃,1 100 r/min,10 min),取上清分裝后于-80 ℃保存用于檢測.操作步驟嚴格按照E2 ELISA試劑盒說明書進行,取E2標準品、 血清或睪丸組織勻漿加入反應(yīng)孔,加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體,37 ℃恒溫箱溫育60 min,洗板,加入反應(yīng)底物,37 ℃恒溫箱避光孵育15 min,加入終止液,測定吸光度(OD值),繪制標準曲線計算濃度.

    1.2.5 Real-time PCR法檢測大鼠睪丸CYP19A1,ERβ,Bax,Bcl-2,Caspase 3及Caspase 9的mRNA表達情況

    取-80 ℃凍存的睪丸組織100 mg研磨成粉末狀,然后采用RNAiso-Plus提取試劑提取樣本總RNA,按產(chǎn)品說明書進行實驗.采用分光光度計測定總的RNA濃度,根據(jù)光度計260 nm和280 nm處的吸光度比值測定其純度.按照RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒要求,將所有樣本總RNA濃度調(diào)整為100 ng/μL,取10 μL進行逆轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)條件:37 ℃ 15 min; 85 ℃ 5 s; 4 ℃保存.按照Real-time PCR試劑盒說明書要求,取cDNA 2 μL,然后依次加入ddH2O,SYBR Premix Ex Taq(2×),上下游引物(各引物序列見表1),PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s; 40個PCR循環(huán)(95 ℃ 5 s; 60 ℃ 30 s).所有反應(yīng)均設(shè)立2個復(fù)孔.記錄每個反應(yīng)管中標本的Ct值,以Gapdh為內(nèi)參基因,通過2-ΔΔCt法計算各染毒組與對照組的CYP19A1,ERβ,Bax,Bcl-2,Caspase 3及Caspase 9 mRNA的相對表達量.

    表1 引物序列

    1.2.6 Western Bolt法檢測大鼠睪丸CYP19A1,ERβ,Bax,Bcl-2,Caspase 3及Caspase 9的蛋白表達情況

    取-80 ℃凍存的睪丸組織60 mg,剪碎后加入裂解液,冰上勻漿并充分裂解30 min,然后離心(4 ℃,13 000 r/min,5 min),取上清.以BCA法測定總蛋白濃度,每孔以50 μg總蛋白量上樣.12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(120 V,1.5 h),恒壓轉(zhuǎn)膜(20 V,40~70 min),室溫封閉2.5 h,4 ℃過夜孵育一抗,室溫孵育二抗1 h,在暗室中用ECL法顯影.目標蛋白相對表達量用目標蛋白的灰度值與內(nèi)參β-actin的灰度值比值表示.

    1.2.7 TUNEL法檢測睪丸生殖細胞凋亡

    本研究采用末端脫氧核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)介導(dǎo)dUTP缺口末端標記法(TUNEL)檢測大鼠睪丸生殖細胞凋亡情況.該技術(shù)的原理是細胞在發(fā)生凋亡時,會激活一些DNA內(nèi)切酶,剪切核小體間的基因組DNA,暴露出3’-OH,然后暴露的3’-OH可在TdT的催化下加上熒光素-12-脫氧三磷酸腺苷(FITC-12-dUTP),而后即可通過熒光顯微鏡觀察生殖細胞的凋亡情況.檢測按試劑盒說明書進行,取睪丸石蠟切片(切片制作同睪丸組織病理形態(tài)學(xué)檢查)經(jīng)脫蠟水合,滴加蛋白K酶工作液37 ℃作用25 min,滴加平衡液室溫平衡20 min,滴加TdT酶工作液37 ℃濕盒避光孵育60 min,滴加DAPI室溫避光孵育8 min進行染核,甘油封片,在熒光顯微鏡下觀察拍照,凋亡細胞呈強綠熒光.TUNEL反應(yīng)陽性細胞計數(shù)是在熒光顯微鏡下(200×)每張切片隨機選取4個不同視野進行計數(shù).

    1.2.8 統(tǒng)計學(xué)處理

    2 結(jié) 果

    2.1 Fen對大鼠睪丸、 附睪質(zhì)量及體質(zhì)量的影響

    如表2所示,與對照組相比,20 mg/kg和40 mg/kg組大鼠睪丸、 附睪質(zhì)量及體質(zhì)量均有所降低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義,p>0.05.

    表2 Fen對大鼠睪丸、 附睪質(zhì)量及體質(zhì)量的影響

    2.2 Fen對雄性SD大鼠附睪精子質(zhì)量的影響

    如表3所示,與對照組相比,20 mg/kg組精子總數(shù)、 各級精子活力及畸形率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05); 40 mg/kg組附睪精子總數(shù)、 a級活力精子、 精子活動率及畸形率(精子畸形情況見圖1)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05或p<0.01).

    表3 Fen對附睪精子數(shù)量、 活力及畸形率的影響

    圖1 Fen染毒后導(dǎo)致的精子畸形情況

    2.3 Fen對雄性SD大鼠血清及睪丸E2水平的影響

    如圖2所示,與對照組相比,20 mg/kg組血清和睪丸中E2水平均未顯著增加(p>0.05); 40 mg/kg組血清和睪丸中E2水平均顯著升高(p<0.05,p<0.01).提示Fen具有提升雄性體內(nèi)E2水平的作用,且這種作用隨Fen染毒劑量的增加而加強.

    與對照組相比,*表示p<0.05,**表示p<0.01,差異有統(tǒng)計學(xué)意義.圖2 Fen對血清及睪丸E2水平的影響

    2.4 Fen對雄性SD大鼠睪丸CYP19A1和ERβ mRNA表達的影響

    如圖3所示,與對照組相比,雄鼠睪丸CYP19A1和ERβ mRNA表達水平均隨染毒劑量增加而上調(diào),CYP19A1 mRNA表達水平在20 mg/kg和40 mg/kg組均極顯著上調(diào)(p<0.01); ERβ mRNA表達水平在20 mg/kg組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05),在40 mg/kg組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01),提示Fen具有上調(diào)雄鼠睪丸CYP19A1和ERβ基因表達的作用.

    與對照組相比,**表示p<0.01,差異有統(tǒng)計學(xué)意義.圖3 Fen對雄性SD大鼠睪丸CYP19A1和ERβ mRNA表達的影響

    2.5 Fen對雄性SD大鼠睪丸CYP19A1和ERβ蛋白表達的影響

    如圖4所示,與對照組相比,雄鼠睪丸CYP19A1和ERβ蛋白表達水平均隨染毒劑量增加而增加,CYP19A1在20 mg/kg組和40 mg/kg組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05,p<0.01); ERβ在20 mg/kg差異無統(tǒng)計學(xué)意義(p>0.05),在40 mg/kg組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01),提示Fen具有上調(diào)雄鼠睪丸CYP19A1和ERβ蛋白表達的作用.

    與對照組相比,*表示p<0.05,**表示p<0.01,差異有統(tǒng)計學(xué)意義.圖4 Fen對雄性SD大鼠睪丸CYP19A1和ERβ蛋白表達的影響

    2.6 Fen對雄性SD大鼠睪丸Bax,Caspase 3,Caspase 9及Bcl-2 mRNA表達情況的影響

    如圖5所示,與對照組相比,雄鼠睪丸Bax,Caspase 3及Caspase 9 mRNA表達水平均隨染毒劑量增加而上調(diào),Bcl-2 mRNA表達水平隨染毒劑量增加而下調(diào),Bax,Caspase 3及Caspase 9 mRNA表達水平在40 mg/kg組均極顯著上調(diào)(p<0.01),Bcl-2 mRNA表達水平在20 mg/kg組顯著下調(diào)(p<0.05),在40 mg/kg組極顯著下調(diào)(p<0.01).

    與對照組相比,*表示p<0.05,**表示p<0.01,差異有統(tǒng)計學(xué)意義.圖5 Fen對雄性SD大鼠睪丸Bax,Caspase 3,Caspase 9及Bcl-2 mRNA表達情況的影響

    2.7 Fen對雄性SD大鼠睪丸Bax,Caspase 3,Caspase 9及Bcl-2蛋白表達的影響

    如圖6所示,與對照組相比,雄鼠睪丸Bax,Caspase 3,Caspase 9蛋白表達水平均隨染毒劑量增加而上調(diào),Bcl-2蛋白表達水平隨染毒劑量增加而下調(diào),Caspase 3,Caspase 9及Bcl-2蛋白表達水平在40 mg/kg組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01); Bax蛋白表達水平在20 mg/kg和40 mg/kg組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.05,p<0.01).

    與對照組相比,*表示p<0.05,**表示p<0.01,差異有統(tǒng)計學(xué)意義.圖6 Fen對雄性SD大鼠睪丸Bax,Caspase 3,Caspase 9及Bcl-2蛋白表達的影響

    2.8 Fen對雄性SD大鼠睪丸曲細精管中生精細胞凋亡的影響

    如圖7顯示,與對照組相比,F(xiàn)en染毒組雄鼠睪丸生殖細胞凋亡數(shù)量(1個視野中)增加,在40 mg/kg組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01),提示隨著Fen染毒劑量的增加,雄鼠睪丸生殖細胞凋亡逐漸增多.

    藍色熒光為細胞核(DAPI染色),綠色熒光為凋亡細胞(箭頭所示).與對照組相比,**表示p<0.01,差異有統(tǒng)計學(xué)意義.圖7 Fen對雄性SD大鼠睪丸生殖細胞凋亡情況的影響

    2.9 Fen對雄性SD大鼠睪丸病理結(jié)構(gòu)的影響

    如圖8所示,對照組大鼠曲細精管結(jié)構(gòu)完整,生精細胞數(shù)量多,排列緊密; 20 mg/kg組大鼠睪丸曲細精管生精細胞數(shù)量減少,部分曲細精管出現(xiàn)了較為嚴重的生精細胞缺失(箭頭所示); 40 mg/kg組大鼠睪丸曲細精管生精細胞數(shù)量進一步減少,可見部分曲細精管生精細胞排列紊亂,生精細胞缺失嚴重,管腔內(nèi)精子較少.

    圖8 Fen對睪丸曲細精管結(jié)構(gòu)的影響

    3 討 論

    正常雄性生育能力的維持依賴于精子發(fā)生的有效進行.正常有效的精子發(fā)生既有賴于睪丸中的生精細胞、 支持細胞和間質(zhì)細胞之間的密切協(xié)調(diào),又受到下丘腦-垂體-性腺軸的生殖內(nèi)分泌調(diào)控,同時這兩個方面之間還相互協(xié)調(diào)、 相互依存,彼此密不可分.在生殖內(nèi)分泌調(diào)控中,雄性精子發(fā)生主要受黃體生成素介導(dǎo)的睪酮分泌的調(diào)控,但雌激素在雄性精子發(fā)生過程中也同樣起著不可或缺的作用.研究顯示,適量的雌激素在雄性生殖中具有促進精子發(fā)生、 抑制生殖細胞凋亡、 提高精子受精能力等作用[8-10],而雄性體內(nèi)雌激素的含量過低或過高均會引起雄性精子發(fā)生異常以及生殖能力下降[11-12].

    在藥理學(xué)和毒理學(xué)中,體質(zhì)量及臟器系數(shù)是一個關(guān)鍵的毒性觀察指標.結(jié)果顯示,青春期雄性SD大鼠暴露于Fen后,大鼠的體質(zhì)量及附睪和睪丸的臟器系數(shù)均出現(xiàn)減小的趨勢,但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,這表明本研究中Fen的劑量對雄鼠整體的生長情況并未產(chǎn)生太大的影響.

    精子質(zhì)量是衡量雄性生殖能力的重要指標[13].在精子發(fā)生的過程中,各級生精細胞對有毒化學(xué)物質(zhì)的作用十分敏感,易受到有毒化學(xué)物質(zhì)的干擾而導(dǎo)致精子的數(shù)量減少和活力降低.本研究的結(jié)果表明,F(xiàn)en染毒后,各染毒組精子數(shù)量、 精子活力和精子活動率均較對照組降低,精子畸形率較對照組增加,且在40 mg/kg組差異有統(tǒng)計學(xué)意義,這與Zhang等[14]的研究結(jié)果一致.這說明Fen對雄性的生殖能力具有損害作用.

    雌二醇(E2)是雄性體內(nèi)最主要的雌激素.本研究的結(jié)果表明,在Fen連續(xù)染毒30 d(兩個生精上皮周期)后,雄性大鼠血清和睪丸中E2含量均較對照組增高,并且在40 mg/kg組,二者差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,這表明Fen可促進雄性體內(nèi)E2的生成,提高雄鼠體內(nèi)雌激素的水平.Carreau等[11]研究發(fā)現(xiàn),雄性睪丸中雌激素水平過高會引起雄性精子發(fā)生異常,使精子質(zhì)量降低,導(dǎo)致雄性生殖能力下降.這提示我們Fen可通過增加雄性睪丸中雌激素的水平而損害雄性生殖功能.

    雄性體內(nèi)的E2由雄激素在睪丸中轉(zhuǎn)化而來,芳香化酶(CYP19A1)是這一轉(zhuǎn)化過程中的關(guān)鍵酶.CYP19A1在雄性睪丸間質(zhì)細胞、 生精細胞及精子中均有表達[15].以往的研究發(fā)現(xiàn),CYP19A1在雄性體內(nèi)低表達或過度表達均會引起雄性精子發(fā)生異常,使精子數(shù)量減少和活力降低,導(dǎo)致雄性生殖損傷甚至不育[6,12,16-18],這主要與CYP19A1表達異常致使雄性睪丸內(nèi)E2合成不足或過量有關(guān)[11-12].本研究中各染毒組睪丸CYP19A1的mRNA和蛋白表達水平較對照組均顯著增加,這與Fen染毒后引起血清和睪丸中E2含量增加的研究結(jié)果相一致.這表明Fen是通過誘導(dǎo)睪丸中CYP19A1的表達,促進雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素,從而升高雄性睪丸中雌激素水平的.

    雌激素發(fā)揮其生理作用需通過其特異性受體(雌激素受體,ERs)的介導(dǎo).ERs屬于激素核受體超家族的成員,其主要包括ERα和ERβ兩種亞型,其中ERβ主要分布于成熟雄性大鼠的支持細胞和生精細胞[19,20],對維持正常雄性生殖能力發(fā)揮著十分重要的作用.Delbes等[21]研究發(fā)現(xiàn),敲除小鼠ERβ可促進小鼠生殖母細胞的增殖同時抑制其凋亡; Gould等[22]和Dumasis等[23]發(fā)現(xiàn),ERβ受體激動劑可促進生精細胞的凋亡.我們的研究結(jié)果顯示,F(xiàn)en可誘導(dǎo)大鼠睪丸中ERβ的mRNA和蛋白高表達,并且40 mg/kg組與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p<0.01).同時,我們還發(fā)現(xiàn),隨著ERβ的表達量升高,雄性大鼠曲細精管發(fā)生凋亡的生精細胞比例也逐漸增加,這與Xie等[24]以及Qu等[25]用雙酚a、 全氟辛烷磺酸等其他環(huán)境內(nèi)分泌干擾物研究的結(jié)果相一致.這些結(jié)果提示我們,F(xiàn)en可能通過誘導(dǎo)雄鼠睪丸中ERβ的表達,過度增強ERβ信號作用,而促進生精細胞的凋亡,使曲細精管中生精細胞數(shù)量和管腔內(nèi)精子數(shù)量減少,但ERβ引起生精細胞凋亡的機制尚不清楚.

    線粒體凋亡途徑是細胞最重要的凋亡途徑之一,在各種外源性病理刺激條件下,Bcl-2家族中的促凋亡蛋白(如Bax,Bad等)發(fā)生去磷酸化,與線粒體膜上的抗凋亡蛋白(如Bcl-2,Bcl-XL等)結(jié)合,而開啟線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔,導(dǎo)致凋亡相關(guān)因子,如細胞色素C、 凋亡誘導(dǎo)因子等從線粒體內(nèi)釋放進入胞漿,激活Caspase家族的凋亡啟動者Caspase 9,Caspase 9激活后能引起Caspase級聯(lián)反應(yīng),最終激活凋亡執(zhí)行者Caspase 3,而引起細胞凋亡[26-28].我們的研究結(jié)果顯示,F(xiàn)en染毒上調(diào)了大鼠睪丸中促凋亡基因Bax,Caspase 3及Caspase 9 mRNA和蛋白的表達水平,同時抑制了抗凋亡基因Bcl-2 mRNA和蛋白的表達.這些結(jié)果似乎提示我們,F(xiàn)en誘導(dǎo)的雄鼠睪丸ERβ過度升高可能與線粒體凋亡途徑的激活之間存在著某種聯(lián)系,但具體機制還有待進一步研究.

    綜上所述,我們猜測Fen通過上調(diào)雄性大鼠睪丸中CYP19A1和ERβ的表達,致使睪丸E2水平升高的同時,又過度增強E2-ERβ信號作用,后者通過某種機制激活線粒體凋亡途徑,從而引起生殖細胞的過度凋亡,精子發(fā)生異常,精子數(shù)量和活力降低,畸形精子增多,最終導(dǎo)致雄性大鼠的生殖損傷.然而Fen是通過何種機制上調(diào)雄性大鼠睪丸中CYP19A1和ERβ的表達水平以及ERβ的高表達是否與生殖細胞線粒體凋亡途徑的激活有關(guān),這些問題都還有待今后進一步明確.

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