miR-30a與其靶基因在肝癌中的作用研究進展

梁雨，沈濤

（昆明理工大學附屬醫(yī)院·云南省第一人民醫(yī)院，云南省臨床病毒學重點實驗室，云南省第一人民醫(yī)院感染性疾病及肝病科，云南省第一人民醫(yī)院腸道微生態(tài)相關(guān)疾病機制和轉(zhuǎn)化應(yīng)用研究省創(chuàng)新團隊，昆明650032）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，每年造成大約70萬人死亡，被認為是第三大癌癥死亡原因[1]。已有報道顯示，由于缺乏敏感和特異性的生物標志物，肝癌不易早期發(fā)現(xiàn)，從而極大地阻礙了其治療的有效性。目前，肝細胞癌最常用的血清生物標志物是甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP），但其在肝癌早期診斷中的價值有限[2]。因此，迫切需要尋找新的生物標記物來提高肝癌的早期發(fā)現(xiàn)和治療。

microRNAs（miRNAs）是一個內(nèi)源性RNA家族，是長度約為18~25nt的非編碼調(diào)控RNA，在基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用。miRNA通過互補堿基配對與特定的mRNA相互作用，從而影響靶基因的表達或穩(wěn)定性。許多研究表明，miRNAs的表達改變與多種生理過程和病理過程（包括癌癥、心血管疾病和代謝性疾?。┟芮邢嚓P(guān)[3]。因此，它們是潛在的穩(wěn)定的非侵入性生物標志物。在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中，miRNAs表達隨疾病進程不同呈顯著差異，隨著對miRNAs研究的深入，一些關(guān)鍵miRNAs在肝癌發(fā)展過程中的抑癌特性被發(fā)現(xiàn)，因此，以miRNAs開發(fā)癌癥診療方法可能是一種安全和有前景的途徑[4]。

miR-30a是近幾年來研究比較熱門的miRNAs之一，在胃癌，結(jié)腸癌，前列腺癌和肝癌等惡性腫瘤中表達下調(diào)，并且可調(diào)控癌細胞的增殖，遷移，凋亡等行為，對腫瘤的發(fā)展產(chǎn)生一定影響。本文將近幾年在肝癌中發(fā)現(xiàn)的miR-30a靶基因及其可能的調(diào)控機制做一綜述，以便部分闡明miR-30a的功能及其在肝癌進展中的作用。

1 miR-30a與HCC

miR-30a定位于6號染色體，其家族成員包含miR-30b、miR-30c1、miR-30c2、miR-30d和 miR-30e，分別定位于不同染色體。miR-30家族成員與多種人類惡性腫瘤相關(guān)，在癌組織中表達水平一般下調(diào)，并可通過靶向不同的靶基因?qū)崿F(xiàn)對癌細胞惡性生物學行為的調(diào)控，進而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

研究報道顯示，miR-30a是與轉(zhuǎn)移性肝細胞癌(HCC)相關(guān)microRNAs之一。miR-30a在肝癌組織和細胞系中表達下調(diào)，與肝癌的血管侵襲、轉(zhuǎn)移潛能和復發(fā)密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-30的過表達對于肝癌細胞的細胞活力，增殖，遷移具有顯著抑制作用[5]，提示其在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能扮演抑癌基因的角色[6]，在腫瘤的診斷中具有重要的參考價值。

2 miR-30a通過靶基因?qū)CC的調(diào)控

已有研究證實，在肝癌組織和相應(yīng)癌細胞系中miR-30a通過調(diào)控其靶基因的表達水平能夠抑制肝癌細胞系的增殖、遷移和侵襲，并且誘導細胞凋亡。隨著包括異黏蛋白（metadherin，MTDH）、K-Ras、叉頭框蛋白A1 （recombinant forkhead box protein A1,FOXAl）、Snai1蛋白、波形蛋白（Vimentin）、肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）及自噬基因Beclin1等越來越多的miR-30a作用靶標被發(fā)現(xiàn)，其在肝癌進展中的作用也被逐漸認識。

2.1 miR-30a通過靶基因調(diào)控HCC增殖與凋亡

MTDH又被命名為星形細胞上調(diào)基因-1（astroeyteelevatedgene-1，AEG-1）。MTDH作為一種原癌基因，其在HCC患者腫瘤組織中較癌旁組織表達增高，且在HCC細胞系較正常肝細胞系表達增高[7,8]。研究發(fā)現(xiàn)，MTDH過表達可激活Wnt/β-catenin、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、NF-κB和PI3K/Akt信號通路，并加速其下游基因的表達，從而促進腫瘤的增殖、克隆形成及抗凋亡。此外，MTDH可抑制磷酸酶和張力蛋白同系物（phosphatase and tensin homolog，PTEN，也稱 mutated in multiple advanced cancers 1，MMAC1）轉(zhuǎn)錄而降低PTEN的表達[7]。PTEN是PI3K/AKT通路的主要負調(diào)控因子，其編碼的蛋白對磷脂酰底物有脫磷脂效應(yīng)，可抑制蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）的磷酸化，從而阻止腫瘤細胞的增殖、遷移、腫瘤血管生成等病理過程。研究表明MTDH在細胞質(zhì)、細胞膜及細胞核中都有表達，且其 mRNA序列3’-UTR含有兩個與miR-30a-5p的結(jié)合位點，分別位于287-294nt和1569-1577nt[7]，可作為miR-30a的直接靶標而轉(zhuǎn)錄受到抑制。臨床樣本數(shù)據(jù)顯示，miR-30a-5p在肝癌組織中的表達水平顯著降低[9]。利用miR-30a-5p模擬物轉(zhuǎn)染肝癌細胞HepG2及SMCC-7721后，細胞中MTDH水平明顯降低，而PTEN表達隨之升高，細胞增殖及克隆形成受到抑制、凋亡增加，即miRNA-30a-5p通過miRNA-30a-5p-MTDH-PTEN/AKT軸降低了肝癌細胞的增殖、侵襲及促凋亡，從而抑制了肝癌的發(fā)展[7,8]。

K-Ras是RAS基因家族成員之一，作為一種原癌基因，其編碼的K-Ras蛋白具有GTPase活性，在多個信號通路中充當分子開關(guān)的作用。k-ras基因在多種腫瘤中都具有突變，在胰腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌等最為常見，ras突變后的產(chǎn)物可以一直處于活化狀態(tài)，與腫瘤的生成、增殖、遷移、擴散以及血管生成均有關(guān)系。通過雙熒光素酶報告基因檢測表明miR-30a可直接與K-Ras mRNA的3’-UTR結(jié)合，并使其下調(diào)。進一步機制研究發(fā)現(xiàn)，在HepG2和MHCC97L癌細胞中，miR-30a的過表達完全阻斷了K-Ras/c-Raf/MEK/ERK通路的激活，抑制肝癌細胞的生長，遷移并誘導細胞凋亡[10]。提示miR-30a通過靶向K-Ras可能調(diào)節(jié)k-Ras/c-Raf / MEK / ERK信號通路部分功能，在肝癌細胞的生長，凋亡和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮抑制作用。

FOXAl是FOXA家族的重要成員之一，主要參與肝臟發(fā)育和代謝。FOXAl是一種轉(zhuǎn)錄因子，已發(fā)現(xiàn)它可以通過突變以三種不同的方式轉(zhuǎn)化為癌基因，分別為FAST、FURIOUS和LOUD，從而驅(qū)動癌癥的發(fā)生[11]。雙熒光素酶報告系統(tǒng)顯示miR-30a能夠直接與FOXAl mRNA的3’-UTR結(jié)合。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-30a模擬物轉(zhuǎn)染HepG2細胞后，F(xiàn)OXAl的蛋白水平出現(xiàn)顯著降低，而上調(diào)FOXAl的表達則可逆轉(zhuǎn)miR-30a對HCC細胞增殖的抑制作用，提示miR-30a可通過抑制FOXAl的蛋白表達而抑制肝癌細胞的增殖[12]。同時，有研究發(fā)現(xiàn)FOXAl也被miR-212負性調(diào)控[13]，提示FOXAl在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中可被多個不同的miRNAs所調(diào)控，可作為HCC重要的分子治療靶點。

2.2 miR-30a通過靶基因調(diào)控HCC轉(zhuǎn)移和侵襲

上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在胚胎發(fā)育、慢性炎癥、組織重建、癌癥轉(zhuǎn)移等過程中具有十分重要的地位。在腫瘤的惡性演進過程中，EMT使得腫瘤細胞得以侵襲和轉(zhuǎn)移，還可能使腫瘤細胞逃逸某些因素誘導的凋亡[14]。因此，在腫瘤的研究中，EMT的發(fā)生預(yù)示腫瘤惡性進程。EMT最顯著的特征就是E-鈣粘蛋白（E-cadherin, E-cad）表達的降低，同時波形蛋白（vimentin）表達的升高。這兩種蛋白在EMT過程中發(fā)揮重要作用，E-cadherin是代表上皮性的標記物，vimentin是代表間葉性的標記物。而Snai1是一個與EMT密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，它能夠抑制E-cadherin表達并促進腫瘤的遷移和侵襲[15]。研究發(fā)現(xiàn)，利用miR-30a模擬物或抑制劑轉(zhuǎn)染MHCC-97H和Hep3B細胞后，miR-30a在細胞中過表達促進E-cadherin表達，降低vimentin表達，從而逆轉(zhuǎn)EMT。進一步研究發(fā)現(xiàn)，細胞中轉(zhuǎn)入miR-30a可導致內(nèi)源性Snai1蛋白和mRNA的表達下調(diào)，而使用拮抗劑阻斷內(nèi)源性miR-30a可導致Snai1蛋白和mRNA上調(diào)，表明Snai1同樣也是miR-30a的直接功能靶點，miR-30a通過靶向EMT相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Snai1而降低腫瘤細胞的遷移和侵襲能力，從而發(fā)揮抑癌作用[16]。此外，miR-30a-5p與miR-30a-3p也參與對HCC中EMT過程的調(diào)控。其中，相較癌旁組織，miR-30a-3p在HCC癌組織中的表達顯著降低。在HCC細胞系中過表達miR-30a-3p可抑制HCC細胞Bel-7402的遷移及侵襲、促進癌細胞凋亡及阻滯在S期。機制研究顯示miR-30a-3p通過降低vimentin和MMP3的表達以及恢復E-cadherin的表達來調(diào)節(jié)肝癌細胞的功能[17]。而miR-30a-5p則可通過靶向vimentin及Snail而調(diào)控肝癌的EMT過程，從而抑制HCC的發(fā)展。

MALAT1是一種致癌的lncRNA，在多種腫瘤組織和細胞系中高度表達，可影響癌細胞的細胞活力、增殖和遷移、克隆形成、細胞周期分布和腫瘤生長[18]。已發(fā)現(xiàn)MALAT1可作為競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）與miRNAs競爭mRNAs的結(jié)合位點，從而使mRNA免受miRNA的調(diào)控而得以保持轉(zhuǎn)錄后的表達[19]。在HCC的體內(nèi)、體外模型中發(fā)現(xiàn)，敲除MALAT1可延緩細胞增殖、遷移及侵襲。研究發(fā)現(xiàn)，MALAT1和miR-30a-5p之間密切相關(guān)。沉默MALAT1和過表達miR-30a-5p均可抑制細胞的遷移和侵襲。MALAT1同樣作為miR-30a-5p的ceRNA，調(diào)節(jié)miR-30a-5p的功能，其表達水平與miR-30a-5p呈負相關(guān)。并且RT-PCR和Western blot分析表明，MALAT1的低表達抑制了肝癌細胞中vimentin的表達水平[20]。因此，MALAT1-miR-30a-5p-vimentin軸可看作是肝癌潛在的治療靶點和分子生物學標記物。

2.3 miR-30a通過靶基因調(diào)控HCC自噬

beclin 1基因是一種自噬相關(guān)基因，它與Bcl-2基因相互拮抗調(diào)控細胞自噬。已有研究證實，上調(diào)細胞中beclin 1的表達水平可促進自噬的產(chǎn)生，抑制腫瘤的發(fā)展[21]。自噬作為細胞自我保護的重要機制，可通過降解細胞內(nèi)受損、變性或衰老的蛋白質(zhì)、細胞器等實現(xiàn)細胞穩(wěn)態(tài)和細胞器更新的過程。但有關(guān)自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用，不同的報道呈現(xiàn)出不一致性。有研究顯示，體內(nèi)和體外實驗中，單獨或聯(lián)合使用蘆薈素和二甲雙胍均可增加自噬蛋白beclin 1、LC3II及ATG8的表達，且可通過抑制磷酸化PI3K、AKT及mTOR水平而促進肝癌細胞HepG2和Bel-7402的凋亡及自噬，從而抑制腫瘤的增殖[22]。已發(fā)現(xiàn)野生型自噬蛋白beclin 1可促進自噬而抑制腫瘤的增殖、侵襲等。beclin1的第295位色氨酸殘基可以被AKT以不依賴于mTOR的方式磷酸化，磷酸化的beclin 1（S295）可進一步與14-3-3蛋白和中間絲蛋白vimentin形成復合物，從而抑制自噬并促進腫瘤發(fā)生[23]。但另有研究顯示，自噬可能通過促進肝癌細胞的抗失巢凋亡和肺部克隆化而促進肝癌的轉(zhuǎn)移[24]。實驗研究表明miR-30a對肝癌細胞具有抗失巢凋亡抑制作用。進一步機制研究發(fā)現(xiàn)，自噬相關(guān)蛋白beclin 1和ATG （autophagy protein 5，ATG-5）是miR-30a的直接下游靶點，介導miR-30a對肝癌細胞自噬活性的影響。利用miR-30a模擬物處理HCCLM3細胞發(fā)現(xiàn)，miR-30a的過表達導致beclin 1和ATG5的蛋白表達下調(diào)，并在饑餓條件下降低了HCCLM3的自噬，從而抑制肝癌細胞的轉(zhuǎn)移[25]，提示基于自噬的肝癌組織特異性靶向治療可能成為肝癌轉(zhuǎn)移治療的新策略。

3 小結(jié)與展望

除了甲胎蛋白外，miRNAs的表達水平也可以作為肝癌更有效的血液早期檢測生物標志物[26]。與鄰近組織相比，miR-30a在HCC中的表達顯著下調(diào)，引起一系列靶基因的異常表達，促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和遷移，但miR-30a的過表達會抑制肝癌細胞的增殖以及在體內(nèi)外的遷移和侵襲，并誘導癌細胞凋亡，阻止肝癌的發(fā)展，提示在肝癌背景下，miR-30a大多被認為是一種腫瘤抑制因子，然而miR-30a在腫瘤中的研究仍處于初步階段，更多的靶基因以及作用機制尚未完全清楚。因此，深入探索miR-30a在肝癌中新的作用靶點，以及在腫瘤發(fā)展過程中產(chǎn)生的分子機制，將有利于進一步揭示其在腫瘤診斷和治療中的潛在價值。