干擾WNT5B抑制胃癌細胞的集落形成、侵襲和遷移

徐龍京，卜爽爽，牛智領

（1濮陽市第三人民醫(yī)院醫(yī)學檢驗科；2濮陽市人民醫(yī)院，濮陽457000）

胃癌（gastric cancer，GC）是全球第5大最常見的惡性腫瘤，也是第3大致死的癌癥類型[1,2]。部分早期GC患者可通過手術治愈[3]。但由于早期GC與胃炎和胃潰瘍等癥狀相似，容易被忽視，造成絕大多數(shù)GC患者確診時已為進展期，手術切除（甚至不可切除）輔以全身化療成為治療GC的主要方式，但其預后不理想，易復發(fā)[4]。因此，尋找影響GC進展的關鍵生物標記物對GC的治療和預后都具有重大意義。

據(jù)報道，幾乎所有的腫瘤中存在無翅型MMTV整合位點家族蛋白（wingless-type MMTV integration site family proteins，WNT）信號的激活，其在腫瘤的發(fā)生、進展和預后中均起著重要作用[5]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過20個WNT家族成員，其中WNT5B是WNT5A的同源物（二者氨基酸總同源性為80.2%）[6]。已知WNT5B在胰腺癌、結直腸癌和肺癌中表達，且表達水平表達與這些癌癥的惡性表型有關[7,8]。另有研究發(fā)現(xiàn)WNT5B在GC細胞高表達[9]，但尚其在GC中的作用尚不明確。因此，本研究將重點觀察WNT5B在胃癌中表達情況及其表達水平與胃癌細胞集落形成、遷移和侵襲的關系，并分析相關機制。

材料和方法

1 臨床樣本采集

2020年2月—8月期間，從在我院接受胃癌手術的患者的手術標本中選擇4對胃腫瘤和癌旁非癌胃組織樣本。本研究中有關患者樣本使用的所有方案均經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

2 細胞

人正常胃粘膜細胞株GES-1和人胃癌細胞株MGC-803、SGC-790、AGS和MKN-45均購自中國科學院上海細胞庫。

3 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）和1%青霉素/鏈霉素混合液購自美國Gibco公司；靶向WNT5B（shRNA）的2種短發(fā)夾的慢病毒載體（WNT5B-shRNA1和WNT5B-shRNA2）以及對照載體（Con-shRNA）由上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司合成；NP-40裂解液、苯基甲磺酰氟（PMSF）、BCA蛋白測定試劑盒、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)和山羊抗兔IgG(H+L)以及Cy3標記山羊抗兔IgG(H+L)均購自上海碧云天生物科技有限公司；小鼠源WNT5B單克隆抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；兔源β-catenin、cyclin D1、c-Myc和GAPDH單克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；增強型ECL化學發(fā)光底物試劑盒購自萬類生物科技（武漢）有限公司；山羊血清、Triton X-100和DAPI試劑購自北京索萊寶生物科技有限公司。

4 細胞培養(yǎng)

GES-1、MGC-803、SGC-790、AGS和MKN-45細胞分別接種于含10%FBS和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基（Gibco，Carlsbad，CA，USA）中，在37℃、5%CO2的潮濕培養(yǎng)箱正常培養(yǎng)。

5 慢病毒載體感染

按照說明書步驟，取對數(shù)生長期的SGC-790和AGS細胞重新以3.5×104/孔的密度接種在6孔板中24h，換液繼續(xù)培養(yǎng)至匯合度達80%時，更換含5μg/ml聚凝胺的培養(yǎng)基并分別添加10MOI的WNT5B-shRNA1、WNT5B-shRNA2和 Con-shRNA繼續(xù)培養(yǎng)12h，再更換新的正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4~5d，收集細胞，用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測感染效率后，用于實驗。

6 蛋白質(zhì)免疫印跡

在冰上用含1mmol/L PMSF的NP-40裂解液將細胞或組織勻漿30~45min后，以1.2×104r/min離心10min收集上清液。使用BCA蛋白測定試劑盒對上清液中蛋白定量后，取樣品（每個樣品均含40μg蛋白）行熱變性（100°C煮5min）后，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進行分離，然后將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（EDM Millipore公司，美國）上。用5%（w/v）脫脂奶（TBS-T配制）室溫封閉30min后，將膜分別與WNT5B（1:2000）、β-catenin（1:400）、c-Myc（1:400）、cyclin D1（1:400）和GAPDH（1:5000）的第一抗體在4°C下孵育過夜，隨后將其用TBS-T清洗2次，并分別與辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG(H+L)或山羊抗兔IgG(H+L)（1:5000）在37°C下孵育45min。再次用TBS-T清洗2次后，用增強型化學發(fā)光底物試劑使蛋白條帶曝光并顯影于膠片。將膠片掃描成電子圖像后，用Image J軟件定量各蛋白的光密度值。量化的目的蛋白表達水平以目的蛋白的光密度值相對于GAPDH蛋白的光密度值的百分比表示。

7 集落形成實驗

分別將500個已感染W(wǎng)NT5B-shRNA1、WNT5B-shRNA2或Con-shRNA的SGC-790和AGS細胞接種在含2ml完全培養(yǎng)基的6孔培養(yǎng)板中。12d后，將細胞用10%（v/v）甲醛（PBS配制）固定15min，用0.1%（w/v）結晶紫溶液染色20min，PBS輕柔洗滌3遍后，將細胞培養(yǎng)板晾干，用數(shù)碼相機拍照并對集落（肉眼可見或>50個細胞）計數(shù)。集落形成率=集落數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

8 劃痕實驗

分 別 將 5×105個 已 感 染 WNT5B-shRNA1、WNT5B-shRNA2或Con-shRNA的SGC-790和AGS細胞接種到6孔板中直至匯合。在中心區(qū)域，用200μl移液器吸頭劃一直線。用無血清培養(yǎng)基沖洗2次后，用含1%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。顯微鏡下拍攝劃痕即刻（0h）和24h時的細胞劃痕圖。用Image J軟件定量攝劃痕即刻（0h）和24h時劃痕間傷口距離。細胞遷移以劃痕愈合率表示。劃痕愈合率=[劃痕間傷口距離（0h）-劃痕間傷口距離（24h）]/劃痕間傷口距離（0h）×100%。

9 Transwell實驗

用帶有8μm孔徑聚碳酸酯濾膜嵌套的24孔Transwell板（Costar公司，美國）直接用于細胞遷移檢測。細胞遷移實驗的方法：將500μl的5×104細胞/ml密度的細胞懸浮液（無血清培養(yǎng)基配制）添加到Transwell小室的上腔室中，將750μl含10%FBS的培養(yǎng)基添加到下腔室，培養(yǎng)24h后，取出嵌套并除去Transwell上腔室濾膜上表面的細胞，將穿濾膜下表面的細胞用10%（v/v）甲醛（PBS配制）固定15min，用0.1%（w/v）結晶紫溶液染色20min。細胞侵襲實驗的方法除了將濾膜涂覆1mg/ml基質(zhì)膠（BD Biosciences公司，美國）外，其他步驟同細胞遷移實驗。顯微鏡下拍攝5~6個隨機視野圖像，并計數(shù)每個視野下細胞數(shù)目，取平均值表示每次獨立實驗的細胞遷移數(shù)或侵襲數(shù)。細胞相對遷移或侵襲率=WNT5B-shRNA細胞遷移或侵襲數(shù)目/Con-shRNA細胞遷移或侵襲數(shù)目×100%。

10 免疫熒光

將已感染W(wǎng)NT5B-shRNA1、WNT5B-shRNA2或Con-shRNA的SGC-790和AGS細胞接種到蓋玻片上，細胞貼壁后，用4%多聚甲醛固定15min。0.5%（v/v）Triton X-100（PBS配制）處理細胞10min，并在室溫下用山羊血清封閉15min。隨后，將細胞與β-catenin初級抗體（1:200）在4°C下孵育過夜。用PBS洗滌2次后，將細胞與Cy3標記山羊抗兔IgG(H+L)（1:200）在室溫下避光孵育1h。用PBS再次洗滌2次后，將細胞用DAPI復染，在BX53熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）20×物鏡下觀察并拍照。

11 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差（），并用SPSS 19軟件進行統(tǒng)計學分析。兩組均數(shù)比較用t檢驗；多于倆組數(shù)據(jù)的均數(shù)的兩兩比較用單因素方差分析事后LSD檢驗。P<0.05則認為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 WNT5B在胃癌組織和胃癌細胞中高表達

為了探索WNT5B在胃癌中的作用，我們首先采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測了胃腫瘤組織和癌旁非腫瘤胃組織中WNT5B表達水平，與癌旁非腫瘤胃組織比較，胃腫瘤組織中WNT5B表達水平明顯升高（圖1A）。進一步檢測人正常胃粘膜細胞株GES-1和人胃癌細胞株MGC-803、SGC-790、AGS和MKN-45中WNT5B表達水平顯示：與GES-1細胞比較，MGC-803、SGC-790、AGS和MKN-45細胞中WNT5B表達水平均明顯升高（圖1B）。

圖1 胃部組織和細胞系中WNT5B水平比較。A，正常胃組織和胃腫瘤組織中WNT5B水平的Western blot檢測；N，癌旁非腫瘤組織；T，胃腫瘤組織。B，人胃粘膜細胞（GES-1）和胃癌細胞（MGC-803、SGC-790、AGS和MKN-45）中WNT5B水平的Western blot檢測。與正常胃組織（A）或正常人胃粘膜細胞（B）比較：***P<0.001; n=4（A）或8（B）Fig. 1 Comparison of WNT5B level in gastric tissues and cell lines. A, Western blot detection of WNT5B expression level in adjacent normal gastric tissues and gastric tumor tissues; N, adjacent normal gastric tissues; T, gastric tumor tissues. B, Western blot detection of WNT5B expression level in human gastric mucosal cells (GES-1) and gastric cancer cells (MGC-803, SGC-790, AGS and MKN-45). Compared with normal gastric tissues (A) or GES-1 cells (B): *P<0.001; n=4 (A) or 8(B)

2 干擾WNT5B可抑制胃癌細胞的集落形成、遷移和侵襲

為評估WNT5B在胃癌發(fā)生過程中的作用，我們采用shRNA法干擾WNT5B表達（圖2A）后，分析了胃癌細胞增值、遷移和侵襲水平的變化。結果顯示，干擾WNT5B可以明顯降低胃癌細胞的集落形成率（圖2B）并抑制遷移和侵襲（圖3）。

圖2 干擾WNT5B對胃癌細胞增殖的影響。A，蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測干擾WNT5B后WNT5B蛋白表達水平。B，集落形成實驗檢測干擾WNT5B后胃癌細胞的增殖能力。與Con-shRNA組相比：*P<0.001；n=8Fig. 2 Effect of WNT5B interference on the proliferation of gastric cancer cells. A, Western blot detection of WNT5B protein level after interfering with its expression. B, colony formation assay for the proliferation level of gastric cancer cells after WNT5B interference. Compared with the Con-shRNA group: *P<0.001; n=8

圖3 干擾WNT5B對胃癌細胞遷移和侵襲的影響。A，劃痕實驗檢測SGC-790和AGS細胞的遷移。B，Transwell實驗檢測SGC-790和AGS細胞的遷移。C，Transwell實驗檢測SGC-790和AGS細胞的侵襲。比例尺，50μm。與Con-shRNA組相比：*P<0.001；n=4Fig. 3 Effect of WNT5B interference on the migration and invasion of gastric cancer cells. A, scratch assay for the migration of SGC-790 and AGS cells. B, Transwell assay for the migration of SGC-790 and AGS cells; C, Transwell assay for the invasion of SGC-790 and AGS cells. Scale bar, 50μm.Compared with the Con-shRNA group: *P<0.001; n=4

3 干擾WNT5B降低胃癌細胞中β-catenin、c-Myc和cyclin D1水平

為了明確干擾WNT5B抑制胃癌細胞增殖、遷移和侵襲的分子機制，對β-catenin信號通路蛋白水平進行了檢測。免疫熒光檢測顯示，與相比，干擾WNT5B后的細胞中WNT5B免疫反應性較Con-shRNA組明顯減弱（圖4A）；蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測顯示，干擾WNT5B后的細胞中β-catenin、c-Myc和cyclin D1水平均較Con-shRNA組明顯降低（圖4B—E）。以上結果表明，干擾WNT5B可抑制胃癌細胞中β-catenin信號活性。

圖4 干擾WNT5B對胃癌細胞中β-catenin信號活性的影響。A，干擾WNT5B對胃癌細胞β-catenin影響的免疫熒光檢測；比例尺，20μm。B，干擾WNT5B對胃癌細胞β-catenin、c-Myc和cyclin D1影響的Western blot檢測及統(tǒng)計學分析；B1，代表性Western blot檢測結果；B2，cyclin D1水平統(tǒng)計學分析；B3，c-Myc水平統(tǒng)計學分析；B4，β-catenin水平統(tǒng)計學分析；與Con-shRNA組相比：*P<0.001（n=8）Fig. 4 Effect of WNT5B interference on the β-catenin signaling activity in gastric cancer cells. A, immunofluorescence assay for the effect of WNT5B interference on the β-catenin expression in gastric cancer cells; scale bar, 20μm. B, Western blot detection for the effect of WNT5B interference on the level of β-catenin, c-Myc and cyclin D1 in gastric cancer cells; B1, representative Western blot results; B2, statistical analysis of cyclin D1 level; B3,statistical analysis of c-Myc level; B4, statistical analysis of β-catenin level; compared with the Con-shRNA group: *P<0.001 (n=8)

討 論

目前GC的治療效果并不令人滿意[4]，而篩選影響GC進展的關鍵標記物可能會為未來對GC治療措施的制定提供理論支持[10]。WNT5B作為WNT家族的成員之一，其已被發(fā)現(xiàn)可促進胰腺癌、結直腸癌和肺癌等多種腫瘤細胞的增殖和遷移[7,8]，敲除WNT5B可抑制三陰乳腺癌細胞的細胞生長和遷移[11]，說明WNT5B可作為多種腫瘤的促癌進展因子。另外，已有文獻報道WNT5B在胃癌MKN-45細胞中高表達[9]，提示W(wǎng)NT5B在胃癌中可能也發(fā)揮重要作用。本研究證實了胃癌組織中WNT5B表達高于正常胃組織，胃癌細胞株中WNT5B表達高于正常胃粘膜細胞株。隨后發(fā)現(xiàn)，干擾WNT5B可抑制胃癌細胞的集落形成、遷移和侵襲，提示靶向干擾WNT5B可能是GC潛在的治療措施之一。

大量研究[5,7,8,11]表明，在絕大多數(shù)腫瘤細胞中均存在WNT信號的持續(xù)活化，且降低WNT信號活性能導致腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲能力降低和凋亡增加。β-catenin作為WNT信號下游最重要的功能分子，其在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[5]。有研究[5,12-15]表明，抑制β-catenin能導致甲狀腺乳頭狀癌、結直腸癌、肺癌和乳腺癌等多種腫瘤細胞的生長和遷移受到抑制，表明β-catenin是腫瘤細胞生長所必需的關鍵蛋白。細胞漿中持續(xù)積累的β-catenin轉(zhuǎn)位至細胞核被認為是β-catenin信號通路被激活的標志[5]。細胞核中β-catenin能與T細胞因子（T cell factor，TCF）/淋巴增強因子（lymphoid enhancer factor，LEF）結合，進而激活cyclin D1和c-Myc等原癌基因?qū)е履[瘤細胞的增殖、細胞周期進程、遷移和侵襲[15,16]。比較直接的證據(jù)[17,18]顯示，抑制β-catenin核轉(zhuǎn)位和表達能降低GC細胞的增殖和遷移。本研究顯示，干擾WNT5B不僅能降低GC細胞的細胞核中β-catenin表達量還能抑制總β-catenin以及β-catenin信號下游cyclin D1和c-Myc的表達，提示干擾WNT5B導致的GC細胞中β-catenin信號通路轉(zhuǎn)導抑制可能是其抑制集落形成、遷移與侵襲的重要原因，但干擾WNT5B通過β-catenin信號通路抗GC的具有機制仍需進一步的詳細工作來闡明。另外，干擾WNT5B是否通過其他信號通路能發(fā)揮抑制GC細胞集落形成、遷移與侵襲的作用也有待進一步研究。