異鼠李素抑制H2O2誘導的黑素細胞ROS水平升高和細胞活性降低

王紅娟，胡雯，雷子賢，康曉靜

（新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院皮膚性病科，新疆皮膚病研究重點實驗室，烏魯木齊 830001）

白癜風是一種慢性炎癥性疾病，其特征是表皮黑色素細胞丟失引起的皮膚脫色。白癜風中黑色素細胞的破壞已被歸因于多種病因?qū)W理論，氧化應激的發(fā)生和CD8+T細胞毒性的產(chǎn)生可直接導致細胞凋亡和分化[1,2]。白癜風的病因和發(fā)病機制尚不明確，較多學者支持氧化應激理論，氧化應激在白癜風的發(fā)生以及發(fā)展中起著重要的作用，可能破壞黑素細胞[3,4]，黑素細胞釋放的HMGB1有助于形成氧化應激引起的白癜風自身免疫[5]。最近研究證明氧化應激有助于暴露源自黑素細胞的自身抗原，此外，氧化應激會促進角質(zhì)形成細胞分泌促動素，從而介導皮膚白細胞病變中T細胞的浸潤[6]。異鼠李素（isorhamnetin, ISO）屬于黃酮類化合物，可抑制乙酰膽堿酯酶活性、氧化應激、細胞凋亡和炎癥[7]。ISO可通過激活Nrf2并促使其下游靶基因（ERK1/2, PKCδ和 AMPK）的表達來發(fā)揮抗氧化應激作用[8]。目前關于ISO對人表皮黑素細胞抗氧化作用的研究未見報道，本實驗初步研究在體外人表皮黑素細胞培養(yǎng)條件下，用ISO預處理黑素細胞，H2O2誘導人表皮黑素細胞氧化應激模型，通過對黑素細胞增殖、黑素合成的檢測，研究ISO對黑素細胞氧化損傷的保護作用及對黑素合成的影響。

材料與方法

1 材料

M2黑素細胞生長培養(yǎng)基DEMEM/F12，含5ng/mL堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）（Promocell公司），0.25%胰酶（含0.02%EDTA）。異鼠李素（中國食品藥品檢定研究院），30% H2O2原液（美國sigma公司），二甲基亞砜（DMSO）（美國sigma公司），CCK-8試劑（日本Dojindo公司），左旋多巴（美國Sigma公司），活性氧檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

2 黑素細胞培養(yǎng)

選用表皮分離吸皰儀在白癜風患者腹部吸皰6個（負壓50 kPa，時間60~90min，每個皰直徑0.8cm），待發(fā)皰看起來透亮后，用注射器將皰液吸出，注入5ml離心管中，0.22μm針頭濾器過濾，-20℃保存。將皰壁沿基底邊緣剪下，加入含青霉素及鏈霉素100U/ml的PBS，常溫放置10min，PBS洗2~3次，將PBS吸干凈，組織盡量剪碎，加入0.25%胰酶0.5ml，4℃消化12~16h后，黑素細胞培養(yǎng)基終止消化，吹打使細胞分散混濁，1500r/min離心3min棄上清，PBS洗2~3次，加入M2黑素細胞選擇性培養(yǎng)基，置37℃，5%二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每3d更換培養(yǎng)基1次，并在顯微鏡下觀察原代黑素細胞貼壁及生長狀況，當黑素細胞達到80%以上融合后，進行傳代培養(yǎng)。

3 黑素細胞增殖的測定

將傳代細胞的濃度調(diào)整至1×104個/孔后加入96孔培養(yǎng)板，每孔150μl；24h細胞貼壁后吸去培養(yǎng)液，加入PBS，用10、20、40、60、80、100μmol/L的異鼠李素處理黑素細胞，并設立空白和陰性對照組，每一處理因素設立3個復孔，置37℃、5%C02條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h；于結束前4h，加入CCK-8液10ul/孔；置酶標儀于490nm波長測吸收光光度值；細胞增殖率=（樣本組吸光度值-空白組吸光度值）/（對照組吸光度值-空白組吸光度值）×l00%。

4 H2O2誘導黑素細胞氧化應激模型濃度篩選

將處于對數(shù)生長期的細胞消化，細胞計數(shù)后，細胞密度為 1×104個/ml，接種于96孔板中，每孔150μl，板周圍一圈加 PBS100μl,以避免邊緣效應，放入37℃，5%CO2，濕度95%以上的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞貼壁進入對數(shù)生長期時加入含有不同濃度 H2O2的培養(yǎng)液 200μl，濃度分別為0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.8mmol/L和1.6mmol/L，對照組為培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。按照 CCK-8 試劑盒操作步驟測定細胞活力，選取黑素細胞活力在50%（IC50）的 H2O2濃度進行后續(xù)實驗。

5 ISO對人表皮黑素細胞增殖測定

將黑素細胞的濃度調(diào)整至1×104個/孔后加入96孔培養(yǎng)板，每孔150μl，細胞貼壁后吸棄培養(yǎng)基，用培養(yǎng)基中含有 10、20、40、60、80、100μmol/L 的ISO處理黑素細胞，并設空白和陰性對照組，每一處理因素設4個復孔，置37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h后加入CCK-8液（10μl/孔），置酶標儀于490nm波長測各孔OD值。

6 ISO對H2O2誘導下人表皮黑素細胞增殖測定

將黑素細胞的濃度調(diào)整至1×104個/孔后加入96孔培養(yǎng)板，每孔150μl；24h細胞貼壁后吸去培養(yǎng)液，加入PBS，用預定劑量ISO預處理黑素細胞，并設立空白和陰性對照組，每一處理因素設立4個復孔，置37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h，換液加入一定濃度的H2O2，共培養(yǎng)24h后，加入CCK-8液（10μl/孔）；置酶標儀于490nm波長測各孔OD值。

7 NaOH裂解法測定黑素含量

選擇對數(shù)生長期細胞制成單細胞懸液后加入6孔板，每孔2×105個；24h細胞貼壁后吸去培養(yǎng)液，加入PBS，用預定劑量ISO處理黑素細胞，并設空白和陰性對照組，置37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)72h；72h后棄上清液，收集細胞，血細胞計數(shù)器進行細胞計數(shù)（重復3次取平均值）；然后PBS洗滌2次，重新溶解于1mol/L NaOH 500μl；80℃烘箱2h后，將1mol/L NaOH加入96孔板，每孔 100μl，設4個復孔，置酶標儀于405nm波長測吸光度值：黑素含量=各孔吸光度值/各孔細胞密度。

8 流式細胞術檢測細胞內(nèi)活性氧水平

選擇對數(shù)生長期細胞制成單細胞懸液后加入6孔板，每孔2×105個；24h細胞貼壁后吸去培養(yǎng)液，加入PBS，用預定劑量ISO處理黑素細胞，并設空白和陰性對照組，置37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)24h，換液加入一定濃度的H2O2，共培養(yǎng)24h后，加入10μmol/L 二氯二氫熒光素二乙酸酯（2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate, DCFH-DA）探針，孵育30min，PBS洗3次，收集細胞，250μl PBS重懸細胞，移入 5ml 流式管中，使用 488nm 激發(fā)波長，525nm 發(fā)射波長，空白組細胞調(diào)零，流式細胞儀檢測實驗組細胞內(nèi)的DCF熒光強度。

9 統(tǒng)計學分析

使用GraphPad Prism 7軟件對實驗結果作圖,數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對檢測數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 原代培養(yǎng)黑素細胞的形態(tài)

原代培養(yǎng)的黑素細胞每間隔2d換液一次，M2培養(yǎng)基可選擇性地殺傷成纖維細胞和角質(zhì)形成細胞，對黑素細胞無影響。培養(yǎng)1周左右，倒置顯微鏡下可觀察到呈梭型的黑素細胞，大部分細胞有2個樹突，少部分有3個樹突。由于表皮中黑素細胞含量較少，黑素細胞以點狀輻射狀生長， 不均勻地鋪在瓶底（圖1A）。約2周后，黑素細胞數(shù)量明顯增多，連接成網(wǎng)狀，達到90%以上融合，即可傳代（圖1B）。傳代后的黑素細胞形態(tài)呈長梭型，鏡下可觀察到正在分裂增殖的黑素細胞（圖1C）。

圖1 原代培養(yǎng)黑素細胞形態(tài)的倒置顯微鏡觀察。A，培養(yǎng)1周；B，培養(yǎng)2周；C，第1次傳代。比例尺，100μmFig. 1 Invert microscopic observation for the morphology of melanocytes. A, cultured for 1 week; B, cultured for 2 weeks; C, after the first passage;scale bar, 100μm

2 H2O2誘導黑素細胞氧化應激模型濃度篩選

CCK-8法分析顯示H2O2可濃度依賴性抑制黑素細胞活性：當H2O2濃度為0.4mmol/L時，黑素細胞活性被抑制約25%；H2O2濃度在0.8mmol/L時，黑素細胞活性被抑制40%~50%；H2O2濃度在1.6mmol/L時，黑素細胞活性被抑制60%~80%（圖2）。細胞活性抑制率較低時（如25%左右）難以得到顯著的藥物作用，細胞活性抑制率過高時（如60%以上）較難得到藥物保護作用，細胞活力抑制率在40%~50%時能更有效的觀察藥物作用，因此H2O2濃度為 0.8mmol/L應為最佳刺激條件。

圖2 H2O2對黑素細胞細胞活力影響的CCK-8法分析（24h）。與對照組比較：*0.01

3 ISO增強人表皮黑素細胞活性

不同濃度ISO處理黑素細胞不同時間后進行CCK-8分析顯示：10 mmol/L、20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L及100μmol/L ISO處理黑素細胞24h和48h后，細胞活力無明顯變化；處理72h后，60μmol/L ISO可顯著增加黑素細胞活力（圖3）。

圖3 ISO對黑素細胞細胞活力影響的CCK-8分析。與對照組比較：*0.01

4 ISO抑制H2O2對人表皮黑素細胞的毒性

CCK-8法檢測顯示：60μmol/L ISO預處理24h再以0.8mmol/L H2O2處理24h或48h的人表皮黑素細胞，其活力顯著高于未用ISO預處理的0.8mmol/L H2O2刺激的細胞的活力（圖4），表明ISO對氧化應激下黑素細胞具有保護作用。

圖4 ISO對H2O2人表皮黑素細胞活力抑制作用的影響。A，H2O2處理24h；B，H2O2處理48h。與對照組比較：*0.01

5 ISO雙向調(diào)節(jié)人表皮黑素細胞黑素合成

NaOH裂解法測定顯示，不同濃度ISO對人表皮黑素細胞合成黑素具有雙向調(diào)節(jié)作用：20μmol/L ISO抑制黑素細胞合成黑素，而80μmol/LISO對人表皮黑素細胞的黑素合成具有促進作用，但當ISO濃度進一步升高時，黑素細胞黑素的合成又被抑制（圖5）。

圖5 ISO對人表皮黑素細胞黑素合成的影響。與對照組（0μmol/L ISO）比較：*0.01

6 ISO預處理對H2O2處理后人表皮黑素細胞內(nèi)ROS水平的影響

采用DCFH-DA探針對ROS水平進行流式細胞術檢測顯示：0.8mmol/L H2O2處理 24h 后，細胞內(nèi)ROS水平較對照組顯著升高，而以60μmol/L ISO預處理24h再用0.8mmol/L H2O2處理細胞，細胞內(nèi)ROS水平的升高顯著減少（圖 6）。

圖6 ISO預處理對H2O2誘導人表皮黑素細胞ROS產(chǎn)生的影響。H2O2組 vs control組：*0.01

討 論

研究表明，氧化應激在白癜風的發(fā)病中起著至關重要的作用，處于進展期白癜風患者表皮中H2O2水平顯著升高[9]。白癜風患者血漿中丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶顯著高于正常人[10]，表明白癜風患者體內(nèi)氧化—抗氧化平衡被打破，大量ROS在體內(nèi)蓄積導致表皮和真皮多種細胞出現(xiàn)氧化損傷。H2O2可使黑素細胞ROS含量增高，氧化應激可能是引起黑素細胞凋亡的重要原因，而白癜風皮損及皮損邊緣存在黑素細胞凋亡[11]。說明H2O2可激活黑素細胞氧化應激，可作為白癜風氧化應激模型。

通過預實驗，我們選擇4個H2O2濃度處理正常人表皮黑素細胞，檢測細胞活力發(fā)現(xiàn)，隨著H2O2濃度升高，黑素細胞活力呈逐漸下降趨勢，H2O2濃度為0.8mmol/L時下降較為明顯，但細胞活力仍保持在50%以上，說明此濃度下既可誘導黑素細胞產(chǎn)生氧化應激狀態(tài)。因此，選擇H2O2濃度為0.8mmol/L作為最佳構建正常人黑素細胞氧化應激模型的條件。有研究報道，ISO對H2O2引起的H9C2細胞氧化應激損傷有保護作用[12]，ISO通過增強抗氧化防御系統(tǒng)、膽堿能神經(jīng)傳遞和突觸可塑性而促進潛在學習、記憶和認知功能[13]。本研究選用不同濃度ISO和不同處理時間刺激黑素細胞，顯示ISO可促進黑素細胞增殖，最終選用60μmol/LISO預處理黑素細胞。CCK-8法觀察ISO對0.8mmol/L H2O2誘導的細損害具有保護效應，60μmol/L ISO預處理能顯著抑制H2O2降低人黑素細胞活力的作用，進一步說明ISO具有抗氧化作用。

黑色素細胞起源于神經(jīng)嵴，占表皮細胞8%[14]。黑素細胞合成黑素，黑色素生成以后從黑色素細胞的樹突傳遞至角質(zhì)形成細胞[15]。在B16F10細胞中，ISO可顯著增加黑素生物合成基因MC1R、MITF、TYR、TYRP1和DCT的表達及提高酪氨酸酶活性[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的ISO對人表皮黑素細胞的黑素合成具有抑制作用，隨著ISO濃度的增高，人表皮黑素細胞的黑素含量也增高，80μmol/L時人表皮黑素細胞的黑素含量高于對照組。160μmol/L人表皮黑素細胞的黑素含量低于對照組，說明ISO較高濃度時可促進人表皮黑素細胞的黑素合成，但ISO濃度到達一定峰值時，對人表皮黑素細胞的黑素合成就會減弱。

氧化應激以線粒體依賴的方式誘導黑素細胞凋亡。ROS在線粒體內(nèi)累積，引起線粒體膜電位丟失，可激活細胞色素C的釋放及caspase級聯(lián)反應，最終導致黑素細胞凋亡[17]。H2O2介導的氧化應激在黑素細胞丟失中起主要作用從而介導白癜風發(fā)生發(fā)展，研究表明，進展期白癜風患者紅細胞和中性粒細胞中活性氧的生成明顯高于健康對照組[18]，由于高水平的活性氧，白癜風患者表皮的抗氧化系統(tǒng)受損。同時，與正常黑素細胞相比，白癜風黑素細胞表現(xiàn)出高氧化應激水平和低抗氧化酶活性，使其對H2O2誘導的氧化應激更敏感[19]。在本研究中，ISO可降低H2O2誘導的人表皮黑素細胞內(nèi)ROS水平，說明ISO可增強黑素細胞抗氧化應激的能力，從而保護人表皮黑素細胞免受氧化應激的損害。

總之，本研究表明黑素細胞活力可隨H2O2濃度增加、處理時間的延長而下降，還發(fā)現(xiàn)了ISO可減輕H2O2對人表皮黑素細胞活力的影響，在一定濃度時，ISO對人表皮黑素細胞的黑素合成具有促進作用，說明ISO對H2O2引起的正常人表皮黑素細胞的氧化損傷具有保護作用。本實驗結果為抗氧化劑ISO應用于白癜風的治療提供了一定的實驗基礎，提示了ISO在白癜風治療中的潛在價值。