阿柏西普減輕高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞損傷和PI3K/AKT信號(hào)通路活化

莊博，張健，孫鐵權(quán)，李佳鑫，喬建偉，韓禹華，李佳鑫

（1遼寧省葫蘆島市中心醫(yī)院眼科，葫蘆島 125000；2遼寧省葫蘆島市中心醫(yī)院龍灣院區(qū)眼科，葫蘆島 125000；3葫蘆島市南票礦務(wù)局總醫(yī)院五官科，葫蘆島 125027；4葫蘆島市連山區(qū)醫(yī)院眼科，葫蘆島 125027；5石家莊市第一醫(yī)院眼科，石家莊 050000）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy, DR）是一種常見(jiàn)的I型和II型糖尿病的微血管并發(fā)癥，在我國(guó)糖尿病患者人群中的發(fā)病率為23.0%[1]。視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelium, RPE）細(xì)胞是DR體外研究的常用眼內(nèi)細(xì)胞之一，具有合成黑色素及生成過(guò)氧化脂質(zhì)等多種生理功能[2,3]。既往研究表明，RPE細(xì)胞長(zhǎng)期處于高糖環(huán)境下可產(chǎn)生活性氧，誘發(fā)氧化應(yīng)激以及炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致RPE細(xì)胞損傷發(fā)生DR[4]。目前對(duì)于RPE細(xì)胞損傷常采用抗氧化類以及抗血管生成類藥物治療[5]。阿柏西普（aflibercept，ABC）是一種抗血管生成的融合蛋白，有研究發(fā)現(xiàn)其可抑制體外培養(yǎng)的高糖環(huán)境下人視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞K+通道，抑制高糖誘導(dǎo)的Müller細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖[6]。然而ABC在DR中的作用機(jī)制尚不清楚。另外，已有研究證實(shí)PI3K/AKT信號(hào)通路的激活與視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞損傷有關(guān)[7]，PI3K/AKT信號(hào)通路的激活可促進(jìn)視網(wǎng)膜新生血管的形成[8]。本研究使用高糖刺激RPE細(xì)胞模擬DR模型，旨在探討ABC通過(guò)PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)高糖誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞損傷的影響。

材料與方法

1 材料與儀器

人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞APRE-19購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；阿柏西普（規(guī)格：0.1ml/4mg，批號(hào)：191211，批準(zhǔn)文號(hào)：注冊(cè)證號(hào)S20180001）購(gòu)自德國(guó)Vetter Pharma-Fertigung GmbH&Co.KG公 司；一抗PI3K磷酸化蛋白（p-PI3K）抗體（1:1000，ab195854）、一抗AKT磷酸化蛋白（p-AKT）抗體（1:1000，ab8933）、GAPDH（1:2000，ab8245）和HRP偶聯(lián)的山羊抗兔IgG（1:2000，ab6721）均購(gòu)自上海Abcam公司；ECL試劑盒購(gòu)自上海Beyotime公司；TBST緩沖液購(gòu)自上海博湖生物科技有限公司；RIPA裂解液、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GPx）ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海江萊生物科技有限公司；白介素-1β（IL-1β）和白介素-6（IL-6）ELISA試劑盒購(gòu)自南京建成生物研究所；SDS-PAGE凝膠電泳液購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海炎熙生物科技有限公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；超氧化物歧化酶（SOD）活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海Abcam公司；3K30低溫高速離心機(jī)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Bio-Rad電泳儀，購(gòu)自南京貝登醫(yī)療股份有限公司；Bio-Rad轉(zhuǎn)膜儀，購(gòu)自上海艾研生物科技有限公司；BD-YG3002熒光顯微鏡，購(gòu)自深圳市博視達(dá)光學(xué)儀器有限公司。

2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

將APRE-19細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、高糖組（HG組）、HG+ABC組。對(duì)照組細(xì)胞置于添加了10%胎牛血清，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，不做任何干預(yù)；HG組細(xì)胞用30mmol/L葡萄糖培養(yǎng)液培養(yǎng)；HG+ABC組細(xì)胞用30mmol/L葡萄糖和2mg/ml ABC的培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境為37℃，5%CO2，收集各組細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3 TUNEL法檢測(cè)APRE-19細(xì)胞凋亡

取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞，5%多聚甲醛固定5min，再用PBS沖洗，用蛋白酶K 20μg/ml消化30min，PBS沖洗細(xì)胞3次，每次5min，再用3% H2O2和0.1% Triton X-100培養(yǎng)10min，之后使用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒染色， 37℃避光孵育1h。孵育結(jié)束后，用PBS洗滌3次，最后用DAPI標(biāo)記1min，在熒光顯微鏡下觀察，并采集圖像。根據(jù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與DAPI陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比值計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

4 ELISA法檢測(cè) IL-1β和IL-6含量

取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于96孔板上，密度為1×104，在37℃下孵育12h，孵育后收集培養(yǎng)液，采用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞中IL-1β、IL-6含量。

5 GPx、SOD活性檢測(cè)

取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，離心后取上清液采用試劑盒測(cè)定細(xì)胞中GPx、SOD活性，GPx活性用ELISA法檢測(cè)，SOD活性用比色法檢測(cè)。

6 Western blot分析

取各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，使用RIPA裂解緩沖液勻漿裂解，高速離心后收集蛋白上清，用BCA蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白進(jìn)行定量，再將蛋白置于水浴鍋中100℃下加熱10min變性。每孔取30μg蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，隨后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用含5%脫脂乳脂的TBST封閉2h，加入一抗于4℃條件下孵育過(guò)夜。TBST溶液漂洗PVDF膜后，再加入HRP偶聯(lián)二抗室溫孵育1h。TBST溶液再次漂洗后使用ECL化學(xué)發(fā)光顯影，采用Image J圖像分析系統(tǒng)分析各組蛋白條帶光密度值，以GAPDH作為內(nèi)參，檢測(cè)各組p-PI3K以及p-AKT的表達(dá)水平。

7 統(tǒng)計(jì)分析

本研究所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析均采用Graphpad Prism 7.0軟件完成，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間的比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

結(jié) 果

1 阿柏西普抑制高糖誘導(dǎo)的APRE-19細(xì)胞凋亡

TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率顯示，HG組與對(duì)照組比較，凋亡率顯著增加；HG+ABC組與HG組比較，凋亡率顯著降低（圖1）。此結(jié)果說(shuō)明高糖刺激APRE-19細(xì)胞可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而ABC可抑制高糖刺激誘導(dǎo)的APRE-19細(xì)胞凋亡。

圖1 TUNEL法檢測(cè)APRE-19細(xì)胞凋亡率。A，代表性TUNEL染色結(jié)果。比例尺，250μm；B，細(xì)胞凋亡率統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；與對(duì)照組比較，***P<0.001；與高糖組比較，**0.001

2 阿柏西普抑制高糖誘導(dǎo)的APRE-19細(xì)胞中IL-1β和IL-6水平升高

ELISA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)IL-1β、IL-6水平顯示：與對(duì)照組相比，HG組細(xì)胞IL-1β和IL-6含量顯著升高；與HG組比較，HG+ABC組細(xì)胞IL-1β和IL-6含量顯著降低（圖2）。由此說(shuō)明高糖刺激可誘導(dǎo)APRE-19細(xì)胞炎癥反應(yīng)，而ABC可抑制高糖刺激誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。

圖2 ELISA法檢測(cè)高糖刺激和ABC對(duì)APRE-19細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響。A，IL-1β水平；B，IL-6水平；與對(duì)照組比較，***P<0.001；與高糖組比較，**0.001

3 阿柏西普抑制高糖誘導(dǎo)的APRE-19細(xì)胞中GPx和SOD活性下降

分別用ELISA法和比色法檢測(cè)APRE-19細(xì)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)GPx和SOD活性顯示：與對(duì)照組相比，HG組細(xì)胞內(nèi)GPx和SOD活性顯著降低；與HG組相比，HG+ABC組細(xì)胞內(nèi)GPx和SOD活性顯著上升，但仍低于對(duì)照組（圖3）。此結(jié)果說(shuō)明高糖刺激可誘導(dǎo)APRE-19細(xì)胞氧化應(yīng)激，而ABC可通過(guò)抑制高糖刺激誘導(dǎo)的GPx和SOD活性降低而改善氧化應(yīng)激。

圖3 ELISA法和比色法檢測(cè)高糖和ABC對(duì)APRE-19細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響。A，GPx水平；B，SOD水平；與對(duì)照組比較，***P<0.001；與高糖組比較，**0.001

4 阿柏西普抑制高糖誘導(dǎo)的APRE-19細(xì)胞中p-PI3K和p-AKT水平上調(diào)

Western blot檢測(cè)顯示：HG組細(xì)胞中p-PI3K和p-AKT水平較對(duì)照組顯著升高；HG+ABC組p-PI3K和p-AKT水平較HG組顯著降低（圖4）。由此說(shuō)明高糖刺激可顯著激活PI3K/AKT信號(hào)通路，而ABC處理后可抑制高糖對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的激活。

圖4 Western blot檢測(cè)高糖和ABC對(duì)I3K/AKT信號(hào)通路的影響。A，p-PI3K水平代表性Western blot檢測(cè)（上）和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（下）；B，p-AKT水平代表性Western blot檢測(cè)（上）和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（下）；與對(duì)照組比較，***P<0.001；與高糖組比較，**0.001

討 論

RPE細(xì)胞參與多種眼底疾病的發(fā)生發(fā)展，在正常情況下含有大量GPx、SOD等抗氧化物質(zhì)，而在DR的發(fā)病過(guò)程中易受損凋亡，導(dǎo)致抗氧化物質(zhì)含量以及活性下降，引起氧化損傷[9,10]。另外， RPE細(xì)胞損傷的病理機(jī)制與高血糖密切相關(guān)，在高血糖狀態(tài)下，過(guò)量的自由基和活性氧會(huì)降低谷胱甘肽的水平，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，最終發(fā)展為病理狀態(tài)[11]。且有研究進(jìn)一步說(shuō)明，高濃度葡萄糖會(huì)誘導(dǎo)視網(wǎng)膜炎癥，增加RPE細(xì)胞中炎性因子的水平，如有研究指出使用高糖處理RPE細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)IL-1β和IL-18的分泌水平以及NLRP3炎癥小體的表達(dá)水平也相應(yīng)上升[12,13]。ABC是一種人源化重組融合蛋白，其通過(guò)與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-A、B及胎盤生長(zhǎng)因子特異性結(jié)合抑制血管生成，在視網(wǎng)膜靜脈阻塞及早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變等眼科疾病中發(fā)揮重要作用[14]。但ABC在RPE細(xì)胞損傷方面的抗炎以及抗氧化作用的研究報(bào)道較少，且其分子機(jī)制尚未明確。

本研究使用濃度為30mmol/L的葡萄糖誘導(dǎo)RPE細(xì)胞損傷，結(jié)果顯示高糖組的細(xì)胞凋亡率顯著增加，細(xì)胞中IL-1β、IL-6水平顯著上升，GPx、SOD活性顯著降低；隨后給予2mg/ml ABC處理細(xì)胞，并觀察ABC對(duì)RPE細(xì)胞的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率升高、細(xì)胞內(nèi)IL-1β和IL-6水平升高顯著降低，GPx和SOD活性的降低明顯減弱，說(shuō)明ABC可顯著減輕高糖誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激。

PI3K/AKT信號(hào)通路與RPE細(xì)胞損傷存在著重要聯(lián)系，如：激活PI3K/AKT信號(hào)通路可促進(jìn)多種促炎因子的表達(dá)，使用高糖處理RPE細(xì)胞后會(huì)激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)PI3K和AKT的磷酸化，從而導(dǎo)致炎性因子過(guò)量分泌[15,16]。在本研究中，高糖組細(xì)胞中p-PI3K以及p-AKT水平顯著升高，經(jīng)ABC處理細(xì)胞后，p-PI3K以及p-AKT水平顯著降低，這說(shuō)明PI3K/AKT信號(hào)通路介導(dǎo)了RPE細(xì)胞損傷，而ABC可抑制PI3K和AKT的磷酸化，抑制高糖誘導(dǎo)的PI3K/AKT信號(hào)通路激活。綜上，本研究首次發(fā)現(xiàn)ABC可通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡、減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，從而改善高糖誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞損傷，為預(yù)防和治療DR提供了一定的理論依據(jù)。