小鼠胚胎心包內(nèi)動脈心外膜的形成及其細胞的分布變化

李云華，王佳佳，曹錫梅，李海榮，景雅，謝建山，楊艷萍

（山西醫(yī)科大學(xué)組織胚胎學(xué)教研室，太原 030001）

心外膜是覆蓋心肌外表面的上皮組織，起源于原始橫膈的心外膜前體（proepicardium，PE）[1,2]。心外膜生長障礙導(dǎo)致心肌不致密、瓣膜畸形和冠狀動脈異常等，因此，研究心外膜的發(fā)育對探討這些畸形的發(fā)生機制具有重要意義。雞胚流出道（outflow tract, OFT）近段的心外膜（epicardium spreading over the cardiac tube，cEP）是PE衍生的，遠段的心外膜稱為動脈心外膜（arterial epicardium，aEP）來自于aPE（arterial proepicardium）[3]，即覆蓋動脈囊基部（OFT與心包腔背側(cè)壁交界處）的心包上皮[4]。小鼠胚胎OFT遠段的心外膜是否同樣有不同于PE的起源仍需證實。

胚胎心臟OFT在分隔前，其管壁由心外膜、心肌和心內(nèi)膜構(gòu)成。OFT心肌來自于第二生心區(qū)（second heart field，SHF），后者包括咽前間充質(zhì)、鰓弓核心間充質(zhì)和心包腔背側(cè)壁臟壁中胚層[5]。OFT形成后，依據(jù)其組織學(xué)結(jié)構(gòu)及重塑結(jié)果可分為心肌部（即OFT近段）和非心肌部（即OFT遠段）。隨發(fā)育，OFT非心肌部分隔為心包內(nèi)升主動脈和肺動脈干[6]。隨后SHF來源的間充質(zhì)細胞分化為動脈中膜的平滑肌細胞（smooth muscle cells，SMCs）[7]，兩動脈壁表面則覆蓋有心外膜。由于SHF前體細胞部分分布于心包腔背側(cè)壁，而Pérez-Pomares等認為的心包內(nèi)主、肺動脈心外膜的起源是動脈囊基部表面的心包膜上皮[4]，二者是否屬于同一結(jié)構(gòu)，即aPE是否屬于SHF尚不清楚。

心外膜細胞可經(jīng)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化形成間充質(zhì)細胞（epicardial-derived cells，EPDCs）。已證實EPDCs 為多能干細胞[8]，可分化為心肌細胞、冠狀血管壁的內(nèi)皮細胞與SMCs[1,8]，也參與房室瓣的形成[9]。而aEP是否也可產(chǎn)生EPDCs，是否參與動脈壁的發(fā)育有待進一步研究。

因此，本研究用免疫組織化學(xué)染色和原代心外膜祖細胞（epicardial progenitor cells，EpiCs）培養(yǎng)等方法系統(tǒng)觀察小鼠胚胎心臟心外膜的形成、OFT的分隔與重塑等過程，探討小鼠胚胎心包內(nèi)aEP的起源，形成過程及其所含細胞在心包內(nèi)主、肺動脈管壁發(fā)育過程中可能的作用。

材料與方法

1 實驗材料

9周齡健康ICR小鼠由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（晉）2019-0004]。雌雄小鼠以2:1于18點合籠，次晨含陰栓雌鼠計為胚齡0.5d（embryonic day 0.5，E0.5）。實驗中對動物的處理方法符合山西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會對動物實驗的要求和規(guī)定。取E9.5—E16胚胎，石蠟包埋，制作7μm連續(xù)石蠟切片。

2 免疫組織化學(xué)染色

ABC法染色：石蠟切片脫蠟、水化、3%過氧化氫、TENG-T預(yù)處理后，分別用兔抗Sox-9抗體（1:50, Santa Cruz公司）、羊抗Tbx18抗體（1: 50, Santa Cruz公司）、兔抗胰島素增強子結(jié)合蛋白1（insulin gene enhancer binding protein 1, Isl1）抗體（1:700,ABclonal公司）、兔抗重組anti-Wilms Tumor蛋白（WT1）抗體（1:1000, Abcam公司）、小鼠抗α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）抗體）（1:1500, 武漢博士德生物工程有限公司）、小鼠抗心肌肌球蛋白重鏈（myosin heavy chain, MHC）抗體(1:1500, Upstate公司）4℃過夜孵育，生物素標(biāo)記羊抗小鼠/兔IgG（武漢博士德生物工程有限公司）或生物素標(biāo)記驢抗羊IgG（1:500, Jackson公司）和SABC試劑分別37℃孵育30min，DAB顯色，顯微鏡下觀察并攝片。

雙重免疫熒光染色：石蠟切片脫蠟、水化、TENG-T預(yù)處理后，選用兔抗Isl1抗體和小鼠抗α-SMA抗體，兔抗WT1抗體和小鼠抗α-SMA抗體混合，4℃過夜孵育，相應(yīng)混合羊抗兔IgG-Cy3和羊抗小鼠IgG-FITC（1:100，武漢博士德生物工程有限公司），37℃避光孵育1h，DAPI室溫10min，抗熒光衰減封片劑封片后，熒光顯微鏡下觀察并攝片。

3 原代心外膜祖細胞培養(yǎng)

體式顯微鏡下解剖出心包內(nèi)主、肺動脈，將組織放入六孔板，蓋壓無菌蓋玻片。滴加含10%血清、1%青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，將6孔板移入培養(yǎng)箱中。48h后移除組織，加入含20ng/ml 血小板衍生生長因子-BB（platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB）(PE-PROTECH公司），倒置顯微鏡繼續(xù)觀察培養(yǎng)并攝片。

4 細胞免疫熒光染色

細胞經(jīng)4%多聚甲醛、0.25%Triton X-100、5%BSA預(yù)處理后，選用兔抗WT1抗體、兔抗Tbx18抗體（1:100, Abcam公司）、兔抗WT1抗體和小鼠抗α-SMA抗體混合、兔抗Tbx18抗體和小鼠抗α-SMA抗體混合，4℃過夜孵育。相應(yīng)選擇羊抗兔IgG-Cy3、混合羊抗兔IgG-Cy3和羊抗小鼠IgG-FITC，37℃避光孵育1h，DAPI室溫8min，抗熒光衰減封片劑封片后，激光共聚焦顯微鏡觀察并攝片。

結(jié) 果

1 E9.5小鼠胚胎OFT的發(fā)育與PE來源心外膜細胞的遷移

E9.5小鼠胚胎，OFT遠端與動脈囊相連（圖1A），該部位心肌細胞特異性標(biāo)記物MHC呈弱陽性（圖1B箭頭），而心肌細胞早期分化標(biāo)記物α-SMA呈強陽性（圖1A箭頭）。SHF前體細胞標(biāo)記物Isl1表達于心包腔背側(cè)壁臟壁中胚層（圖1C細箭頭）以及與之相延續(xù)的OFT遠端（圖1C箭頭），提示Isl1免疫反應(yīng)陽性SHF前體細胞向OFT遠端延伸并分化為心肌細胞。靜脈端可見PE分布有較多WT1或Tbx18免疫反應(yīng)陽性細胞（圖1D、E），與房室管、左心室表面散在的WT1、Tbx18免疫反應(yīng)陽性細胞直接相鄰（圖1D、E箭頭）。提示可能此期PE的細胞已遷移至胚胎心臟房室管，并開始向與房室管相連的心房與心室擴展。

圖1 胚齡9.5d胚胎橫切面α-SMA、MHC、Isl1、WT1和Tbx18表達的免疫組織化學(xué)檢測。A，α-SMA；B，MHC；C，Isl1；D，WT1；E，Tbx18。比例尺，100μm。OFT, 流出道；AS, 動脈囊；AVC, 房室管；AT, 心房；LV, 左心室；PC, 心包腔；PE, 心外膜前體Fig. 1 Immunohistochemical staining for the expression of α-SMA, MHC, Isl1, WT1 and Tbx18 in the transversal sections of mouse embryos at E9.5.A, α-SMA; B, MHC; C, Isl1; D, WT1; E, Tbx18. Scale bar, 100μm. OFT, outflow tract; AS, aortic sac; AVC, atrioventricular canal; AT, atrium; LV, left ventricle; PC, pericardial cavity; PE, proepicardium

2 E10.5小鼠胚胎OFT的發(fā)育與心外膜的形成

E10.5小鼠胚胎，動脈囊仍位于心包腔外（圖2A）。MHC在OFT壁的表達與E9.5相似，由近端向遠端逐漸減弱（圖2B箭頭），而在OFT壁與心包腔背側(cè)壁返折處，Isl1與α-SMA表達較強（圖2A、C箭頭），說明Isl1陽性細胞繼續(xù)向心肌細胞分化并向OFT遠端添加，使OFT增長。Isl1免疫反應(yīng)陽性的SHF細胞分布于心包腔背側(cè)壁（圖2C細箭頭）與前腸腹側(cè)間充質(zhì)（圖2C星號）。連續(xù)切片觀察，WT1和Tbx18免疫反應(yīng)陽性的心外膜細胞呈單層扁平狀，廣泛分布于心房、房室管、心室壁的外表面（圖2D、E）。在與右心室相接的OFT壁，WT1和Tbx18陰性表達，說明OFT壁心外膜尚未形成（圖2F、G）。此期由胚胎動脈端到靜脈端，心包壁層大部表達WT1（圖2H箭頭），但在Isl1陽性的心包腔背側(cè)壁（圖2I箭頭）未見WT1陽性細胞分布（圖2H）。

圖2 胚齡10.5d心橫切面α-SMA、MHC、Isl1、WT1和 Tbx18表達的免疫組織化學(xué)檢測。A，α-SMA；B，MHC; C和I，Isl1；D、F和H，WT1；E和G，Tbx18。比例尺，100μm。OFT, 流出道；AS, 動脈囊; PC, 心包腔；AT, 心房；AVC, 房室管；RV, 右心室；LV, 左心室；FG,前腸Fig. 2 Immunohistochemical staining for the expression of α-SMA, MHC, Isl1, WT1and Tbx18 in the transversal sections of mouse embryonic hearts at E10.5. A, α-SMA; B, MHC; C and I, Isl1; D, Fand H, WT1; E and G, Tbx18. Scale bar, 100μm. OFT, outflow tract; AS, aortic sac; PC, pericardial cavity; AT, atrium; AVC, atrioventricular canal; RV, right ventricle; LV, left ventricle; FG, foregut

3 E11小鼠胚胎OFT的發(fā)育與心外膜的分布變化

E11小鼠胚胎，動脈囊進入心包腔，其壁為MHC陰性，因此形成OFT的非心肌部（圖3A、B）。其遠端及其與之相延續(xù)的心包腔背側(cè)壁呈Isl1免疫反應(yīng)陽性（圖3C箭頭），相鄰切片免疫組化染色顯示OFT非心肌部遠端同時表達α-SMA（圖3A箭頭）、但不表達MHC（圖3B箭頭），說明Isl1免疫反應(yīng)陽性的SHF細胞不再向心肌細胞分化。WT1的表達開始出現(xiàn)在Isl1陽性的心包腔背側(cè)壁以及與之相連的OFT遠端壁的表面（圖3D細箭頭）。在與右心室相連的OFT心肌部外表面，WT1免疫反應(yīng)陽性的cEP清晰可見，但與OFT非心肌部遠端的WT1陽性細胞帶即aEP之間缺乏連續(xù)性（圖3D箭頭），進一步提示OFT心肌部與非心肌部的心外膜有不同來源。Tbx18在OFT非心肌部以及相連的心包腔背側(cè)壁表達呈免疫反應(yīng)弱陽性（圖3E細箭頭）。心包腔背側(cè)壁與OFT非心肌部的WT1陽性細胞呈單層立方狀（圖3F、G箭頭），而OFT心肌部的心外膜為單層扁平上皮（圖3F、H箭頭）。向靜脈端移行，與心房相鄰的Isl1陽性的心包腔背側(cè)壁（圖3I箭頭），WT1表達仍為陰性（圖3J箭頭），即僅心臟動脈端相鄰的心包腔背側(cè)壁上皮開始表達WT1。

圖3 胚齡11d心橫切面α-SMA、MHC、Isl1、WT1和 Tbx18表達的免疫組織化學(xué)檢測和組織學(xué)特征分析。A, α-SMA；B, MHC；C和I，Isl1；D和J，WT1；E，Tbx18；F，組織學(xué)特征的HE染色觀察；G和H，分別為F中的F1和F2的局部放大。比例尺，100μm。PC，心包腔；non-myo OFT，OFT非心肌部；FG，前腸；RA，右心房；LA，左心房Fig. 3 Immunohistochemical staining for the expression of α-SMA, MHC, Isl1, WT1 and Tbx18 in the transversal sections of mouse embryonic hearts at E11 and their histological characteristic analysis. A, α-SMA; B, MHC; C and I, Isl1; D and J, WT1; E, Tbx18; F, analysis by HE staining for histological characteristics; G and H, magnification of F1 and F2 in F, respectively. Scale bar, 100μm. PC, pericardial cavity; non-myo OFT, non-myocardial part of the OFT; FG, foregut; RA, right atrium; LA, left atrium

4 E11.5小鼠胚胎OFT的分隔與EPDCs形成

E11.5小鼠胚胎，主肺動脈隔將OFT非心肌部分隔為心包內(nèi)升主動脈和肺動脈干（圖4A）。Isl1免疫反應(yīng)染色顯示此期SHF由Isl1陽性的氣管腹側(cè)錐形區(qū)（圖4B星號）和心包腔背側(cè)壁臟壁中胚層構(gòu)成，前者體積較大，其尖端Isl1陽性細胞延伸至主動脈和肺動脈干管壁，因此兩動脈壁內(nèi)可見大量Isl1陽性SHF細胞（圖4B、C）。α-SMA表達則局限于動脈壁近內(nèi)皮處（圖4A箭頭）。提示此期較多SHF前體細胞已進入動脈壁，但尚未大量分化為α-SMA陽性SMCs。心包腔背側(cè)壁仍表達Isl1、WT1、Tbx18（圖4B-E箭頭），且與主動脈壁外表面的aEP相延續(xù)（圖4C、D、E），說明SHF前體細胞繼續(xù)向心外膜細胞分化,而aEP與OFT心肌部的心外膜仍未彼此相連（圖4D, E細箭頭）。

圖4 胚齡11.5d心橫切面α-SMA、Isl1、WT1和Tbx18表達的免疫組織化學(xué)檢測。A，α-SMA；B,和C，Isl1；D，WT1；E，Tbx18；C，B中方框的局部放大。比例尺，100μm。PC，心包腔；APS，主肺動脈隔；AO，升主動脈；PT，肺動脈干；T，氣管Fig. 4 Immunohistochemical staining for the expression of α-SMA, Isl1, WT1 and Tbx18 in the transversal sections of mouse embryonic hearts at E11.5.A, α-SMA; B and C, Isl1; D, WT1; E , Tbx18; C, the enlargement of the box in B. Scale bar, 100μm. PC, pericardial cavity; APS, aorta pulmonary septum; AO, ascending aorta; PT, pulmonary trunk; T, trachea

5 E12.5小鼠胚胎心包內(nèi)主、肺動脈的發(fā)育以及EPDCs的分布變化

E12.5小鼠胚胎，升主動脈和肺動脈干完全分隔，兩動脈壁內(nèi)仍分布有豐富的Isl1免疫反應(yīng)陽性的SHF細胞（圖5A）。免疫熒光雙染結(jié)果顯示，部分Isl1免疫反應(yīng)陽性細胞同時表達α-SMA（圖5B箭頭），即α-SMA在動脈壁的表達不再局限于近內(nèi)皮處，而是向外層擴展，提示SHF前體細胞向SMCs分化。動脈壁外表面的WT1免疫反應(yīng)陽性細胞未進入中膜（圖5C）。在心外膜下間隙、致密心肌可見較多WT1陽性EPDCs分布（圖5D箭頭）。

圖5 胚齡12.5d心橫切面Isl1、α-SMA和WT1表達的免疫組織化學(xué)檢測。A，Isl1；B，Isl1和α-SMA免疫熒光雙標(biāo)，綠色示α-SMA，紅色示Isl1；C和D，WT1。比例尺，100μm。AO，升主動脈；PT，肺動脈干Fig. 5 Immunohistochemical staining for the expression of Isl1, α-SMA and WT1 in the transversal sections of mouse embryonic hearts at E12.5. A,Isl1; B, double immunofluorescence staining of Isl1 (red) and α-SMA (green); C and D, WT1. Scale bar, 100μm. AO, ascending aorta; PT, pulmonary trunk

6 E14—E16小鼠胚胎心包內(nèi)主、肺動脈的發(fā)育以及EPDCs分布變化

E14—E16小鼠胚胎，心包內(nèi)主、肺動脈的aEP以及與之延續(xù)的心包腔背側(cè)壁上皮由立方形變?yōu)楸馄綘?，仍表達WT1（圖6A、B箭頭），但失去了Isl1的表達（圖6C箭頭）。主、肺動脈壁中膜的Isl1陽性細胞逐漸減少至消失（圖6C、D星號），α-SMA表達擴展至管壁中膜全層（圖6E）。免疫熒光染色顯示，動脈壁中膜內(nèi)也可觀察到WT1免疫反應(yīng)陽性細胞的散在分布，同時表達α-SMA（圖6E）。提示aEP也可產(chǎn)生WT1陽性EPDCs并進入動脈中膜向SMCs分化。此期兩動脈的瓣膜已形成，瓣膜內(nèi)分布有豐富的Sox9免疫反應(yīng)陽性間質(zhì)細胞（圖6F），免疫組織化學(xué)染色與免疫熒光雙染均顯示，瓣膜內(nèi)分布有散在的WT1陽性心外膜細胞（圖6G、H箭頭）。

圖6 胚齡14—16d心橫切面WT1、α-SMA、Isl1和Sox-9表達的免疫組織化學(xué)檢測。A、B和G，WT1，B為A中方框的局部放大; C和D，Isl1; E和H，α-SMA （綠色）和WT1（紅色）免疫熒光雙標(biāo)；F，Sox-9免疫組織化學(xué)染色。比例尺，100μm。 PC，心包腔；AO，升主動脈；PT，肺動脈干；PV，肺動脈瓣膜Fig. 6 Immunohistochemical staining for the expression of WT1, α-SMA, Isl1 and Sox-9 in the transversal sections of mouse embryonic hearts at E14 to E16. A and G, WT1; B, enlargement of the box in A; C and D, Isl1; E and H, double immunofluorescence staining of α-SMA (green) and Isl1(red);F, Sox-9. Scale bar, 100μm. PC, pericardial cavity; AO, ascending aorta; PT, pulmonary trunk; PV, pulmonary valve

7 E13小鼠胚胎心包內(nèi)主、肺動脈原代EpiCs體外培養(yǎng)并向SMCs分化

按照文獻[10,11]所介紹方法，選取E13小鼠胚胎心包內(nèi)主、肺動脈組織進行原代EpiCs培養(yǎng)。動脈組織種植24h后，可見部分EpiCs從組織邊緣爬出，以鵝卵石樣向外生長，顯微鏡下觀察呈典型的上皮樣細胞形態(tài)（圖7A）。培養(yǎng)48h后，對EpiCs進行免疫熒光染色可見其高表達EpiCs標(biāo)志物 WT1（圖7B）與Tbx18（圖7C）。對EpiCs純度進行檢測，使用ImageJ細胞計數(shù)，證實EpiCs純度為97.78±0.50%。數(shù)據(jù)表明，EpiCs可以成功地進行高純度的培養(yǎng)。部分EpiCs在添加PDGF-BB的培養(yǎng)基中培養(yǎng)72h后，出現(xiàn)較多形態(tài)不規(guī)則的SMCs；對照組未進行PDGF-BB干預(yù)的EpiCs，培養(yǎng)6d后出現(xiàn)少量的SMCs。免疫熒光雙染檢測顯示添加PDGFBB組的細胞α-SMA呈強陽性表達(圖7D—G)，說明PDGF-BB可以誘導(dǎo)EpiCs向SMCs分化。而未進行PDGF-BB干預(yù)的對照組，α-SMA少量表達(圖7H—K)，說明在無PDGF-BB誘導(dǎo)情況下EpiCs也可以向SMCs進行緩慢分化，與對照組相比，PDGFBB對EpiCs向SMCs分化起促進作用。

圖7 胚齡13d心包內(nèi)主動脈和肺動脈原代EpiCs中WT1、Tbx18和α-SMA表達的免疫熒光檢測。A，EpiCs從組織邊緣爬出；B，WT1（紅色），藍色示DAPI染色的的細胞核；C，Tbx18（紅色），藍色示DAPI染色的的細胞核; D、E、H和I，WT1（紅色）和α-SMA（綠色）免疫熒光雙標(biāo)，藍色示DAPI染色的細胞核；F、G、J和K，Tbx18（紅色）和α-SMA（綠色）免疫熒光雙標(biāo)，藍色示DAPI染色的細胞核；E、G、I和K，分別為D、F、H和J中方框的局部放大。比例尺：A—C，50μm; D—K，100μmFig.7 Immunofluorescence detection for the expression of WT1, Tbx18 and α-SMA in primary EpiCs of the intrapericardial aorta and pulmonary artery in mouse embryos at E13. A, EpiCs climbing out from the tissue edge; B, WT1 (red) and nuclei (blue, stained with DAPI); C, WT1(green) and nuclei(blue, stained with DAPI); D, E, H and I, double immunofluorescence staining of WT1 (red), α-SMA (green), and nuclei (blue, stained with DAPI); F,G, J and K, double immunofluorescence staining of Tbx18 (red), α-SMA (green), and nuclei (blue, stained with DAPI); E, G, I and K, enlargements of the boxes in D, F, H and J. Scale bar: 50μm in A to C; 100μm in D to K

討 論

1 小鼠胚胎心包內(nèi)主動脈和肺動脈心外膜來自動脈端心包腔背側(cè)壁臟壁中胚層

目前為止，小鼠胚胎心包內(nèi)aEP起源是否與雞胚一致尚未見報道。本研究結(jié)果顯示，E9.5—E10.5小鼠胚胎靜脈端的PE富含WT1和Tbx18陽性細胞；在PE相鄰的房室管心肌表面，觀察到心外膜細胞，說明心外膜開始形成，并逐漸擴展至心房和心室。但在心臟動脈端的OFT尚無心外膜覆蓋。至E11，OFT的非心肌部和心肌部形成，后者表面開始有來自PE的心外膜覆蓋。值得注意的是，OFT非心肌部遠端開始出現(xiàn)WT1和Tbx18陽性的心外膜，為單層立方上皮，與OFT心肌部的單層扁平的心外膜形態(tài)不同。兩種心外膜之間有明顯的中斷，說明來自于靜脈端PE的OFT心肌部的心外膜并未擴展至非心肌部，后者的心外膜有不同的來源。由于OFT非心肌部一端與心肌部相連，另一端與心包腔背側(cè)壁相延續(xù)，既然OFT非心肌部的心外膜并非來源于心肌部心外膜的擴展，我們推測前者可能來自心包腔背側(cè)壁，因此本實驗觀察了OFT非心肌部心外膜的形成過程以及心包腔背側(cè)壁的相關(guān)蛋白表達模式，結(jié)果顯示在E9.5—E10.5，心包腔背側(cè)壁表達SHF標(biāo)記物Isl1，但不表達心外膜標(biāo)記物WT1和Tbx18，所含SHF前體細胞正在向心肌細胞分化；至E11，動脈囊進入心包腔，成為OFT的非心肌部，因此心包腔背側(cè)壁不再向心肌細胞分化，該部位雖仍表達Isl1，但同時開始表達心外膜的標(biāo)記物WT1、Tbx18，這些WT1、Tbx18陽性細胞延伸至OFT非心肌部的表面。由此說明OFT非心肌部心外膜開始形成，它與心包腔背側(cè)壁相延續(xù)，后者同時表達心外膜的特異性標(biāo)記物WT1與SHF標(biāo)記物Isl1，由此推測OFT非心肌部心外膜有不同于PE的起源，來自于SHF。此與雞胚的研究結(jié)果一致[4]，但雞胚的aPE位于動脈囊基部，形態(tài)與靜脈端的PE相似，有多個突起[4]。本實驗的結(jié)果則顯示小鼠胚胎aPE來自于動脈端心包腔背側(cè)壁臟壁中胚層，是SHF的構(gòu)成部分，即aPE屬于SHF，心包腔背側(cè)壁SHF前體細胞具有上皮特性，呈單層或假復(fù)層立方形，在細胞基底面的絲狀偽足參與下增生、向OFT非心肌部延伸[12]。小鼠E16，在動脈端心外膜形成后，aPE的細胞與主、肺動脈的心外膜細胞均變?yōu)閱螌颖馄綘睢?/p>

2 心包內(nèi)主動脈和肺動脈壁的心外膜來源細胞參與動脈壁及瓣膜發(fā)育

覆蓋在心包內(nèi)主動脈和肺動脈表面的aEP是否可產(chǎn)生EPDCs，是否參與動脈壁及瓣膜發(fā)育有待證實。本實驗觀察到在胚胎心包內(nèi)主動脈和肺動脈形成后，二者管壁中膜于E12.5開始出現(xiàn)WT1免疫反應(yīng)陽性細胞，至E14明顯增多，這些細胞同時表達α-SMA，由此推測aEP來源的EPDCs進入動脈中膜，向SMCs分化。分離心包內(nèi)主、肺動脈管壁體外培養(yǎng)進一步驗證了此結(jié)論，aEP可以經(jīng)上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化為EPDCs，進入動脈中膜，分化為α-SMA陽性SMCs細胞，參與動脈壁的發(fā)育。主動脈與肺動脈分隔后，瓣膜隨之形成，二者的3個瓣膜內(nèi)可見WT1陽性細胞的散在分布?，F(xiàn)有研究證實主動脈和肺動脈的左、右兩瓣膜內(nèi)的間充質(zhì)細胞為神經(jīng)嵴與內(nèi)皮來源[14]，主動脈后瓣和肺動脈前瓣來自SHF[15]。本實驗結(jié)果提示aEP的EPDCs可能也參與瓣膜的發(fā)育。與房室管的EPDCs僅參與壁側(cè)瓣的發(fā)育不同，動脈的EPDCs見于任一瓣膜內(nèi)。

綜上，本實驗為探究小鼠胚胎心包內(nèi)動脈心外膜來自于SHF提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)；動脈心外膜的WT1陽性細胞分布變化以及蛋白表達模式的改變，提示動脈心外膜所含細胞參與了主、肺動脈管壁以及瓣膜的發(fā)育。這些結(jié)果對探討心外膜相關(guān)畸形的發(fā)生機制具有重要意義。