替米考星含量測定方法的改進研究

王 軒，楊秀玉，韓寧寧，戴 青，汪 霞，趙 暉

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

替米考星(C46H80N2O13)是一種動物專用的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，主要用于治療胸膜肺炎放線桿菌、巴氏桿菌及支原體感染等，比泰樂菌素具有更強的抗菌活性[1-2]。替米考星在獸醫(yī)臨床治療中已得到非常廣泛的應(yīng)用，且擁有多種劑型?！吨腥A人民共和國獸藥典》2015年版一部[3]共收載替米考星原料及替米考星注射液、替米考星預混劑和替米考星溶液三種制劑類型，其含量測定方法均為高效液相色譜法，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以水-乙腈-磷酸二丁胺溶液-四氫呋喃(805∶115∶25∶55)為流動相，按外標法以替米考星順式異構(gòu)體和反式異構(gòu)體峰面積的和計算含量。但在實際使用過程中發(fā)現(xiàn)該色譜條件下替米考星的順-8-差向異構(gòu)體峰位于其順式異構(gòu)體峰和反式異構(gòu)體峰之間，但現(xiàn)行《中國獸藥典》標準中只對替米考星順式異構(gòu)體峰和反式異構(gòu)體峰的分離度進行控制，故順-8-差向異構(gòu)體峰易對替米考星含量測定結(jié)果造成干擾[3]。同時，在該流動相體系中含有四氫呋喃，易對以塑料管為輸液介質(zhì)的液相色譜儀造成損害，大大縮短儀器的使用壽命，增加試驗成本。已發(fā)表的文獻中，替米考星及其制劑的含量測定方法以高效液相色譜法為主[4-6]，色譜條件與《中國獸藥典》標準大多一致。因此，建立一種便捷、高效的替米考星的含量測定方法是非常必要的。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑 Waters 2695高效液相色譜儀配有二極管陣列檢測器(PDA2998)和色譜工作站處理軟件Empower 3(美國Waters公司)、AX205型分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)。三氟乙酸、乙腈為色譜純，水為超純水。

1.2 試藥 替米考星對照品，批號K0311805，含量95.3%，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；替米考星溶液，某市售產(chǎn)品，規(guī)格25%；替米考星預混劑，某市售產(chǎn)品，規(guī)格10%；替米考星注射液，某市售產(chǎn)品，規(guī)格10 mL∶3 g。

2 溶液的制備

2.1 對照品溶液 取替米考星對照品約25 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加入2 mL乙腈，用35%乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 供試品溶液 替米考星預混劑：取供試品約2.5 g(相當于替米考星0.25 g)，精密稱定，置50 mL量瓶中，加入2 mL乙腈，用35%乙腈溶液溶解并稀釋至刻度，超聲10 min，搖勻，精密量取上述溶液5 mL置50 mL量瓶中，用35%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，即得；替米考星注射液：精密量取供試品2 mL，用35%乙腈溶液稀釋至刻度，超聲10 min，搖勻，精密量取上述溶液5 mL置50 mL量瓶中，用35%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，即得；替米考星溶液：精密量取供試品2 mL，用35%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述溶液5 mL置50 mL量瓶中，用35%乙腈溶液稀釋至刻度，超聲10 min，搖勻，即得。

2.3 色譜條件 色譜柱：Gemini C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：10%三氟乙酸-乙腈(65∶35)；流速1.0 mL/min；檢測波長：280 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

3 方法學驗證

3.1 專屬性和系統(tǒng)適用性試驗 分別取空白溶液、對照品溶液和供試品溶液，按2.3項色譜條件進樣，記錄色譜圖。結(jié)果表明，樣品中雜質(zhì)對替米考星的測定無干擾。替米考星的順式和反式異構(gòu)體峰的分離度為1.92，理論塔板數(shù)按順式計為14051，按反式計為6208，替米考星反式異構(gòu)體峰、順式異構(gòu)體峰和順-8-差向異構(gòu)體的相對保留時間為0.9、1.0和1.2。對照品溶液和供試品溶液色譜圖見圖1。

圖1 替米考星對照品(A)、替米考星預混劑(B)、替米考星注射液(C)和替米考星溶液(D)的色譜圖Fig 1 Chromatograms of tilmicosin reference (A), tilmicosin premix (B), tilmicosin injection (C), and tilmicosin solution (D)

3.2 線性關(guān)系考察 取替米考星對照品約100 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。精密量取對照品儲備液適量，用35%乙腈稀釋制成2.0、1.0、0.5、0.4、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01 mg/mL的系列對照品溶液。照2.3項色譜條件進樣，記錄色譜圖，以對照品濃度C為橫坐標，以替米考星順式峰和反式峰的峰面積和A為縱坐標，繪制標準曲線。回歸方程及相關(guān)系數(shù)為：A=12 106 885C+61423，R2=0.9998。結(jié)果表明，替米考星在0.01～2.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

3.3 檢測限和定量限 取對照品溶液適量，用35%乙腈逐級稀釋，照2.3項色譜條件進行測定。以信噪比S/N為3和10求得替米考星檢測限為0.8 μg/mL，定量限為2.7 μg/mL。

3.4 準確度 以回收率試驗考察方法的準確度。取替米考星對照品適量，精密稱定，加入2 mL乙腈，用35%乙腈制成每1 ml中約含替米考星10 mg的溶液，作為對照品儲備液。精密量取對照品儲備液1 mL，置200 mL量瓶中，用35%乙腈溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。取替米考星預混劑供試品約0.25 g(相當于替米考星25 mg)、替米考星溶液0.1 mL，分別置于50 mL量瓶中，分別精密量取對照品儲備液1.00、1.25、1.50 mL，加入同一量瓶中，照2.2項下方法配制，每個濃度平行制備3份，得到預混劑回收率溶液和溶液回收率溶液；取替米考星注射液0.1 mL，置50 mL量瓶中，分別精密量取對照品儲備液1.20、1.50、1.80 mL，加入同一量瓶中，照2.2項下方法配制，每個濃度平行制備3份，得到注射液回收率溶液。將對照品溶液、預混劑回收率溶液、注射液回收率溶液和溶液回收率溶液照2.3項色譜條件進樣，記錄色譜圖，計算回收率?；厥章试囼灲Y(jié)果見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果Tab 1 Recoveries of tilmicosin in premix, injection, and solution

3.5 精密度 精密吸取同一對照品溶液，照2.3項色譜條件連續(xù)進樣5次，記錄替米考星反式峰和順式峰的峰面積和為6869759、6838430、6867163、6839803、6825560，RSD為0.3%，反式峰保留時間為15.935、15.834、15.753、15.694、15.638 min，RSD為0.7%，順式峰保留時間為17.184、17.080、16.983、16.921、16.855 min，RSD為0.8%。結(jié)果表明進樣精密度良好。

3.6 重復性試驗 分別取不同制劑的同一批供試品，照2.2項下方法制備供試品溶液6份，照2.3項色譜條件進行測定。替米考星預混劑的平均含量為95.8%，RSD為0.8%；替米考星注射液的平均含量為103.9%，RSD為0.2%；替米考星溶液的平均含量為102.6%，RSD為0.8%。結(jié)果表明本方法重復性良好。

3.7 穩(wěn)定性試驗 取同一份對照品溶液和替米考星預混劑供試液，室溫放置，分別在0、6、12、16、20、36和48 h照2.3項色譜條件進樣，記錄色譜峰面積，48 h內(nèi)替米考星對照品和替米考星預混劑的順式峰和反式峰面積和的RSD分別為0.43%和0.58%。結(jié)果表明制備好的對照品溶液和供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.8 耐用性試驗 從柱溫、流動相組成、色譜柱三方面考察替米考星檢測方法的耐用性。調(diào)節(jié)柱溫為25 ℃、30 ℃和35 ℃，結(jié)果表明，隨著柱溫升高，替米考星峰的保留時間逐漸前移，替米考星順式峰和反式峰的分離度均符合要求；調(diào)節(jié)流動相組成為10%三氟乙酸-乙腈(60-40)、10%三氟乙酸-乙腈(65-35)、和10%三氟乙酸-乙腈(70-30)，結(jié)果顯示，在不同流動相組成下，替米考星順式峰和反式峰的分離度均符合要求；選擇3款不同品牌色譜柱(Dikma Diamonsil C18，4.6 mm×250 mm，5 μm； Alltima C18，4.6 mm×250 mm，5 μm； Gemini C18，4.6 mm×250 mm，5 μm)，考察不同色譜柱對測定的影響，三款色譜柱結(jié)果顯示，除保留時間有差異外，替米考星順式峰和反式峰的分離度均符合要求。

4 樣品的測定

取替米考星預混劑、替米考星注射液和替米考星溶液各一批，按2.2項下方法處理，按2.3項下色譜條件進行測定，每個樣品平行制備兩份，取平均值計算樣品中替米考星含量。同時，使用《中華人民共和國獸藥典》2015年版一部收載的含量測定方法對三批樣品進行測定，并與本方法結(jié)果進行比較，見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果(n=2)Tab 2 The results of the sample content (n=2)

5 討論與結(jié)論

5.1 色譜條件的選擇 現(xiàn)行標準中，替米考星及其制劑含量測定方法的流動相均采用乙腈-磷酸二丁胺溶液-四氫呋喃體系[7-9]，已發(fā)表的文獻中也僅有一篇提出在流動相中可加入三氟乙酸以改善分離[10]。本實驗中配制了不同濃度的三氟乙酸溶液(1%、5%、10%和20%)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當三氟乙酸濃度較低時，替米考星順式峰和反式峰間的分離度小于1.5，當使用10%三氟乙酸-乙腈(65∶35)為流動相時，替米考星順式峰和反式峰可實現(xiàn)基線分離。

5.2 提取溶劑的選擇 本方法比較了使用乙腈、甲醇、35%乙腈溶液作為提取溶劑對替米考星的影響，結(jié)果顯示使用35%乙腈溶液效果最佳，在替米考星預混劑提取過程中先加入2 mL乙腈助溶以增加提取效率；分別比較了超聲2、5、10 min對提取效率的影響，結(jié)果顯示超聲10 min能夠提取完全。

5.3 注意事項 本方法對針對替米考星及其制劑含量測定方法進行研究，將原方法中流動相組成由水-乙腈-磷酸丁二胺-四氫呋喃體系轉(zhuǎn)變?yōu)?0%三氟乙酸-乙腈體系。三氟乙酸具有揮發(fā)性和一定的腐蝕性，在流動相配制過程中應(yīng)在通風櫥內(nèi)進行，做好自身防護措施，可對試驗人員進行有效防護。在實驗結(jié)束后，應(yīng)注意對色譜流路及色譜柱進行沖洗，可先用10倍柱體積低濃度的甲醇/乙腈-水溶液(約10%)進行沖洗，再用較高濃度的甲醇/乙腈-水溶液(約50%)進行沖洗，最后用高濃度的甲醇/乙腈-水溶液(80%以上)進行沖洗，使得色譜柱中強吸附物質(zhì)沖洗出來，同時可將系統(tǒng)中的三氟乙酸完全沖洗干凈，減少其對儀器設(shè)備的損耗。

5.4 結(jié)論 本方法建立了一種用于替米考星及其制劑含量測定的高效液相色譜檢測方法。與現(xiàn)行《中國獸藥典》2015年版一部標準相比，該方法操作簡便，并能夠有效將順-8-差向異構(gòu)體進行分離，提高了替米考星及其制劑質(zhì)量控制的檢測效率和準確度，為其質(zhì)量標準的改進提升提供了方法學依據(jù)。