黃馬通淋口服液質量標準研究

楊芬芳，呂繼偉，趙樂凱，郝智慧

(中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院中獸醫(yī)藥創(chuàng)新中心，北京 100094)

犬泌尿道炎，中醫(yī)稱為“淋證”，是犬臨床上常見和多發(fā)的疾病之一，在普通內科病中的發(fā)病率僅次于消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)疾病。此病四季均可發(fā)病，且在各種年齡、性別、品種中均有發(fā)現，年齡偏大的犬發(fā)病率較高[1]。淋證根據主癥不同，常分為熱淋、血淋、砂淋和膏淋等。證候不同，治法也會有差異，熱淋治則為清熱、利濕、通淋，血淋治則為清熱、涼血、止血[2-3]。黃馬通淋口服液的處方來源于中藥成方制劑腎炎片[4]，是由一枝黃花、車前草、馬鞭草、白茅根等六味藥物配伍制成，本品具有清熱解毒，利水通淋之功效[5-6]，主要用來治療犬淋癥。本方中一枝黃花清熱解毒，疏散風熱為主藥；馬鞭草清熱解毒，活血通經，利水消腫[7-9]；白茅根清熱利尿，涼血養(yǎng)陰[10-11]；車前草清熱利濕，通淋排石[12]，葫蘆殼利水消腫為輔藥，協(xié)助主藥一枝黃花清濕熱，利水腫[13-14]；白前利氣疏導，促進濕熱排出為佐藥[15]。配伍所得的黃馬通淋口服液，具有清熱解毒，利濕通淋的藥效。因此，黃馬通淋口服液在臨床上對熱淋和血淋有更明顯的效果。

本制劑由腎炎片更改劑型而來，腎炎片質量標準非常簡單，僅有一項黃酮類的顏色鑒別，無法區(qū)分單味藥材，也沒有有效成分的定量控制[4,16]，目前未見黃馬通淋口服液完善的定性和定量控制方法。為了更加全面評價新制劑的質量，保證其療效，本研究對黃馬通淋口服液進行了一枝黃花的定性鑒別，對車前草中有效成分毛蕊花糖苷進行了定量測定，增加了該制劑可以定性定量質量控制標準。

1 材 料

1.1 試藥 供試品黃馬通淋口服液(批號20170701、20170702、20170703；20170801、20170802、20170803、20170804；20170901、20170903、20170905)由中國農業(yè)大學提供，由山東信得科技股份有限公司生產。毛蕊花糖苷，批號：111530-201713；一枝黃花對照藥材，批號：121433-201304，由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.2 儀器 Agilent 1260色譜儀，DAD檢測器；BT125D電子天平：賽多利斯；AL204分析天平：METTLER TOLEDO；DS-673分析天平：上海寺岡電子有限公司；KQ-5200DA超聲儀：昆山市超聲儀器有限公司；ZF-90型暗箱式紫外透射儀：上海顧村電光儀器廠。

1.3 試劑 G薄層預制板：青島海洋化工廠；苯、乙酸乙酯、甲醇、甲酸：萊陽市康德化工有限公司(AR)；乙醇、磷酸：煙臺三和化學試劑有限公司(AR)；乙腈：TEDIA公司(GR)；水為純化水；其余所有試劑均為AR。

2 方法與結果

2.1 性狀 參照《中華人民共和國獸藥典》2015年版二部“制劑通則”附錄0110合劑部分及相關指導原則中制劑性狀的研究規(guī)定，對10批本品進行外觀形態(tài)、色澤特征目視觀察，氣味鼻聞口嘗方法考察。10批本品結果見表1。根據十批本品的性狀觀察，不同批次產品的顏色會有差異，故綜合工藝條件、放大效應、實際生產等因素，本品的性狀為：棕色至棕褐色液體，氣微，微苦。

表1 性狀觀察結果表Tab 1 Observation results of ten batches of samples

2.2 鑒別

2.2.1 顏色鑒別 取本品10 mL，蒸干，加水2 mL，研成糊狀，加苯15 mL，研磨15 min分液取苯層，待揮干后，加入1 mL乙醇溶解，再加入鹽酸3 mL，鎂粉少許，即顯橙黃色(圖1)。

1：20170701批樣品；2：20170702批樣品；3：20170703批樣品圖1 黃馬通淋口服液顏色鑒別圖Fig 1 Color identification of HuangmaTonglin Oral liquid

2.2.2 一枝黃花的薄層定性鑒別 取本品5 mL，置于15 mL甲醇中，搖勻，濾過，濾液蒸干，溶解在15 mL水中，用15 mL乙酸乙酯分別提取2次，將乙酸乙酯液收集、合并、蒸干，所得物以2 mL甲醇溶解，即得。另取一枝黃花對照藥材2.5 g，加入50 mL的水，煎煮2 h，濾過，將濾液濃縮至5 mL，從加入甲醇15 mL，同法制備。照薄層色譜法(附錄0502)試驗，以乙酸乙酯-甲酸-水(8∶0.5∶0.5)為展開劑，吸取上述兩種溶液各3 μL，分別在含4%磷酸氫二鈉的硅膠G薄層板上點樣，展開，取出，晾干，將薄層板置365 nm的紫外光燈下檢視。供試品溶液與相對應的對照藥材溶液相同位置顯相同的斑點，陰性樣品溶液對主斑點不干擾(圖2)。

1：一枝黃花對照藥材；2：20170701批樣品；3：20170702批樣品；4：20170703批樣品；5：陰性樣品圖2 黃馬通淋口服液TLC圖Fig 2 TLC of Huangma Tonglin Oral liquid

2.3 檢查

2.3.1 pH值 照《中華人民共和國獸藥典》2015版二部(附錄0631)pH值測定法，檢測生產的10批黃馬通淋口服液的pH值，見表2。十批樣品檢測結果顯示，pH值在4.7～5.2，考慮到工藝條件、放大效應、實際生產等因素，暫定本品的pH值范圍為4.0～5.5。

表2 pH值測定結果表Tab 2 Results of pH measurement

2.3.2 相對密度 取本品，照《中華人民共和國獸藥典》2015年版二部附錄0601相對密度測定法項下的第1法比重瓶法項下的方法試驗。10批黃馬通淋口服液的相對密度結果見表3。檢測結果顯示，十批樣品的相對密度為1.05～1.11，考慮到規(guī)模化生產可能帶來的不確定因素等問題，暫定本品的相對密度不低于1.02。

表3 相對密度結果表Tab 3 Relative density results table

2.4 含量測定

2.4.1 色譜條件 選用Agilent Zobax Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，以乙腈-0.2%磷酸水溶液(20∶80)為流動相，檢測波長為330 nm，流速為每分鐘1.0 mL；柱溫為30 ℃，進樣量為10 μL。

2.4.2 溶液的制備

2.4.2.1 對照品溶液的制備 用甲醇溶解適量的毛蕊花糖苷，制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得。

2.4.2.2 供試品溶液的制備 取本品，搖勻，精密量取5 mL，置于25 mL的量瓶中，加入10 mL甲醇搖勻，再加甲醇至刻度，用力搖勻，濾過，除去初濾液，取續(xù)濾液，即得。

2.4.2.3 缺失車前草陰性對照品溶液配制 按黃馬通淋口服液處方比例及制備工藝制備缺車前草藥材的口服液，搖勻后量取5 mL，置于25 mL的量瓶中，加入10 mL甲醇搖勻，再加甲醇至刻度，用力搖勻，濾過，除去初濾液，取續(xù)濾液，即得。

2.4.3 專屬性考察 對照品溶液、供試品溶液(批號20170701)和陰性樣品溶液分別吸取各10 μL，進行檢測。結果顯示，毛蕊花糖苷峰與相鄰峰可以達到較好的分離，分離度>1.5，陰性樣品溶液在毛蕊花糖苷峰相應的位置上無干擾(圖3)。

2.4.4 標準曲線制備 取毛蕊花糖苷對照品11.2 mg(含量以92.5%計)，將其置于50 mL容量瓶中，加60%甲醇搖勻使溶解，再加少量60%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得標準品儲備液。分別取適量儲備液，用60%甲醇稀釋成10.36、25.90、51.80、77.70、103.60、207.20 μg/mL的一系列濃度的對照品溶液，分別進樣10 μL，于高效液相色譜儀進行測定，記錄色譜圖，測定各個濃度的峰面積。結果以濃度為橫坐標(X，μg/mL)，峰面積值為縱坐標，進行回歸計算，得標準曲線方程Y=13.108X+23.992(R2=0.9992)。如圖4所示，毛蕊花糖苷在10.36～207.20 μg/mL之間存在著良好的線性關系。

2.4.5 精密度試驗 精密吸取20170701批供試品溶液10 (L，按2.2.1項下的色譜條件，重復檢測6次，6次結果的RSD=0.61%，表明以該方法、該儀器測定毛蕊花糖苷時精密度良好。

2.4.6 重復性試驗 取20170701批的樣品，按2.2.2項下方法平行配制6份供試品溶液，按2.2.1項下的色譜條件，進行檢測，6份樣品的RSD=0.24%，表明該方法的重復性良好。

A．對照品；B．供試品；C．陰性樣品A. Reference substance; B. The product; C. The negative samples圖3 黃馬通淋口服液HPLC圖Fig 3 HPLC of Huangma Tonglin Oral liquid

圖4 毛蕊花糖苷標準曲線Fig 4 Standard curve of Verbascoside

2.4.7 穩(wěn)定性試驗 配制20170701批號的供試品溶液，于0，2，4，6，8，12 h，分別精密吸取10 (L，按2.2.1項下的色譜條件，檢測分析，幾次結果間的RSD=0.80%，表明該樣品溶液放置12 h相對穩(wěn)定。

2.4.8 加樣回收率試驗 取本品(批號20170701，毛蕊花糖苷含量0.26 mg/ mL)2.5 mL，精密量取9份，分別置25 mL量瓶中，3份一組，共三組，備用，添加毛蕊花糖苷對照品，再按2.2.2項下配液，分別制成80%、100%、120%三個濃度水平的加樣供試品溶液。精密吸取10 μL，按2.2.1項下色譜條件，檢測分析，進行回收率的計算，見表4。

表4 加樣回收率試驗結果表Tab 4 Recovery test results of sample addition

2.4.9 樣品測定 對10批黃馬通淋口服液，進行測定，計算黃馬通淋口服液中毛蕊花糖苷的含量，見表5。

表5 毛蕊花糖苷含量結果表Tab 5 Determination of Verbascosidecontent in the samples

3 討論與結論

3.1 薄層色譜鑒別指標的選擇 方中一枝黃花清熱解毒，疏散風熱為君藥?！吨腥A人民共和國獸藥典》2015年版二部一枝黃花藥材項下對一枝黃花藥材的薄層色譜鑒別有成熟的方法，因此，首先選擇對一枝黃花進行薄層色譜鑒別的研究。但是在研究的過程中發(fā)現，采用獸藥典中規(guī)定的乙酸乙酷―甲醇―甲酸‐水(8∶1∶1∶1)為展開劑，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，斑點不清晰，故需要進一步優(yōu)化薄層色譜條件。

3.2 薄層色譜條件的優(yōu)化 通過調整展開劑、薄層板、展開溫度、點樣量、預飽和時間等[17]能使薄層色譜達到較好地展開效果。結合參考文獻[18,19]方法，更改展開劑比例進行考察，試驗表明，以乙酸乙酯-甲酸-水(8∶0.5∶0.5)為展開劑，供試品斑點清晰，陰性樣品無干擾，分離度好。此鑒別方法操作簡單，色譜特征斑點清晰，重現性良好，專屬性強，可用來定性鑒別黃馬通淋口服液中的一枝黃花。

3.3 含量測定指標的選擇 該處方中一枝黃花、馬鞭草、車前草3個藥味在《中華人民共和國獸藥典》2015年版二部的相應標準中均有的含量測定方法。前期也對3味藥材分別進行了含量測定研究。但是在現有臨床有效的水提工藝下，君藥一枝黃花中蘆丁的提取率較低，可能與蘆丁的水溶性有關；對君藥中的綠原酸也進行了研究，但是綠原酸易分解[20]；馬鞭草在處方中用量相對較小，且其指標成分齊墩果酸和熊果酸水溶于水[21]；對車前草中毛蕊花糖苷和大車前苷進行研究，發(fā)現大車前苷提取率偏低，最終選擇以毛蕊花糖苷作為含量測定指標。

3.4 含量測定條件的優(yōu)化 液相色譜條件優(yōu)化包括提取溶劑、流動相、柱溫、流速等[22]。本研究考察了乙腈-0.1%甲酸溶液(17∶83)、乙腈-0.2%磷酸(20∶80)兩種流動相，結果以乙腈-0.2%磷酸(20∶80)為流動相，保留時間適宜，分離度好，因此選擇以乙腈-0.2%磷酸(20∶80)為流動相；二極管陣列檢測器進行波長掃描，毛蕊花糖苷在330 nm附近有較大光譜吸收，選擇以330 nm為檢測波長。研究中比較了不同色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18、InertSustain C18、Phenomenex Gemini C18；不同流速0.9 ml/min、1.0 ml/min、1.1 ml/min；不同柱溫25 ℃、30 ℃、35 ℃等條件，樣品中毛蕊花糖苷與其他峰均能達到基線分離。最終選定的色譜條件下，分離度高、峰型好，陰性無干擾，指標成分進樣濃度與峰面積之間存在著良好的線性關系，準確度高，重現性好；對處方中毛蕊花糖苷的含量測定適用。

4 結 論

腎炎片做為臨床用中藥，療效確切，中獸藥通過“多成分、多作用、多靶點”在我國獸醫(yī)醫(yī)療系統(tǒng)中發(fā)揮了重要作用[23]，因此，本研究在腎炎片質量標準的基礎上，加強對以腎炎片為處方來源的黃馬通淋口服液，進行了全面的質量評價?？陀^地進行了性狀、pH值、相對密度、黃酮類顏色鑒別、一枝黃花薄層鑒別、毛蕊花糖苷含量測定的研究和規(guī)定，完善了鑒別項、增加了含量測定項，建立了較全面的質量標準，為控制黃馬通淋口服液質量標準提供了較全面的依據。建立的一枝黃花的薄層鑒別方法方法操作簡單、重現性良好、專屬性強；建立的車前草藥材中毛蕊花糖苷含量測定方法，方法簡單、重現性好、準確度高，同時可用來控制黃馬通淋口服液的質量，也為提高腎炎片的質量標準提供依據。