高效液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測清肺止咳散中添加阿奇霉素含量

章安源，張傳津，王洪濤，張 琦，陳志強，李有志，魏秀麗，牛華星，楊修鎮(zhèn)，薄永恒，劉霄飛，魏茂蓮，田學磊，陳 玲 *

(1.山東省獸藥質量檢驗所，山東省畜產(chǎn)品質量安全監(jiān)測與風險評估重點實驗室，濟南 250022；2.濰坊海關，山東濰坊 261041；3.青島信諾邦生物科技有限公司，山東青島 266000，)

大環(huán)內酯類抗生素阿奇霉素抗菌譜廣，臨床上廣泛用于治療敏感菌所致呼吸道、皮膚和軟組織感染[1-3]。有些養(yǎng)殖戶在化痰清肺、平喘止咳等中獸藥散劑中違規(guī)添加阿奇霉素, 目的是控制畜禽咳喘病的治療，我國農(nóng)業(yè)部在2005年8月曾發(fā)布了第560號令,取消了阿奇霉素作為獸藥使用。非法添加人用抗生素，不僅易產(chǎn)生細菌耐藥性問題,而且增加動物源性食品中阿奇霉素的殘留風險。當前國內外尚無中獸藥散劑中阿奇霉素的檢測方法標準，僅有含量測定相關的液相色譜方法，專屬性不強，且中藥組分的干擾較大，本實驗擬建立高效液相色譜-串聯(lián)質譜方法檢測中獸藥散劑中違規(guī)添加的阿奇霉素含量，為中獸藥單方或復方制劑中非法添加阿奇霉素含量的定性、定量檢測提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器 AE-240電子天平(瑞士Mettlrer Toledo 公司)； Agilent 1260-6460高效相色譜四極桿電離噴霧串聯(lián)質譜儀(美國安捷倫公司)； KQ-250DB超聲儀(昆山市超聲儀有限公司),5810R高速冷凍離心機(日本日立公司)，0.22 μm的濾膜為美國Waters 公司。

1.2 藥品及試劑 阿奇霉素(來源：CAS公司，編號：83905-01-5，純度≥97%)。甲酸、乙腈(色譜純，德國Merk公司，)；超純水。高純氮，高純氬(純度均為99.99%，濟南德陽氣體有限公司。

1.3 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱，100 mm×3.0 mm，粒徑2.7 μm，或性能相當者；流動相A：乙腈；流動相B：水溶液(0.1%甲酸)；流速：0.3 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：40 ℃。高效液相色譜梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Program of gradient elution

1.4 質譜條件 電離方式：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描(ESI+)；檢測方式：多反應監(jiān)測(MRM)；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流量：9.0 L/min；鞘氣溫度：250 ℃；鞘氣流速：11.0 L/min；碰撞氣：40 psi；毛細管電壓：4 kV；測試藥物定性、定量離子和碰撞能量見表2。

表2 質譜測定參數(shù)Tab 2 Mass Spectrometric Determination of Parameter

1.5 樣品制備

1.5.1 陰性樣品 清肺止咳散，來源：山東某獸藥企業(yè)；批號20201101。

1.5.2 標準儲備液的制備 精密稱取阿奇霉素標準品10.31 mg(準確至0.01 mg)，置10 mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻, 即得1000 μg /mL標準儲備液。-20 ℃冰箱保存，貯存期3個月。

1.5.3 樣品溶液的制備 準確稱取1.5.1項下樣品0.2 g(精確到0.001 g)于250 mL三角燒瓶中，加入50 mL 40%乙腈溶液超聲提取15 min，轉移至100 mL容量瓶中，加初始流動相(1.3)稀釋至刻度。用濾紙過濾，收集續(xù)濾液。準確吸取續(xù)濾液1.0 mL，至10 mL容量瓶中，用初始流動相(1.3)稀釋至刻度，搖勻，濾膜過濾，過濾液待測。同時按上述步驟做樣品空白試驗。

1.5.4 空白基質溶液的制備 稱取0.2 g 樣品50 份，按照1.5.3項下方法處理后即得空白基質溶液。

1.5.5 基質匹配標準儲備溶液的制備 精密量取標準儲備液1 mL，置100 mL容量瓶中，加空白基質溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得10 μg /mL的基質匹配標準儲備溶液。

1.5.6 陽性添加樣品的制備 準確稱取阿奇霉素5、10、20、50 mg加入到陰性空白散劑樣品100 g中，混勻，即每1 kg分別添加阿奇霉素50、100、200、500 mg，每個添加量制備3份平行樣，按待測樣品制備方法(1.5.3項)制備陽性添加樣品，在上述液相色譜條件(1.3項)和質譜條件(1.4項)進行測定，每份樣品至少進樣2次，取平均值。

1.5.7 基質標準曲線的制備 準確吸取5.0 mL基質匹配標準儲備溶液(10 μg/mL)，至100 mL容量瓶中，用空白基質溶液稀釋至刻度，搖勻，得500 ng/mL的基質標準溶液。分別吸取500 ng/mL的基質標準溶液適量，用空白基質溶液倍比稀釋，得5、10、25、50、100、125、250 ng/mL的標準物質系列工作液。

2 結果與分析

2.1 線性考察 在選定的色譜條件下，使用梯度洗脫的方法，可有效地分離各離子。5、10、25、50、100、125、250 ng/mL的基質匹配標準溶液，經(jīng)高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定后，以標準溶液中阿奇霉素定量離子峰面積為縱坐標，標準溶液中相應的阿奇霉素濃度為橫坐標，繪制基質標準曲線。阿奇霉素在5～250 ng/mL范圍內標準曲線線性回歸方程為Y=1309.94X+119.96，其決定系數(shù)R2為0.9993，線性關系良好。

2.2 精密度試驗 精密吸取基質匹配標準溶液50 ng/mL(10 μL)，連續(xù)進樣6次。以峰面積計算，得出阿奇霉素峰面積的RSD(相對標準偏差)為1.8%。表明儀器精密度良好，符合檢測要求。

2.3 穩(wěn)定性試驗

2.3.1 標準溶液穩(wěn)定性 配制阿奇霉素標準儲備液將其分裝為3瓶，分別將其儲存在冷凍、冷藏和室溫條件下，每周稀釋上機，考察穩(wěn)定性。實驗數(shù)據(jù)表明，-20 ℃和4 ℃儲存的標準儲備液3個月內無明顯差異，25 ℃存儲條件下略有差異。結果見表3。

表3 標準儲備液穩(wěn)定性考察Tab 3 Stability of standard stock solution

2.3.2 基質添加阿奇霉素穩(wěn)定性 清肺止咳散中添加阿奇霉素(50 mg/kg)后，分別將其儲存在冷凍、冷藏和室溫條件下，稀釋至10 ng/mL上機，并且每周將不同儲存狀態(tài)下的標準儲備液和中間液進行稀釋上機，即用第0天的數(shù)據(jù)為標曲單點對每周的數(shù)據(jù)進行校正。實驗數(shù)據(jù)表明，在冷凍(-20 ℃)條件下儲存的標準90 d內，無降解。而在室溫條件下儲存的阿奇霉素儲備液從第2個月開始出現(xiàn)降解；阿奇霉素中間液從第1個月就開始出現(xiàn)降解，第2個月時已經(jīng)出現(xiàn)明顯降解。結合實驗數(shù)據(jù)和GB/T 27404-2008推薦的有效期，阿奇霉素儲備液和中間液的有效期最終定為3個月。結果見圖1。

圖1 清肺止咳散添加阿奇霉素溶液穩(wěn)定性Fig 1 Stability of Qingfeizhike powder added azithromycin solution

2.4 回收率試驗 50、100、200、500 mg/kg四個添加濃度下，平均回收率在89.1%～98.6%(表4)。批內相對標準偏差<1.6%，批間相對標準偏差為4.1%。

表4 回收率和精密度試驗結果(n=3)Tab 4 Result of recovery and precision for azitromycin

2.5 檢出限和定量限 空白基質按確定的步驟處理后，測定結果表明：在相應的保留時間，空白基質對所測分析物無干擾。在空白樣品中添加阿奇霉素標準品，按確定的提取方法處理后，經(jīng)高效液相色譜-串聯(lián)質譜儀檢測，計算信噪比。添加濃度為25 mg/kg時，標準溶液信噪比(S/N))≥3，確定為方法的檢出限。添加濃度為50 mg/kg時，標準溶液顯示信噪比(S/N))≥10，作為此方法定量限。檢測限和定量限滿足檢測要求。

2.6 質譜圖 空白樣品、對照溶液及陽性添加樣品的高效液相色譜-串聯(lián)質譜圖見圖2～圖4。

圖2 空白樣品特征離子質量色譜圖Fig 2 Extraction ion chromatograms of the blank sample

圖3 對照溶液提取離子色譜圖Fig 3 Extraction ion chromatograms of the contrast solution

圖4 陽性添加樣品特征離子質量色譜圖Fig 4 Extraction ion chromatograms of the positive added sample

3 討論與結論

3.1 前處理方法的選擇與優(yōu)化 為確保散劑中添加阿奇霉素有效成分全部溶解，分別用甲醇、乙腈、水、20%乙腈水、40%乙腈水、60%乙腈水、80%乙腈水、乙腈：0.1%甲酸水(40∶60)、乙腈：0.2%甲酸水(40∶60)、乙腈：0.5%甲酸水(40∶60)對不同批號的樣品稀釋并超聲提取。結果發(fā)現(xiàn)甲醇、水提取時，提取得到供試品雜質成分多，回收率不高；用乙腈提取后的提取液較為清澈，基質干擾小。因為阿奇霉素在中性水溶液中相對較穩(wěn)定，因此，決定調節(jié)乙腈和水的比例，實驗結果發(fā)現(xiàn)，40%乙腈水提取后的供試品溶液基質干擾最小。阿奇霉素屬于弱堿性化合物，易溶于酸性水溶液[4]，為進一步確定甲酸水的用量，研究比較甲酸0.1%、0.2%、0.5%用量時，結果表明甲酸用量為0.1%時，超聲提取15 min，且基質效益無明顯差別，雜質干擾少，峰形對稱，阿奇霉素回收率較高。故選擇初始流動相處理樣品?；|匹配標準溶液采用空白基質溶液定容，空白基質溶液在與阿奇霉素對照品相同保留時間處，均無色譜峰出現(xiàn)，證明在很大程度上基質效應小，實驗準確度高。

3.2 液相色譜條件的選擇與優(yōu)化 本實驗分別考察甲醇-0.1%甲酸水溶液和乙腈-0.1%甲酸水溶液分離情況，摒棄了乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液(12∶88)作為流動相，降低了色譜柱因磷酸鹽易堵的風險[5-8]。不斷調整流動相比例：甲醇和乙腈由30%下降到10%，最終選擇了乙腈-0.1%甲酸水(1∶9，體積比)為初始流動相，不僅能使阿奇霉素很好的分離，其特征離子質量色譜圖的峰形和分離度好，降低了檢測成本，有機試劑使用量較少，有利環(huán)保。

3.3 質譜條件的選擇與優(yōu)化件的選擇與優(yōu)化 采用1.0 μg/mL的阿奇霉素標準溶液在不接色譜柱的條件下，分別用電噴霧電離正離子模式(ESI+)和負離子模式(ESI-)進行母離子全掃描。結果發(fā)現(xiàn)，阿奇霉素正離子模式的[M+H]+為m/z749.3，負離子模式下的[M-H]-為m/z747.3，[M+H]+信號遠遠高于[M-H]-。在正離子模式(ESI+)下對阿奇霉素進行二級質譜全掃描，得到m/z591.1、m/z158.3、m/z116.1、m/z83.1四個相對信號較高的子離子。利用安捷倫Optimizer軟件對阿奇霉素的子離子碎裂電壓、碰撞能量等參數(shù)進行進一步的優(yōu)化，獲得最佳的儀器條件。結合樣品基質的質譜圖最終選取離子豐度最高、本底干擾最小的m/z749.3>591.1作為定量離子，m/z749.3>158.3作為定性離子。

本實驗建立了中獸藥散劑中非法添加阿奇霉素含量的高效液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測方法。實驗過程簡單、快速，回收率較高，各項性能指標均達到了行業(yè)標準要求，同時基質干擾小，檢測結果準確可靠，檢出限低，靈敏度高，適用于清肺止咳散中非法添加阿奇霉素的定性、定量檢測，為治理整頓中獸藥中添加違禁藥物，提供了檢測參考和技術支撐。