高效液相色譜-二極管陣列法同時測定醬腌菜中5 種甜味劑

田 毅 劉 暢 盛 靜 楊怡樂

（重慶市黔江食品藥品檢驗所，重慶黔江 409000）

醬腌菜是我國廣大消費者比較喜愛的食品之一，為保持蔬菜的營養(yǎng)價值，增強蔬菜口感，延長保質(zhì)期，常在生產(chǎn)過程中添加各種食品添加劑，包括防腐劑和甜味劑。甜味劑按其來源可分為人工合成甜味劑和天然甜味劑。人工合成甜味劑由于在人體內(nèi)不進(jìn)行代謝吸收，不提供熱量且甜度高，越來越受到人們的重視。糖精鈉、安賽蜜、紐甜、阿斯巴甜、阿力甜、三氯蔗糖等均為人工合成甜味劑。甜味劑被廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)，但添加過量具有一定毒副作用，食用后會危害人體健康，因此在GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中對糖精鈉、安賽蜜、阿斯巴甜、紐甜等甜味劑在醬腌菜中的使用限量和適用范圍都做了明確的規(guī)定。

目前，國標(biāo)方法最多可同時檢測醬腌菜中2 種人工合成甜味劑，且樣品前處理方法、凈化步驟、流動相條件、檢測器類型等均有區(qū)別。文獻(xiàn)報道的甜味劑同時檢測方法主要有高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法；吳曉紅，李小華等的研究中僅對糖精鈉和安賽蜜進(jìn)行檢測，該方法無法實現(xiàn)醬腌菜中多種甜味劑的同時檢測，而在實際風(fēng)險監(jiān)測工作中有時需要同時檢測多種甜味劑。如果分別對幾種甜味劑進(jìn)行檢測，不僅費時費力，而且檢測效率也低。因此，在此基礎(chǔ)上，本文建立了一種采用高效液相色譜-二極管陣列同時檢測醬腌菜中多種甜味劑的測定方法，經(jīng)驗證該方法高效快捷、準(zhǔn)確可靠、操作性強，能較好的適用于日常檢測工作。

1 材料和方法

1.1 試劑、儀器

甲醇、乙腈，均為色譜純；甲酸、乙酸鋅、亞鐵氰化鉀，均為分析純；安賽蜜、糖精鈉、阿斯巴甜、阿力甜、紐甜對照品，含量均≥97%；超純水。

Agilent 1260 高效液相色譜儀，配DAD 檢測器；TG16-WS 臺式高速離心機；IKA MS3 digital 渦旋儀；電子天平；ELGA 超純水系統(tǒng)。

1.2 色譜條件

流動相：A 為0.02 mol/L 乙酸銨溶液；B 為乙腈，采用梯度洗脫，梯度洗脫程度見表1。

表1 流動相及流速

色譜柱：島津C18柱（4.6 mm×250 mm；5 μm）；柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μL，流速：1.0 mL/min，檢測波長：210 nm。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液制備

準(zhǔn)確稱取適量糖精鈉、安賽蜜、阿斯巴甜、阿力甜、紐甜標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于10 mL 量瓶中，用超純水溶解并定容至刻度，搖勻，即得混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

1.3.2 混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液制備

將配制好的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液配制成質(zhì)量濃度為50 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液；用超純水逐級稀釋成質(zhì)量濃度為1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液，待用。

1.4 供試品溶液制備

1.4.1 提取

稱取1.0 g 混合均勻試樣于50 mL 離心管中，加入10 mL 0.15%甲酸水溶液超聲提取15 min，加入亞鐵氰化鉀和乙酸鋅各2 mL，渦旋振搖2 min，5 000 r/min 離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中，再提取一次，合并上清液，定容，搖勻靜置，上清液過孔徑0.45 μm 微孔濾膜，上機測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

采用二極管陣列檢測器在190 nm～400 nm 范圍內(nèi)對5 種甜味劑進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果顯示5 種甜味劑的最大吸收波長分別為：紐甜218 nm，阿斯巴甜200 nm，阿力甜200 nm，糖精鈉230 nm，安賽蜜230 nm。綜合5 種甜味劑的最大吸收波長，分別選取205 nm、210 nm、220 nm、230 nm 波長進(jìn)行測定。結(jié)果表明，在210 nm 時，5 種甜味劑峰響應(yīng)值高，基線平穩(wěn)度好。因此，本試驗選擇210 nm 作為5 種甜味劑的檢測波長。5 種甜味劑混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖如圖1 所示。

圖1 210 nm 處5 種甜味劑的混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

2.2 前處理的對比選擇

本試驗對比了2 種前處理方式：一種是試樣經(jīng)提取溶液提取，蛋白沉淀，離心后過濾膜直接上機；另一種是樣品經(jīng)提取溶液提取，蛋白沉淀，離心，靜置后取適量供試品溶液過固相萃取柱（C18，HLB），溶劑復(fù)溶后過濾膜上機。結(jié)果表明，試樣過HLB 固相萃取柱后基線平穩(wěn)，雜峰較少，但安賽蜜低水平加標(biāo)時回收率低于70%；而經(jīng)C18固相萃取柱后，糖精鈉、安賽蜜回收率均未達(dá)到60%，過凈化柱的前處理方式回收率不能取得較好效果；而樣品直接提取后上機的處理方式，取得較好效果，通過加標(biāo)回收驗證，5 種甜味劑均能達(dá)到85%以上，樣品基質(zhì)干擾少，重現(xiàn)性較好。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

本試驗考察了甲醇-水、甲醇-乙酸銨、乙腈-乙酸銨等體系對5 種甜味劑的分離效果影響，結(jié)果表明，采用甲醇-水體系作為流動相時，隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)從5%上升至75%，5 種甜味劑出現(xiàn)峰拖尾嚴(yán)重，峰形變寬現(xiàn)象；在甲醇-乙酸銨體系中，由于甲醇的洗脫能力較弱，當(dāng)甲醇含量較低時，阿斯巴甜和紐甜出峰時間較晚，影響檢測時間，不利于快速檢測。通過對比優(yōu)化，最終選擇乙腈-乙酸銨體系作為流動相，進(jìn)行梯度洗脫，設(shè)定流速1 mL/min，柱溫30 ℃時，可以使5種甜味劑之間得到較好分離，且不會受到樣品基質(zhì)干擾。

2.4 方法回收率和精密度

分別將5 種甜味劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液以低中高3 個濃度水平（5 μg/g、10 μg/g、20 μg/g）添加到醬腌菜試樣中，進(jìn)行3 個水平加標(biāo)回收試驗，重復(fù)測定6次，同1.4 樣品處理后上機測定，結(jié)果見表2。

由表2 可知，樣品的平均加標(biāo)回收率在88.5%～103.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于3.5%，表明該方法精密度和重現(xiàn)性均能滿足分析要求。

表2 5 種甜味劑的平均加標(biāo)回收率試驗及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

將1.3.2 中配制好的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液按照要求上機測定。以保留時間和光譜進(jìn)行定性，峰面積進(jìn)行外標(biāo)法定量，5 種甜味劑在質(zhì)量濃度1 μg/mL～50 μg/mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，根據(jù)S/N=3 計算檢出限，結(jié)果如表3 所示。由表3 可知，方法檢出限（LOD）為：0.6 mg/kg～4.5 mg/kg，定量限（LOD）為：2.3 mg/kg～14.0 mg/kg。

表3 線性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.6 市場抽樣檢測結(jié)果

采用本方法對100 批市售醬腌菜試樣進(jìn)行檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，11 批醬腌菜中檢測出糖精鈉，其檢出值范圍為9.45 mg/kg～19.7 mg/kg，14 批醬腌菜中檢出安賽蜜，其檢出值范圍為5.36 mg/kg～15.37 mg/kg，4 批醬腌菜中檢出2～3 種甜味劑，這表明醬腌菜中復(fù)合使用甜味劑的情況存在，但其檢出值均在國標(biāo)限定范圍內(nèi)，表明企業(yè)都能按照規(guī)定要求使用甜味劑。

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜-二極管陣列法同時測定醬腌菜中5 種甜味劑含量的方法，與傳統(tǒng)方法相比，該方法前處理簡單，操作快捷，且該方法回收率、檢出限、定量限等均能滿足定量分析要求，可同時測定醬腌菜中5 種甜味劑，可為醬腌菜的質(zhì)量安全監(jiān)管提供技術(shù)支撐。