榆梔止血顆粒治療子宮出血的HIF-1α/miR-210軸機(jī)制研究

支運(yùn)霞，張麗娟，徐善榮，陳逸嘉

(1.中藥制藥共性技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006；2.青島市即墨區(qū)中醫(yī)醫(yī)院婦科，山東 青島 266200；3.上海龍華醫(yī)院婦科，上海 200000)

子宮異常出血是臨床常見的婦科疾病，可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜病變、不孕、子宮肌瘤等，嚴(yán)重危害女性生命健康。子宮出血機(jī)制復(fù)雜，目前研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜血管生成障礙、激素水平異常等可能是導(dǎo)致子宮異常出血的主要原因。研究證實(shí)，機(jī)體可通過激活低氧誘導(dǎo)因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，調(diào)控子宮內(nèi)膜血管生成因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)，發(fā)揮抑制子宮崩解出血和促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)的作用。微小RNA-210(micro RNA-210，miR-210)與HIF-1α關(guān)系密切，且HIF-1α/miR-210軸可調(diào)控血管生成，參與激素調(diào)節(jié)、細(xì)胞增殖及凋亡等多種生理過程。探究HIF-1α/miR-210軸在子宮出血過程中的調(diào)控作用，對(duì)闡明子宮內(nèi)膜出血的病理機(jī)制有一定意義。榆梔止血顆粒原名婦科止血顆粒，具有清熱涼血、調(diào)經(jīng)止血的功效，臨床上常用于治療月經(jīng)過多，文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)其可有效治療早孕大鼠子宮出血癥，但其治療子宮出血的具體機(jī)制還不明確。本研究建立大鼠子宮出血模型，從HIF-1α/miR-210軸探討其治療子宮出血的機(jī)制，以期為臨床合理用藥提供參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)健康SD大鼠60只，體質(zhì)量為200～220 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(粵)2018-0002。所有大鼠于屏障環(huán)境動(dòng)物房中進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)(自然光照，25℃室溫，50%～65%相對(duì)濕度)。本試驗(yàn)經(jīng)過倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[批準(zhǔn)文號(hào)： IACUC-01(20190825)]，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理符合“3R”原則。

1.2 主要試劑及儀器 榆梔止血顆粒(含地榆炭、墨旱蓮、炒梔子、綿馬貫眾、仙鶴草、炒槐花、拳參、大薊、炒側(cè)柏葉、棕櫚炭、牡丹皮、茜草、蒲黃炭、生地黃、白芍、黃芩、當(dāng)歸等，國藥準(zhǔn)字 Z20130019，每袋10 g)：山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司；蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色試劑盒(貨號(hào) LMO105)：上海聯(lián)邁生物工程有限公司；米非司酮(貨號(hào) 10412)：北京凱瑞基生物科技有限公司；米索前列醇片(貨號(hào) RK170327)：深圳市洛克生化科技有限公司；雌二醇(serum estradiol，E)(貨號(hào) YE01847)、孕酮(progesterone，P)(貨號(hào) YE01938)等酶聯(lián)免疫試劑盒：上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；HIF-1α抗體(貨號(hào) ab228649)、VEGF抗體(貨號(hào) ab32152)、基質(zhì)金屬蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1，MMP-1)抗體(貨號(hào) ab134184)：美國abcam公司。光學(xué)顯微鏡(貨號(hào) SMZ745)：日本尼康公司；蛋白電泳儀(貨號(hào) 1659001)：美國Bio-Rad公司；凝膠成像儀(貨號(hào) GIS-500)：杭州米歐儀器有限公司等。

2 方法

2.1 大鼠子宮出血模型復(fù)制及分組給藥 參照文獻(xiàn)[11]的方法建立大鼠妊娠模型，并于妊娠第7天8：00和18：00分別灌服米非司酮(13.8 mg/kg)和米索前列醇(135 μg/kg)復(fù)制子宮出血模型，陰道置入棉球，次日取出棉球觀察，若棉球上有血，表明模型復(fù)制成功。將模型復(fù)制成功的50只大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組，榆梔止血顆粒低劑量(4 g/kg)、中劑量(8 g/kg)、高劑量(16 g/kg)組，陽性對(duì)照(宮血寧0.07 g/kg)組，每組10只，另取正常妊娠大鼠10只，于相同時(shí)間灌胃給予等量生理鹽水，作為正常組。各組大鼠均于模型復(fù)制成功后(妊娠第8天)開始給藥，榆梔止血顆粒低、中、高劑量組及陽性對(duì)照組參照文獻(xiàn)[11-12]設(shè)置劑量，并用生理鹽水稀釋成0.4、0.8、1.6、0.007 g/mL的混懸液，按10 mL/kg的劑量灌胃給藥；正常組和模型組灌胃給予等量生理鹽水，各組連續(xù)給藥7 d，每日1次。

2.2 大鼠陰道出血量測定 參照文獻(xiàn)[11]的方法在給藥期間于陰道內(nèi)置入質(zhì)量為75～80 mg棉球一個(gè)，次日分別于8：00和18：00將棉球取出，置換一個(gè)新棉球，觀察陰道出血情況，收集出血棉球置于燒杯內(nèi)，記錄并加適量50 g/L NaOH浸泡、擠壓、搓洗棉球血漬并過濾，取4 mL濾液，作為試驗(yàn)管。用血紅蛋白吸管吸取大鼠尾靜脈血0.02 mL，加入等濃度NaOH溶液4 mL，混勻，作為空白對(duì)照管。取空白管和對(duì)照管于546 nm波長下記錄吸光度(

A

)值，根據(jù)公式計(jì)算子宮出血量。子宮出血量=0.02×浸提液

A

值×所用NaOH總?cè)莘e/(4×空白管

A

值)。

2.3 大鼠血液指標(biāo)檢測及子宮組織標(biāo)本采集 麻醉大鼠，取頸總動(dòng)脈血6 mL(不加抗凝劑)，以3 000 r/min離心10 min，取上層血小板血漿用半自動(dòng)凝血分析儀按照凝血四項(xiàng)說明書測定凝血酶時(shí)間(thrombin time，TT)、凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT)。另取全血2 mL，靜置30 min后以 3 000 r/min 離心10 min，取上清液按ELISA試劑盒說明書檢測血清E、P含量。處死大鼠，取子宮內(nèi)膜組織，剪取部分置于-80 ℃冰箱保存；剩余組織迅速置于4%多聚甲醛中固定24 h備用。

2.4 HE染色法觀察子宮組織形態(tài)變化 取“2.3”中4%甲醛中固定的組織標(biāo)本，常規(guī)處理切片(厚5 μm)。按HE試劑盒說明書進(jìn)行染色后，于顯微鏡下觀察組織形態(tài)變化。

2.5 qRT-PCR檢測子宮內(nèi)膜組織HIF-1α mRNA、miR-210、VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)水平 取“2.3”中冰凍組織標(biāo)本，4 ℃解凍后，冰上勻漿、離心分離，取上清液，用Trizol試劑盒抽提總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書以總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，并按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟進(jìn)行擴(kuò)增，共進(jìn)行36個(gè)循環(huán)，嚴(yán)格按試劑盒說明建立反應(yīng)體系及參數(shù)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物設(shè)計(jì)見表1。HIF-1α mRNA及VEGF mRNA以β-actin為內(nèi)參基因，miR-210以U6為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔ算法計(jì)算HIF-1α mRNA、miR-210、VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

表1 qRT-PCR引物序列

2.6 Western blot法檢測子宮內(nèi)膜組織中HIF-1α、VEGF、MMP-2蛋白相對(duì)表達(dá)水平 取子宮內(nèi)膜組織勻漿液，蛋白提取試劑盒提取蛋白，BCA法檢測蛋白總濃度，取50 μg蛋白上樣，行電泳和轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，加入一抗[HIF-1α、VEGF、MMP-1(1∶1 000)、β-actin(內(nèi)參，1∶2 000)]抗體，4 ℃搖床孵育過夜，加入HRP羊抗兔二抗(1∶2 000)，37 ℃搖床孵育1 h，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，并以Image J軟件分析各組蛋白相對(duì)表達(dá)情況。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠陰道出血量及血清E、P水平比較 與正常組比較，模型組大鼠陰道出血量增加，血清E、P水平均降低(

P

<0

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05)。與模型組比較，榆梔止血顆粒各劑量組大鼠出血量減少，E、P水平升高(

P

<0

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05)，且呈劑量依賴性；榆梔止血顆粒高劑量組與陽性對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0

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05)。見表2。

表2 各組大鼠陰道出血量及血清E2、P水平比較

3.2 各組大鼠TT、PT、APTT比較 與正常組比較，模型組大鼠TT、PT、APTT增加(

P

<0

.

05)。與模型組比較，榆梔止血顆粒各劑量組大鼠TT、PT、APTT減少(

P

<0

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05)，且呈劑量依賴性；榆梔止血顆粒高劑量組與陽性對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0

.

05)。見表3。

表3 各組大鼠TT、PT、APTT比較

3.3 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)觀察 正常組大鼠子宮組織結(jié)構(gòu)正常，上皮細(xì)胞單層整齊排列在子宮內(nèi)膜基底部，梭形細(xì)胞在固有層下面分散排列，偶見毛細(xì)血管，無炎癥細(xì)胞浸潤；模型組大鼠子宮內(nèi)膜固有層間質(zhì)細(xì)胞增生，細(xì)胞形態(tài)破壞，上皮細(xì)胞排列散亂無序，血管擴(kuò)張、間質(zhì)纖維化及炎癥細(xì)胞浸潤明顯。榆梔止血顆粒低、中劑量組大鼠子宮內(nèi)膜固有層細(xì)胞中度增生，炎癥細(xì)胞浸潤減輕；榆梔止血顆粒高劑量組和陽性對(duì)照組固有層輕度增生，炎癥浸潤進(jìn)一步減輕。見圖1。

3.4 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織HIF-1α mRNA、miR-210、VEGF mRNA表達(dá)水平比較 與正常組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織HIF-1α mRNA、miR-210、VEGF mRNA表達(dá)水平明顯下降(

P

<0

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05)。與模型組比較，榆梔止血顆粒各劑量組大鼠HIF-1α mRNA、miR-210、VEGF mRNA表達(dá)水平明顯上升(

P

<0

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05)，且呈劑量依賴性；榆梔止血顆粒高劑量組與陽性對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0

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05)。見表4。

表4 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織HIF-1α mRNA、miR-210、VEGF mRNA表達(dá)水平比較

3.5 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織HIF-1α、VEGF、MMP-2蛋白表達(dá)水平比較 與正常組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)膜組織HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)水平降低(

P

<0

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05)，MMP-2蛋白表達(dá)水平升高(

P

<0

.

05)。與模型組比較，榆梔止血顆粒各劑量組大鼠HIF-1α、VEGF表達(dá)水平均升高(

P

<0

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05)，MMP-2蛋白表達(dá)水平降低(

P

<0

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05)，且呈劑量依賴性；榆梔止血顆粒高劑量組與陽性對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0

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05)。見圖2、表5。

表5 各組大鼠子宮內(nèi)膜組織HIF-1α、VEGF、MMP-2蛋白表達(dá)水平比較

注：A.正常組；B.模型組；C.榆梔止血顆粒低劑量組；D.榆梔止血顆粒中劑量組；E.榆梔止血顆粒高劑量組；F.陽性對(duì)照組

注：A.正常組；B.模型組；C.榆梔止血顆粒低劑量組；D.榆梔止血顆粒中劑量組；E.榆梔止血顆粒高劑量組；F.陽性對(duì)照組

4 討論

子宮及宮頸炎癥病變、子宮內(nèi)膜增生、全身凝血障礙等均可導(dǎo)致子宮異常出血。藥物治療、刮宮術(shù)及手術(shù)切除術(shù)是針對(duì)出血的治療策略，但這些策略治療效果不顯著，且對(duì)子宮及人體傷害較大。榆梔止血顆粒原名婦科止血顆粒，方中諸藥相互配伍，可入沖任而涼血、調(diào)經(jīng)、止血。尹艷艷等發(fā)現(xiàn)，婦科止血顆?？山档驮缭写笫箨幍莱鲅?，并促進(jìn)子宮內(nèi)膜修復(fù)。本研究建立大鼠子宮出血模型，并采用榆梔止血顆粒進(jìn)行治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，榆梔止血顆粒可緩解大鼠子宮內(nèi)膜固有層間質(zhì)增生及炎癥細(xì)胞浸潤等病理損傷，并能呈劑量依賴性降低大鼠子宮出血量，提高凝血功能，升高激素水平，且高劑量組作用效果與陽性對(duì)照組相似。

VEGF及MMPs是參與血管生成、促進(jìn)子宮內(nèi)膜傷口愈合、終止出血的重要因子。黃琪等發(fā)現(xiàn)黃芩炭可通過升高VEGF和降低MMP-2的表達(dá)水平來促進(jìn)子宮內(nèi)膜血管生成，降低早孕大鼠子宮出血量。另外，VEGF又受HIF-1α調(diào)控，且HIF-1α-VEGF通路是調(diào)控子宮內(nèi)膜崩解出血及修復(fù)的重要通路。Maybin等發(fā)現(xiàn)HIF-1α表達(dá)水平降低，可導(dǎo)致月經(jīng)嚴(yán)重出血患者子宮內(nèi)膜修復(fù)延遲。Chen等發(fā)現(xiàn)HIF-1α mRNA表達(dá)水平增高，能直接調(diào)節(jié)下游VEGF表達(dá)，抑制子宮內(nèi)膜脫落及出血。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠HIF-1α/VEGF軸基因及蛋白表達(dá)水平降低，而榆梔止血顆粒隨劑量升高，HIF-1α/VEGF軸蛋白表達(dá)水平也顯著升高，且高劑量組作用效果與陽性對(duì)照組相似，提示榆梔止血顆粒抑制大鼠子宮出血及損傷的作用機(jī)制可能與激活HIF-1α/VEGF通路有關(guān)。

HIF-1α與miR210有結(jié)合位點(diǎn)。Bakirtzi等發(fā)現(xiàn)HIF-1α表達(dá)水平降低的同時(shí)，也可引起miR210表達(dá)水平的降低，而過表達(dá)HIF-1α可通過提高miR210表達(dá)水平，來促進(jìn)小鼠結(jié)腸組織血管生成。本研究發(fā)現(xiàn)，榆梔止血顆粒隨劑量升高，miR210及HIF-1α表達(dá)水平也顯著升高，且高劑量組作用效果與陽性對(duì)照組相似，推測榆梔止血顆粒減少子宮出血的作用機(jī)制可能與激活HIF-1α/miR210軸有關(guān)。

綜上所述，榆梔止血顆粒可激活HIF-1α/miR210軸，促進(jìn)子宮內(nèi)膜血管生成和修復(fù)，抑制子宮出血，為闡明子宮出血機(jī)制提供了參考。但HIF-1α/miR210通路促進(jìn)血管生成的機(jī)制十分復(fù)雜，且中藥治療疾病具有多靶點(diǎn)、多途徑的作用，榆梔止血顆粒還可能通過其他途徑抑制子宮出血，這有待后續(xù)深入研究。