森林腦炎滅活疫苗（地鼠腎細(xì)胞）細(xì)胞工廠培養(yǎng)工藝的建立

張朔，趙建，鄒墅，張穎，趙東山，劉曉杰，劉玥，翟東穎，孫宏亮

1.長春生物制品研究所有限責(zé)任公司，吉林長春130012；2.吉林省藥品檢驗(yàn)所，吉林長春130033

森林腦炎是由森林腦炎病毒引起的一種以侵襲中樞神經(jīng)系統(tǒng)為主的急性病毒性傳染?。?］，該病目前尚無特異的治療方法，病死率3% ～30%［2-3］。接種疫苗是控制該病流行的最經(jīng)濟(jì)有效的措施［4］。傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝制備森林腦炎滅活疫苗存在難以克服的缺陷，主要包括地鼠用量相對較大，不符合關(guān)于實(shí)驗(yàn)動物使用的減少、替代及循環(huán)使用原則（即3R 原則）；轉(zhuǎn)瓶使用數(shù)量多，具有人工勞動強(qiáng)度大，自動化程度低，效率相對較低，占用空間大，可控制性差，污染風(fēng)險較高等缺點(diǎn)［5］。而細(xì)胞工廠用于大規(guī)模的細(xì)胞培養(yǎng)，可大量減少地鼠用量，具有空間培養(yǎng)面積大因而占地較小等優(yōu)點(diǎn)，可達(dá)到在有限空間內(nèi)提高產(chǎn)能、減少人工操作工作量、降低污染風(fēng)險的目的，同時細(xì)胞工廠表面經(jīng)過特殊處理，可確保細(xì)胞黏附和生長的最佳條件［6-7］。

本研究采用細(xì)胞工廠培養(yǎng)原代地鼠腎細(xì)胞收獲病毒液，經(jīng)超濾濃縮、滅活、純化后制備了森林腦炎滅活疫苗，建立連續(xù)培養(yǎng)多次收獲工藝，以提高疫苗產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF 級金黃地鼠，雌性，體重13 ~16 g，日齡12 ~ 14 d，由長春生物制品研究所有限責(zé)任公司動物室提供，動物合格證號：201600014430。

1.2 病毒 工作種子森林腦炎病毒森“張”株，第10代，由長春生物制品研究所有限責(zé)任公司疫苗三室保存并提供。

1.3 主要試劑及儀器 MEM 培養(yǎng)基（干粉）購自美國Hycolone 公司；199 培養(yǎng)基（干粉）購自美國GIBCO公司；牛血清白蛋白ELISA 檢測試劑盒購自無錫博生醫(yī)用生物技術(shù)開發(fā)有限公司；乳酸檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；葡萄糖檢測試劑盒購自上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；新生牛血清購自太原潤生生物材料有限公司；細(xì)胞工廠購自美國Corning公司，型號 10 ／ 40 層；Sepharose 4FF 凝膠過濾介質(zhì)購自美國GE Healthcare 公司；截留相對分子質(zhì)量300 kD 的超濾膜包購自美國Millipore 公司。

1.4 溶液配制 消化液：將0.5%胰蛋白酶用MEM按照終濃度為0.125%進(jìn)行稀釋，經(jīng)7.5% NaHCO3溶液調(diào) pH 至 7.8 ～ 8.2，同時按終濃度 100 IU ／ mL補(bǔ)加硫酸卡那霉素。細(xì)胞生長液：在含0.2%乳白蛋白水解物、1%谷氨酰胺的MEM 液中，按終濃度6%加入新生牛血清，并用7.5% NaHCO3溶液調(diào)pH 至6.8 ～ 7.2，按終濃度 100 IU ／ mL 補(bǔ)加硫酸卡那霉素。病毒維持液：含1% ~ 2%新生牛血清的199 培養(yǎng)液，用 NaHCO3溶液調(diào) pH 至 7.4 ～ 7.8。

1.5 地鼠用量及接種病毒時間確定 分別取120（3對腎 ／ 層）、140（3.5 對腎 ／ 層）、160（4 對腎 ／ 層）、180（4.5 對腎 ／ 層）及 200 只（5 對腎 ／ 層）地鼠，無菌取腎，于2 ～8 ℃消化18 ～20 h；各組分別接種4個10 層細(xì)胞工廠，生長液200 mL ／層，（37 ± 1）℃靜置培養(yǎng)；分別于接種后24、48、68 及72 h 觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，并按下式計算細(xì)胞覆蓋率，確定最適地鼠數(shù)量及接種病毒時間［8］。每個10 層細(xì)胞工廠為1 批。

1.6 病毒收獲時間及次數(shù)確定

1.6.1 細(xì)胞工廠實(shí)驗(yàn)組（工廠01 ~ 05） 取160 只地鼠為 1 個解剖組，共 5 組，無菌取腎，于 2 ～ 8 ℃消化18 ～20 h；各組均接種1 個40 層細(xì)胞工廠，（37 ± 1）℃靜置培養(yǎng)68 ～72 h；待細(xì)胞長成致密單層后，按 0.5 MOI 感染森林腦炎病毒，（33 ± 1）℃靜置培養(yǎng)96 h；進(jìn)行第1 次收獲，收獲后補(bǔ)加維持液，（33 ± 1）℃靜置培養(yǎng) 48 h；進(jìn)行第 2 次收獲，如此反復(fù)進(jìn)行10 次收獲，至細(xì)胞明顯脫落后停止收獲［9-10］。取樣檢測上清液病毒毒力、葡萄糖含量、乳酸含量。病毒毒力檢測按照《中國藥典》三部（2015 版）各論森林腦炎滅活疫苗2.2.3.2 中方法進(jìn)行；葡萄糖、乳酸含量檢測按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6.2 10 L 轉(zhuǎn)瓶對照組（轉(zhuǎn)瓶01） 取100 只地鼠，無菌取腎，于 2 ～ 8 ℃消化 18 ～ 20 h；接種 5 個 10 L轉(zhuǎn)瓶，加入細(xì)胞生長液 2 L ／ 瓶，（37 ± 0.5）℃培養(yǎng)68 ～72 h；待細(xì)胞長成致密單層后，按0.5 MOI 感染森林腦炎病毒，加入病毒維持液 2 L ／ 瓶，（33 ±1）℃培養(yǎng)96 h；進(jìn)行第1 次收獲，補(bǔ)加病毒維持液2 L ／ 瓶，（33 ± 1）℃培養(yǎng) 48 h［9-10］，進(jìn)行第 2 次收獲，共收獲4 次，至細(xì)胞明顯脫落后停止收獲。取樣，檢測上清液病毒毒力、葡萄糖含量、乳酸含量，方法同1.6.1 項(xiàng)。

1.7 編碼主要保護(hù)性抗原核酸的遺傳穩(wěn)定性檢測 將細(xì)胞工廠實(shí)驗(yàn)組第10 次收獲的病毒液作為毒種重新按照0.5 MOI 感染已經(jīng)長成致密單層的原代地鼠腎細(xì)胞，（33 ± 1）℃恒溫室培養(yǎng)96 h 后收獲上清液，即第11 代，如此反復(fù)傳至第20 代。對第11~20代收獲后的病毒液抽提RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以其為模板，利用3 對引物（見表1，由庫美生物科技有限公司合成）。PCR 擴(kuò)增E 蛋白片段。反應(yīng)條件為：50 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min，94 ℃30 s，60 ℃ 30 s，共 30 個循環(huán)；72 ℃ 1 min；4 ℃保存。將擴(kuò)增后的主要保護(hù)性抗原E 蛋白送庫美生物科技有限公司進(jìn)行測序，分析各代次編碼主要保護(hù)性抗原的核酸變異情況。

表1 PCR 擴(kuò)增用引物Tab.1 Primers for PCR

1.8 原液制備及檢定 分別將3 批40 層細(xì)胞工廠（批號：工廠 01 ~ 03）和1 批 10 L 轉(zhuǎn)瓶（批號：轉(zhuǎn)瓶01）收獲的病毒液用相同方法制備疫苗原液［9，11］：合并檢定合格的同一細(xì)胞批生產(chǎn)的單次病毒收獲液，經(jīng)連續(xù)流離心去細(xì)胞碎片（轉(zhuǎn)速：700 ～1 000×g，流速：1 500 ～ 2 500 mL ／ min），上清液加入終溶度為 500 μg ／ mL 的甲醛 2 ~ 8 ℃滅活 21 d。用截留相對分子質(zhì)量300 kD 膜包超濾濃縮40 ～60 倍后，采用柱色譜法進(jìn)行純化，色譜介質(zhì)為Sepharose 4FF凝膠柱，每次上樣量為柱床體積的5% ～7%，洗脫液為 0.01 mol ／ L PBS，線性流速為 20 ～ 30 cm ／ h，檢測波長為280 nm。收集第1 峰的洗脫液即為純化后的病毒液，經(jīng)除菌過濾后，即為疫苗原液。按照《中國藥典》三部（2015 版）進(jìn)行抗原含量、蛋白質(zhì)含量、地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留量、牛血清白蛋白殘余量檢測?？乖坎坏陀? ∶232，蛋白質(zhì)含量不高于80 μg ／ mL，地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留量不高于12 μg ／ mL，牛血清蛋白殘留量不高于 50 ng ／ mL。

2 結(jié) 果

2.1 最適地鼠用量及接種病毒時間 結(jié)果表明，接種相同對地鼠腎時，4 批細(xì)胞工廠之間細(xì)胞生長狀態(tài)一致，培養(yǎng)時間越長，細(xì)胞生長越致密。在相同培養(yǎng)時間時，接種地鼠腎對數(shù)與細(xì)胞生長狀況不呈線性相關(guān)。培養(yǎng)24 和48 h 時，細(xì)胞均不能長成致密單層，至72 h 左右時，每個消化批使用140 ~ 200 對地鼠腎（3.5 ～ 5 對腎 ／ 層）時，細(xì)胞均可長成致密單層。見圖1。綜合考慮細(xì)胞生長情況及實(shí)驗(yàn)動物利用率后，確定每個消化批使用140 ~ 180 對地鼠腎（3.5 ～ 4.5 對腎 ／ 層），培養(yǎng)時間為 68 ～ 72 h。

圖1 細(xì)胞工廠不同接種數(shù)量細(xì)胞生長狀態(tài)Fig.1 Growth of cells at various inoculation amounts in cell factory

2.2 病毒收獲時間及次數(shù) 細(xì)胞工廠實(shí)驗(yàn)組收獲10 次后，細(xì)胞出現(xiàn)脫落，停止收獲，第10 次毒力低于《中國藥典》三部（2015 版）標(biāo)準(zhǔn)（即病毒滴度不低于 7.0 lgLD50／ mL），但前 5 次收獲的病毒液葡萄糖及乳酸含量變化較穩(wěn)定；10 L 轉(zhuǎn)瓶對照組收獲4 次后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯脫落，停止收獲。見圖2 和圖3。

圖2 不同培養(yǎng)方式制備的森林腦炎病毒收獲液的病毒滴度Fig.2 Titers of harvested TBE virus cultured by different methods

圖3 不同培養(yǎng)方式制備的森林腦炎病毒收獲液液中葡萄糖（A）及乳酸（B）含量Fig.3 Glucose（A）and lactic acid（B）contents in harvested TBE virus cultured by different methods

測序結(jié)果表明，除第11、12 及13 次收獲液的1 260位出現(xiàn)突變，第15、19 及20 次收獲液的608 位出現(xiàn)突變外，其他各代次收獲液均無突變。其中，編碼主要保護(hù)區(qū)第1 260 位的突變導(dǎo)致堿基由A 突變?yōu)镃，但由于密碼子簡并性，這種改變并未使其編碼的氨基酸發(fā)生改變，均為編碼Leu。編碼主要保護(hù)區(qū)第608位的突變導(dǎo)致堿基由A 突變?yōu)镃，編碼的氨基酸也由終止密碼子突變?yōu)镃ys，但均未改變蛋白的性質(zhì)。

結(jié)合收獲液病毒毒力變化情況、葡萄糖含量變化情況、乳酸含量變化情況、編碼主要保護(hù)性抗原的核酸變異情況，細(xì)胞工廠實(shí)驗(yàn)組可進(jìn)行3 ～5 次病毒收獲。

2.3 原液檢定結(jié)果 原液中抗原含量、蛋白質(zhì)含量、地鼠腎細(xì)胞蛋白質(zhì)殘留量、牛血清白蛋白殘余量均符合《中國藥典》三部（2015 版）規(guī)定，見表2。根據(jù)前期使用地鼠數(shù)量摸索，采用細(xì)胞工廠工藝每批地鼠投產(chǎn)量可減少40%，仍能夠確保病毒收獲液及原液生產(chǎn)體積不變。

表2 兩種工藝制備疫苗原液檢定結(jié)果Tab.2 Control tests on bulks of vaccine prepared by two processes

3 討 論

本文結(jié)合轉(zhuǎn)瓶工藝使用40 層細(xì)胞工廠培養(yǎng)原代地鼠腎細(xì)胞和森林腦炎病毒，確定了細(xì)胞工廠制備森林腦炎滅活疫苗（地鼠腎細(xì)胞）的工藝參數(shù)：細(xì)胞工廠最適細(xì)胞接種量為3 ~ 4 對地鼠腎 ／ 層；感染病毒96 h 后第1 次收獲，之后每48 h 收獲1 次，可連續(xù)收獲3 ~ 5 次。

將森林腦炎病毒液加入終溶度為500 μg ／ mL的甲醛2 ~ 8 ℃滅活21 d，通過截留相對分子質(zhì)量300 kD 的膜包進(jìn)行超濾濃縮后，經(jīng)Sepharose 4FF柱層析純化后得到疫苗原液，其抗原含量、牛血清白蛋白殘留量、地鼠腎細(xì)胞蛋白殘留量均符合《中國藥典》三部（2015 版）要求［11］。

楊睿［12］在《賈第蟲GeRF1 識別終止密碼子性質(zhì)分析》一文中指出，Paramecium、Tetrahymena 和Stylonychia 將通用終止密碼子UAA 和UAG 翻譯為谷氨酸酰胺，將UGA 識別為終止密碼。Euplotes 中UAA 和UAG 作為終止密碼子，而通用終止密碼子UGA 翻譯成半胱氨酸。由此推測第608 位由于堿基突變造成終止密碼子突變成了半胱氨酸密碼子，該突變并未改變蛋白的性質(zhì)，突變前終止密碼子和突變后半胱氨酸密碼子表達(dá)的氨基酸均為半胱氨酸。因此，從遺傳穩(wěn)定性方面，采用細(xì)胞工廠培養(yǎng)方式連續(xù)收獲10 代病毒液對E 蛋白無影響。對多次收獲的病毒液進(jìn)行測序，結(jié)果顯示，連續(xù)多次收獲并未改變森林腦炎病毒包膜蛋白E 的活性，表明森林腦炎病毒傳代后遺傳穩(wěn)定性良好。

利用細(xì)胞工廠培養(yǎng)原代地鼠腎細(xì)胞制備森林腦炎滅活疫苗，條件易于控制，能大量節(jié)約地鼠用量和勞動成本，有效減少污染幾率，獲得較高的細(xì)胞密度并收獲高毒力的病毒液，可替代轉(zhuǎn)瓶大規(guī)模生產(chǎn)森林腦炎滅活疫苗［13-15］。