HDAC1基因沉默和HIF-1α過表達(dá)改善MSCs定向分化及VEGF分泌的功能*

湯穆浛， 盧俊江， 韓敦正

（1廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院急診科，廣東廣州 510220；2廣州市胸科醫(yī)院，廣東廣州 510095；3廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東廣州 510120）

骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有容易獲取、擴(kuò)增的特點(diǎn)，同時(shí)有著較低的免疫原性和免疫調(diào)節(jié)能力，現(xiàn)已用于心肌病和心肌梗死等多種心臟疾病的心肌修復(fù)與再生，是治療心血管疾病的理想種子細(xì)胞［1］。然而，MSCs 在移植體內(nèi)的低分化率與低存活率一直制約著它的臨床應(yīng)用。國內(nèi)外的研究及本課題組前期研究已證實(shí)，組蛋白脫乙酰酶1（histone deacetylase 1，HDAC1）基因的表達(dá)與MSCs向心肌樣細(xì)胞分化關(guān)系密切，將HDAC1基因敲除可以誘導(dǎo)MSCs 向心肌樣細(xì)胞分化［2-4］。但是，HDAC1 蛋白也被報(bào)道參與了低氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）的乙?；揎棧聊琀DAC1基因可引起HIF-1α 降解［5-6］，并影響細(xì)胞旁分泌血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的功能，降低MSCs 移植后的存活率。為解決上述問題，本研究用重組腺病毒HIF-1α三突變體（recombinant adenovirus containing triple-point mutantHIF1-αgene，Ad-HIF-1α-trip）感染的方法使HDAC1沉默的MSCs中HIF-1α 表達(dá)上調(diào)，從而改善MSCs旁分泌VEGF的功能。

HIF-1α是缺血缺氧發(fā)生時(shí)維持細(xì)胞生存非常重要的分子，可激活下游靶基因包括多種促血管生長因子如VEGF、轉(zhuǎn)化生長因子及其受體基因啟動(dòng)子上的缺氧反應(yīng)元件，從而啟動(dòng)血管新生過程，提高對(duì)缺氧環(huán)境的適應(yīng)性，增強(qiáng)酵解過程，為細(xì)胞提供更多的能量［7］。此外，HIF-1α 是組織細(xì)胞在低氧狀態(tài)下激活相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄的核心調(diào)節(jié)因子之一，其最主要的下游基因VEGF［8］是MSCs 參與心梗后修復(fù)過程中最重要的旁分泌因子之一。在缺血缺氧條件下，VEGF的表達(dá)上調(diào)能改善機(jī)體血管形成與側(cè)支微循環(huán)建立，有利于MSCs在移植體內(nèi)的生存及心梗后心功能的恢復(fù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)4～6周齡SD雄性大鼠32只，體重（200±20）g，合格證書編號(hào)SCXK（粵）2008-0002，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。MSCs 由大鼠股骨中分離提取，連續(xù)傳代3代以上。

1.2 干擾載體病毒 攜帶綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因和HDAC1-shRNA 的慢病毒、攜帶GFP基因的慢病毒空載體及腺病毒空載體均購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司。構(gòu)建的Ad-HIF-1α-trip 由南方醫(yī)科大學(xué)心血管內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室提供，突變的3個(gè)位點(diǎn)分別為：將HIF-1α 的氧依賴性降解結(jié)構(gòu)域（oxygen-dependent degradation domain，ODDD）第402 和564 位脯氨酸（Pro）密碼子CCA 和CCC均突變?yōu)楸彼幔ˋla）密碼子GCA；將HIF-1α的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)第803 位天冬酰胺（Asn）密碼子AAT 突變?yōu)楸彼幔ˋla）密碼子GCA。在HEK293A 細(xì)胞中擴(kuò)增、純化得到Ad-HIF-1α-trip［9］。

1.3 試劑與儀器 兔抗大鼠HDAC1 抗體和兔抗大鼠HIF-1α 單克隆抗體（Abcam）；兔抗大鼠VEGF 單克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量SYBR Premix Ex Taq PCR 試劑盒（TaKaRa）。PCR 儀（Bio-Rad）；MX3000P 熒光定量PCR擴(kuò)增儀（Stratgene）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 全骨髓貼壁法提取大鼠骨髓MSCs 并予以HDAC1-shRNA 慢病毒感染（參考前期實(shí)驗(yàn)）［4-5］無菌條件下迅速剝離大鼠股骨與脛骨，清除骨表面附著組織包括肌肉組織，剪刀在骨兩端橫行剪出小口，DMEM 培養(yǎng)液反復(fù)沖洗骨髓并收集骨髓沖洗液，置離心機(jī)560×g離心30 min 后棄上清，再加入DMEM/F12 完全培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種至T-25 cm2塑料培養(yǎng)瓶內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。

2.2 嘌呤霉素篩選獲得HDAC1基因沉默的大鼠MSCs 穩(wěn) 定 細(xì) 胞 株（HDAC1-shRNA-MSCs） 骨 髓MSCs 原代培養(yǎng)初期，約4 h 后出現(xiàn)貼壁細(xì)胞，隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞形態(tài)漸趨均一穩(wěn)定，排列可呈魚群狀或旋渦狀（圖1A）。HDAC1-shRNA 慢病毒感染（MOI=100）24 h 后于熒光顯微鏡下可觀測(cè)到GFP 表達(dá)（圖1B）。再以不同濃度梯度（0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 和4.5 mg/L）的嘌呤霉素進(jìn)行篩選，當(dāng)藥物濃度為0～2 mg/L 時(shí)仍有MSCs存活，而濃度大于2 mg/L 時(shí)MSCs 全部死亡，所以最終選用2 mg/L 嘌呤霉素篩選目的細(xì)胞，構(gòu)建HDAC1-shRNA-MSCs（圖1C）。

2.3 RT-qPCR 檢測(cè)HDAC1-shRNA-MSCs 中HDAC1

的mRNA 表達(dá) 為確定獲得的HDAC1-shRNA-MSCs其HDAC1基因表達(dá)已被沉默，行RT-qPCR 檢測(cè)其mRNA 表達(dá)情況，以正常MSCs 及慢病毒空載體感染后的MSCs作為對(duì)照組。提取細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA 作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再進(jìn)行熒光定量PCR。HDAC1 的 上 游 引 物 序 列 為5′-TCACCGAATCCGAATGACTCATAA-3′，下 游 引 物 序 列 為5′-CTGGGCGAATAGAACGCAAGA-3′；內(nèi) 參 照GADPH 的上游引物序列為5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游引物序列為5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。熒 光 定 量PCR 參 數(shù)：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃3 s，72 ℃30 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min，16 ℃10 min。

2.4 Western blot檢測(cè)HDAC1-shRNA-MSCs中HDAC1蛋白表達(dá) 對(duì)各組收集的細(xì)胞進(jìn)行總蛋白提取，行BCA 法蛋白含量測(cè)定，再取各樣本50 μg 蛋白行SDS-PAGE 分離、切膠、轉(zhuǎn)膜；然后5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h，行相應(yīng)抗體孵育雜交，應(yīng)用ECL 法顯影、X 膠片顯色、暗室曝光后，掃描分析各組蛋白與β-actin的灰度比值，來代表目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

Figure 1. Screening of HDAC1-shRNA-MSCs. A：MSCs at passage 3 showed adherent and spindle-shaped；B：HDAC1-shRNAMSCs were established（GFP indicated the MSCs were transfected by the lentivirus carrying HDAC1-shRNA；C：few of HDAC1-shRNA-MSCs survived when cultured with puromycin at concentration of 2 mg/L. Scale bars=100 μm.圖1 HDAC1-shRNA-MSCs穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選

2.5 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為4 組，主要包括MSCs 對(duì)照組（細(xì)胞不進(jìn)行任何基因修飾）、HDAC1-shRNA組、vector+HDAC1-shRNA 組（將腺病毒空載體轉(zhuǎn)染至HDAC1基因沉默的MSCs 中）和Ad-HIF-1α-trip+HDAC1-shRNA 組（將Ad-HIF-1α-trip 腺病毒轉(zhuǎn)染至HDAC1基因沉默的MSCs使之過表達(dá)HIF-1α）。

2.6 Ad-HIF-1α-trip 腺 病 毒 感 染HDAC1-shRNA

MSCs 取HDAC1-shRNA-MSCs，以每孔3×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中，24 h后吸去培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞，加入1 mL不含血清及雙抗的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)2 h。取出Ad-HIF-1α-trip 病毒液，冰上溶解后轉(zhuǎn)染入HDAC1-shRNA-MSCs 穩(wěn)定細(xì)胞株中（MOI=100），于37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸去含腺病毒的培養(yǎng)液，加入完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

2.7 RT-qPCR 和Western blot 檢 測(cè) 各 組HIF-1α 和VEGF 的 表 達(dá) RT-qPCR 和Western blot 的 方 法 同2.2和2.3，內(nèi)參照亦分別為GADPH和β-actin。HIF-1α 的上游引物序列為5′-TACTGCAGCAACCAGGTGAC-3′，下 游 引 物 序 列 為 5′-ACAGAAACGAAACCCCACAG-3′；VEGF 的上游引物序列為5′-TGTACCTCCACCATGCCAAG-3′，下 游 引 物 序 列 為5′-AACAAATGCTTTCTCCGCTCTG-3′。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。計(jì)量數(shù)據(jù)多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 RT-qPCR檢測(cè)HDAC1-shRNA-MSCs中HDAC1的mRNA表達(dá)量

RT-qPCR 結(jié)果均采用2-ΔΔCt法算出各組模板起始拷貝數(shù)之間的相對(duì)倍數(shù)，從而得出各組間HDAC1 mRNA 表達(dá)情況的差別。RT-qPCR 結(jié)果顯示，HDAC1 mRNA 在各組樣本均有表達(dá)，其在HDAC1-shRNA-MSCs 中的表達(dá)量顯著低于正常對(duì)照和NTshRNA對(duì)照組（P＜0.01），見圖2A。

2 Western blot 檢 測(cè)HDAC1-shRNA-MSCs 中HDAC1蛋白表達(dá)量

Western blot 結(jié)果顯示，HDAC1-shRNA-MSCs 中HDAC1 蛋白表達(dá)量顯著低于正常對(duì)照和空載體對(duì)照組（P＜0.01），見圖2B。

Figure 2. HDAC1 mRNA and protein expression of HDAC1-shRNA-MSCs. RT-qPCR（A）and Western blot（B）results for HDAC1 were shown. Mean±SD. n=6.*P＜0.01 vs NT-shRNA.圖2 HDAC1基因沉默MSCs中HDAC1 mRNA及蛋白表達(dá)的檢測(cè)

3 Ad-HIF-1α-trip 腺病毒感染HDAC1-shRNAMSCs后各組HIF-1α和VEGF的表達(dá)

RT-qPCR 及Western blot 檢 測(cè) 結(jié) 果 顯 示，Ad-HIF-1α-trip 腺 病 毒 感 染HDAC1-shRNA-MSCs 后，HIF-1α 和VEGF 的mRNA 及蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著高于其它3組（P＜0.05），見圖3。

Figure 3. Detection of HIF-1α and VEGF expression. A：RT-qPCR results for HIF-1α and VEGF；B：Western blot results for HIF-1α and VEGF. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs vector+HDAC1-shRNA.圖3 各組MSCs中HIF-1α及VEGF表達(dá)量的檢測(cè)

討 論

干細(xì)胞移植療法仍然是目前治療心臟疾病的研究中最有前景的治療方法，眾多的基礎(chǔ)及臨床研究證明MSCs移植治療急性心肌梗死能夠改善血供，實(shí)現(xiàn)心肌重建，最后達(dá)到改善心臟功能的目的［10］。然而，干細(xì)胞的向心肌細(xì)胞定向分化的能力以及在缺血缺氧環(huán)境中的存活能力有限，大大限制了這種移植治療帶來的獲益。為了解決上述問題，學(xué)者們開始嘗試導(dǎo)入外源基因，提高干細(xì)胞的定向分化能力。其中，我們?cè)谇捌谘芯恐幸炎C實(shí)組蛋白乙?；脚c大鼠MSCs向心肌細(xì)胞分化存在著密切關(guān)系，隨著大鼠MSCs 向心肌樣細(xì)胞分化，其HDAC1基因表達(dá)量逐漸下降，而且HDAC1基因敲除可以促進(jìn)MSCs向心肌樣細(xì)胞分化［3-4］。同時(shí)，也有學(xué)者證實(shí)HDAC1蛋白可以調(diào)節(jié)組蛋白乙?；綇亩绊懼杉?xì)胞系在體外向心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化［2］。然而，HDAC 是通過乙?；?去乙酰化循環(huán)而改變了染色質(zhì)的空間構(gòu)型，使得染色體結(jié)構(gòu)變得致密，起到基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。在此過程中，HDAC1基因沉默不僅激活了心肌特異性基因的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)也使HIF-1α 蛋白乙?；瘡亩黾悠浣到?，HIF-1α 蛋白表達(dá)的下降將影響著MSCs促血管新生的作用。因此，為了解決上述問題，我們用腺病毒轉(zhuǎn)染的方法上調(diào)HIF-1α的表達(dá)。

HIF-1α 是血管新生的上游核心調(diào)控因子，能促進(jìn)VEGF 等重要因子的轉(zhuǎn)錄，引起細(xì)胞對(duì)缺氧的一系列適應(yīng)性反應(yīng)，是血管生成的總開關(guān)基因，其表達(dá)的穩(wěn)定性取決于其結(jié)構(gòu)域中有氧依賴降解區(qū)第402和564 位點(diǎn)上的脯氨酸羧基化程度和C 末端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)中第803 位點(diǎn)上天門冬酰胺的羥化水平［11-12］。而Ad-HIF-1α-trip 通過對(duì)上述三個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行聯(lián)合突變，在保證HIF-1α完整性的基礎(chǔ)上最大程度地提高其穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性。Li 等［9］證實(shí)，將三突變的HIF-1α基因通過腺病毒直接注射至心肌梗死周圍區(qū)域，能顯著增加缺血區(qū)域的新生血管密度，改善心功能。此外，也有研究表明，MSCs 移植后的存活率十分低下，而過表達(dá)HIF-1α可以通過調(diào)節(jié)AMPK 和mTOR 通路，有效提高M(jìn)SCs 的移植后存活能力［13］。綜上所述，通過三突變HIF-1α基因可以顯著提高HIF-1α 表達(dá)量，增加VEGF 表達(dá)，對(duì)改善缺血組織血供發(fā)揮著重要作用。

在本課題組的前期研究中，HDAC1基因沉默已被證實(shí)可以促進(jìn)MSCs向心肌樣細(xì)胞分化；而在本研究中，我們通過嘌呤霉素的篩選獲得了大鼠HDAC1基因沉默的MSCs 穩(wěn)定細(xì)胞株，并更進(jìn)一步通過Ad-HIF-1α-trip腺病毒感染上述細(xì)胞從而獲得HDAC1基因沉默和HIF-1α過表達(dá)的MSCs，實(shí)現(xiàn)了在提高M(jìn)SCs定向分化能力的同時(shí)，也成功上調(diào)了其HIF-1α的表達(dá)，增強(qiáng)了VEGF 的分泌能力，對(duì)MSCs 移植后促進(jìn)局部血管新生、改善心臟血供更有幫助。然而，HDAC1基因沉默和HIF-1α過表達(dá)的MSCs 在體內(nèi)的移植療效仍有待下一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。此外，HDAC1基因沉默和HIF-1α基因過表達(dá)的MSCs 對(duì)血管新生影響有著良好的應(yīng)用前景，其機(jī)制及作用通路仍需深入探討。