蝦青素預(yù)處理通過調(diào)控Sirt1/miR-134信號(hào)通路改善腦缺血再灌注大鼠認(rèn)知功能*

古春青， 張運(yùn)克， 楊廣華， 武繼濤

（河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病科，河南鄭州 450000）

缺血性中風(fēng)是指由于腦血管閉塞引起的腦缺血，具有很高的發(fā)病率、致殘率、致死率和復(fù)發(fā)率，近年來，其發(fā)病呈年輕化趨勢，已成為醫(yī)學(xué)界和社會(huì)關(guān)注的重大問題［1］。缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷在缺血性中風(fēng)的發(fā)生中起重要作用，據(jù)報(bào)道，血管再通后恢復(fù)到缺血區(qū)域的血流會(huì)在一定程度上加重缺血性腦損傷，從而加重病情，這種病理過程被稱為腦缺血再灌注（cerebral ischemia/reperfusion，CI/R）［2］。CI/R 可引起神經(jīng)元損傷，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙，甚至導(dǎo)致“血管性癡呆”，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，增加中風(fēng)的死亡率和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)［3-4。因此，有必要進(jìn)一步探索其潛在的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，并探索新穎的有希望的干預(yù)措施以減輕中風(fēng)引起的認(rèn)知功能障礙。

蝦青素（ataxanthin，ATX）是一種類胡蘿卜素，具有強(qiáng)大的抗氧化劑和抗炎活性。最近，ATX 因其預(yù)防或治療包括阿爾茨海默病和帕金森病在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病的作用而受到關(guān)注［5］。ATX 對(duì)大腦具有很強(qiáng)的保護(hù)作用，其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其可以輕松穿越血腦屏障，可減少I/R 損傷引起的神經(jīng)元缺陷［6］；還可通過抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，減輕阿霉素誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙［7］及血管性癡呆小鼠的認(rèn)知障礙和海馬神經(jīng)元損傷［8］。然而，目前尚無研究報(bào)道ATX能否減輕CI/R所致認(rèn)知功能障礙。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）參與神經(jīng)元的存活、生長和新神經(jīng)元的分化［9］，與神經(jīng)元損傷密切相關(guān)，是治療中風(fēng)的重要靶點(diǎn)［10］；其表達(dá)受環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）的調(diào)控，而且在多種神經(jīng)退行性疾病中CREB/BDNF 信號(hào)通路的活化與認(rèn)知功能的改善緊密相關(guān)［11］。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，Sirt1）是一種NAD+依賴的脫乙酰酶，在大腦中具有多方面的作用，與神經(jīng)可塑性密切相關(guān)，而Sirt1 的缺失可通過miR-134 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后機(jī)制減弱CREB 活性，導(dǎo)致BDNF 的表達(dá)下調(diào)，從而削弱突觸可塑性，損害大腦的認(rèn)知功能［12］。以上研究提示Sirt1/miR-134 信號(hào)通路可能介導(dǎo)CREB/BDNF 信號(hào)通路的活化，從而參與大腦認(rèn)知功能的調(diào)節(jié)，故本研究擬通過建立CI/R大鼠模型，探究ATX 對(duì)CI/R 大鼠認(rèn)知功能的影響及可能的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

從北京維通利華動(dòng)物中心購入7～8 周齡SPF 級(jí)雄性SD 大鼠60 只，體重（300±20）g，許可證為SCXK（京）2019-0009。將大鼠飼養(yǎng)在可控的環(huán)境［溫度（22±2）℃，濕度（55±5）%，12 h明/暗交替］中，所有大鼠可自由飲水和攝食。研究遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》，按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷，并由機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 主要試劑與儀器

ATX（HPLC≥97%）購自Sigma-Aldrich；線栓購自北京西濃科技有限公司；EX527（Sirt1 抑制劑）購自ApexBi；HE 染色試劑、RIPA 裂解液和BCA 試劑盒購自碧云天生物科技公司；TUNEL 原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自武漢博士德公司；Trizol RNA 分離試劑、PrimeScript?RT 試劑盒和SYBR?Premix Ex Taq?II試劑盒購自TaKaRa；兔抗大鼠Sirt1、BDNF、CREB、p-CREB 和β-actin 抗體及山羊抗兔IgG H&L 均購自Abcam；RT-qPCR 引物由GenePharma 公司合成，序列見表1。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置（WMT-100S）購自成都泰盟軟件有限公司；熒光定量PCR 系統(tǒng)（Prism?7300）購自ABI；倒置熒光顯微鏡（IX73）購自O(shè)lympus；蛋白轉(zhuǎn)膜裝置購自Bio-Rad。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. Sequences of the primers for RT-qPCR

3 主要方法

3.1 實(shí)驗(yàn)分組 SD 大鼠60 只隨機(jī)分為假手術(shù)組（sham 組）、模型組（CI/R 組）、ATX 低劑量（50 mg/kg［13］）組（ATX-L 組）、ATX 高 劑 量（100 mg/kg［13］）組（ATX-H 組）和ATX（100 mg/kg）+Sirt1 抑制劑EX527（10 mg/kg［14］）組（ATX+EX527 組），每組12 只。分組完成后各ATX 組給予相應(yīng)濃度的ATX 溶液（ATX 溶解于5%羧甲基纖維素鈉中）灌胃；ATX+EX527 組在灌胃100 mg/kg ATX 的同時(shí)，腹腔注射10 mg/kg 的EX527（DMSO 溶解稀釋）；sham 組和CI/R 組給予等體積的5%羧甲基纖維素鈉灌胃和DMSO 腹腔注射，每天1次，連續(xù)給藥3 d。

3.2 模型制備 末次給藥1 h 后，采用線栓法構(gòu)建CI/R 大鼠模型［6］：用戊巴比妥鈉（50 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，沿中線切開頸部皮膚；然后，仔細(xì)解剖右頸總動(dòng)脈（common carotid artery，CCA）、頸外動(dòng)脈（external carotid artery，ECA）和頸內(nèi)動(dòng)脈（internal carotid artery，ICA）；在CCA 和ECA 的近端結(jié)扎后，將一根線栓從CCA 插入右ICA，直到感覺到輕度的阻力，表明大腦中動(dòng)脈（middle cerebral artery，MCA）閉塞（MCA occlusion，MCAO），導(dǎo)致MCA 提供的區(qū)域血流暫時(shí)停止；MCAO 2 h 后，取出線栓以使血液通過右ICA 回流（實(shí)現(xiàn)再灌注）；隨后，用4-0 絲線縫合皮膚，在整個(gè)過程中，保持大鼠的體溫在（37±0.5）℃。sham 組大鼠進(jìn)行相同的手術(shù)程序，不同之處在于不將線栓插入ICA阻塞血管。

3.3 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 再灌注24 h 后，由對(duì)實(shí)驗(yàn)組不知情的研究人員進(jìn)行神經(jīng)學(xué)評(píng)估。參照Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0 分，無缺損；1 分，提尾時(shí)不能充分伸展對(duì)側(cè)前肢；2 分，行走時(shí)向?qū)?cè)輕度旋轉(zhuǎn)；3 分，行走時(shí)向?qū)?cè)傾斜；4 分，不能自發(fā)行走或伴意識(shí)障礙。分?jǐn)?shù)越高表示神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

3.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩個(gè)部分。將一水池（直徑120 cm，高50 cm）平均分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ象限，在第Ⅳ象限中央距水平1 cm 處放置一圓形隱藏平臺(tái)。水中倒入墨水，保持水溫21～23℃。通過計(jì)算機(jī)視頻跟蹤系統(tǒng)記錄實(shí)驗(yàn)中的逃逸潛伏期和觀察并記錄在目標(biāo)象限（象限Ⅳ）中停留的時(shí)間（時(shí)間百分比）及平臺(tái)穿越的次數(shù)。（1）定位航行實(shí)驗(yàn)：每次從不同象限將大鼠放入池中，逃避潛伏期記錄為大鼠從起點(diǎn)到目標(biāo)平臺(tái)的游泳時(shí)間；若大鼠120 s 內(nèi)未找到平臺(tái)，則潛伏期記為120 s，并將其引入平臺(tái)停留10 s；每天訓(xùn)練4 次，每次間隔30 min，連續(xù)4 d，記錄每天逃避潛伏期的平均值。（2）空間探索實(shí)驗(yàn)：定位航行實(shí)驗(yàn)第5 天，撤掉平臺(tái)，將大鼠從第Ⅰ象限放入水中，記錄大鼠60 s內(nèi)在目標(biāo)象限中停留時(shí)間的百分比和平臺(tái)穿越次數(shù)。逃避潛伏期越長，在目標(biāo)象限中停留的時(shí)間越短，穿越平臺(tái)的次數(shù)越少，表示實(shí)驗(yàn)大鼠的認(rèn)知功能越差。

3.5 HE 染色觀察海馬神經(jīng)元損傷 行為學(xué)檢測完成后，大鼠麻醉、經(jīng)心灌注后，通過斷頭迅速處死大鼠并取出腦組織。隨機(jī)選取6 只大鼠的腦組織，在室溫下用4%多聚甲醛固定7 d 后，梯度乙醇溶液脫水，石蠟包埋，將組織切成4 μm 切片。切片用蘇木精染色2 min，并用伊紅染色30 s。光學(xué)顯微鏡下觀察海馬組織的病理學(xué)變化。

3.6 TUNEL 染色檢測海馬神經(jīng)元凋亡 取方法3.5 制備的腦組織切片，去石蠟并重新水化。用0.1 mol/L PBS 洗滌2 次后，將切片與10 mg/L 蛋白酶K 工作溶液（pH 7.5～8.0）在37 ℃孵育15 min。然后，再次用PBS 沖洗，在室溫下用綠色熒光素標(biāo)記的dUTP溶液染色10 min。DAPI染核。使用熒光顯微鏡檢測呈綠色熒光顆粒的TUNEL 陽性細(xì)胞。選擇3個(gè)隨機(jī)視野，計(jì)算TUNEL 陽性凋亡神經(jīng)元占DAPI 染色神經(jīng)元總數(shù)的百分比，表示凋亡率。

3.7 免疫組化法檢測海馬組織BDNF 的表達(dá) 取方法3.5 制備的切片，二甲苯脫蠟，PBS 清洗3 次，微波修復(fù)15 min，加入3% H2O2孵育10 min，再次清洗后，用10%山羊血清封閉30 min，加Ⅰ抗（兔抗大鼠BDNF 抗體，1∶500），4 ℃孵育過夜，然后在室溫下加Ⅱ抗（1∶2 000）孵育1 h，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、中性樹脂封片，顯微鏡下觀察到胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色為BDNF 陽性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選擇不重疊的3 個(gè)視野，Image-Pro Plus 6.0 對(duì)圖像進(jìn)行分析，計(jì)算BDNF 陽性表達(dá)的平均吸光度（mean absorbance）。

3.8 RT-qPCR 檢測海馬組織miR-134 表達(dá)及Sirt1、CREB 和BDNF 的mRNA 表達(dá) 每組剩余6 只大鼠，處死后分離海馬組織，使用Trizol 試劑提取總RNA。分光光度計(jì)測量總RNA 的濃度。使用PrimeScript?RT試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）。根據(jù)擴(kuò)增試劑盒的說明，進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)體系（20 μL）：SYBR?Premix Ex TaqTM（2×）10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA（200 μg/L）2 μL，ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性18 s，60℃持續(xù)55 s，最后72 ℃延伸2 min，進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。所有反應(yīng)均重復(fù)3次。將RNA 的表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法計(jì)算，并相對(duì)于內(nèi)參照U6或β-actin進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

3.9 Western blot 檢 測 海 馬 組 織Sirt1、CREB 和BDNF的蛋白表達(dá) 取海馬組織，在含有蛋白酶抑制劑（PMSF）和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液中勻漿，12 000 r/min離心15 min，取上清，BCA 法進(jìn)行蛋白定量，RIPA 裂解液平衡蛋白濃度，變性后取等量蛋白質(zhì)樣品上樣（30 μg），SDS-PAGE 分離，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入Ⅰ抗（Sirt1、CREB、p-CREB和BDNF 抗體，1∶1 000；β-actin 抗體，1∶2 000），4 ℃下孵育過夜，加Ⅱ抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，ECL 顯色，以β-actin 為內(nèi)參照，通過與內(nèi)參的灰度比，得出目的條帶的相對(duì)表達(dá)水平。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 22.0 和Image-Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性和方差齊性分別通過Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)和Levene 檢驗(yàn)進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，并使用Bonferroni 進(jìn)行兩兩比較。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分

MCAO 術(shù)后，造模大鼠表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)功能缺損，與sham 組相比，CI/R 組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著升高（P＜0.05）；與CI/R 組相比，ATX-L 和ATX-H 組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著降低（P＜0.05），且ATX-H 組的效果優(yōu)于ATX-L 組；與ATX-H組相比，ATX+EX527 組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著升高（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分Table 2. Neurological deficit scores of the rats in each group（Mean±SD. n=12）

2 各組大鼠學(xué)習(xí)及認(rèn)知能力

與sham 組相比，CI/R 組大鼠在MCAO 術(shù)后第2～4 天，在定位航行實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期顯著延長（P＜0.05），并且在空間探索實(shí)驗(yàn)中目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少（P＜0.05）；與CI/R 組相比，ATX-L 和ATX-H 組大鼠的逃避潛伏期顯著縮短（P＜0.05），目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加（P＜0.05），且ATX-H 組的效果優(yōu)于ATX-L 組；與ATX-H 組相比，ATX+EX527 組大鼠的逃避潛伏期顯著延長（P＜0.05），目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少（P＜0.05），見表3、4。

表3 定位航行實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期Table 3. Escape latency in positioning navigation experiment（s. Mean±SD. n=12）

3 各組大鼠海馬組織病理學(xué)變化

HE 染色結(jié)果顯示，sham 組海馬組織學(xué)正常，神經(jīng)元淡染，細(xì)胞核圓形；與sham 組相比，CI/R 組呈現(xiàn)核固縮、神經(jīng)元數(shù)量減少和神經(jīng)元萎縮等組織病理學(xué)變化；與CI/R組相比，ATX-L和ATX-H組大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量增加，神經(jīng)元萎縮得到緩解，且ATX-H組海馬組織病理損傷較輕；而ATX+EX527 組海馬神經(jīng)元數(shù)量較ATX-H 組明顯減少，病理損傷加重，見圖1。

Figure 1. HE staining results of hippocampal CA1 region of the rats in each group. A：sham group；B：CI/R group；C：ATX-L group；D：ATX-H group；E：ATX+EX527 group. The scale bar=20 μm.圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)HE染色結(jié)果

4 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡情況

與sham 組相比，CI/R 組海馬神經(jīng)元凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與CI/R 組相比，ATX-L 和ATX-H 組海馬神經(jīng)元凋亡率顯著降低（P＜0.05）；與ATX-H 組相比，ATX+EX527 組海馬神經(jīng)元凋亡率現(xiàn)在升高（P＜0.05），見圖2、表5。

Figure 2. TUNEL（green）staining results of hippocampal tissues of the rats in each group. A：sham group；B：CI/R group；C：ATXL group；D：ATX-H group；E：ATX+EX527 group. The scale bar=20 μm.圖2 各組大鼠海馬組織TUNEL染色結(jié)果

表4 空間探索實(shí)驗(yàn)中目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)Table 4. Residence time in target quadrant and times of crossing platform in space exploration experiment（Mean±SD. n=12）

5 各組大鼠海馬組織BDNF的表達(dá)

與sham 組相比，CI/R 組大鼠海馬組織BDNF 陽性表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與CI/R組相比，ATX-L和ATX-H 組大鼠海馬BDNF 陽性表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與ATX-H 組相比，ATX+EX527 組大鼠海馬BDNF陽性表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見圖3、表5。

表5 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡和BDNF的表達(dá)Table 5. Neuronal apoptosis and BDNF expression in the hippocampus of rats in each group（Mean±SD. n=6）

Figure 3. Immunohistochemical staining results of BDNF in hippocampal CA1 region of the rats in each group. A：sham group；B：CI/R group；C：ATX-L group；D：ATX-H group；E：ATX+EX527 group. The scale bar=50 μm.圖3 各組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF免疫組化染色結(jié)果

6 各組大鼠海馬組織miR-134 表達(dá)及Sirt1、CREB和BDNF的mRNA表達(dá)水平

與sham 組相比，CI/R 組大鼠海馬組織miR-134表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），Sirt1、CREB 和BDNF的mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與CI/R 組相比，ATX-L 和ATX-H 組大鼠海馬組織Sirt1、CREB 和BDNF 的mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），miR-134 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與ATX-H 組相比，ATX+EX527組大鼠海馬組織miR-134表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），Sirt1、CREB 和BDNF 的mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見表6。

表6 各組大鼠海馬組織miR-134表達(dá)及Sirt1、CREB和BDNF的mRNA表達(dá)Table 6. The expression of miR-134，and the mRNA expression of Sirt1，CREB and BDNF in hippocampal tissues of the rats in each group（Mean±SD. n=6）

7 各組大鼠海馬組織Sirt1、CREB、p-CREB 和BDNF的蛋白水平

與sham 組相比，CI/R 組大鼠海馬組織Sirt1 和BDNF 蛋白表達(dá)及p-CREB/CREB 比值顯著降低（P＜0.05）；與CI/R 組相比，ATX-L 和ATX-H 組大鼠海馬Sirt1和BDNF 蛋白表達(dá)及p-CREB/CREB 比值顯著升高（P＜0.05）；與ATX-H 組相比，ATX+EX527 組大鼠海馬Sirt1 和BDNF 蛋白表達(dá)及p-CREB/CREB 比值顯著降低（P＜0.05），見圖4。

Figure 4. Protein levels of Sirt1，CREB，p-CREB and BDNF in hippocampal tissues of the rats in each group. A：sham group；B：CI/R group；C：ATX-L group；D：ATX-H group；E：ATX+EX527 group. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs CI/R group；△P＜0.05 vs ATX-H group.圖4 各組大鼠海馬組織Sirt1、CREB、p-CREB和BDNF蛋白水平

討 論

ATX 是一種具有高抗炎和抗氧化活性的天然類胡蘿卜素，廣泛分布于藻類、蟹、蝦、鮭魚和甲殼類動(dòng)物中，被認(rèn)為是一種潛在的神經(jīng)保護(hù)藥物，可減輕I/R 所致的腦損傷［6］；其預(yù)處理可呈劑量依賴性地抑制急性腦梗死后的氧化應(yīng)激，并上調(diào)神經(jīng)營養(yǎng)因子（如BDNF、NGF）的表達(dá)，減輕神經(jīng)損傷［13］；可促進(jìn)創(chuàng)傷性腦損傷小鼠恢復(fù)認(rèn)知功能［15］。研究顯示，單次或多次攝入ATX后會(huì)積聚在大鼠大腦的海馬和大腦皮層中，有利于認(rèn)知功能的維持和改善［16-17］。在本研究中，ATX 表現(xiàn)出類似的神經(jīng)保護(hù)作用，可抑制海馬神經(jīng)元凋亡，極大地促進(jìn)了I/R 大鼠的認(rèn)知功能恢復(fù)。說明ATX可改善CI/R后認(rèn)知功能障礙。

BDNF在海馬組織中廣泛表達(dá)，在突觸的正常生長、發(fā)育和可塑性中起重要作用［9］。CREB 家族是BDNF 轉(zhuǎn)錄的主要調(diào)節(jié)劑，敲減CREB將降低BDNF的轉(zhuǎn)錄［18］；而CREB/BDNF 通路的激活可減輕海馬神經(jīng)元損傷，改善認(rèn)知功能［11］。在本研究中，I/R 大鼠海馬組織中p-CREB/CREB 比值和BDNF 表達(dá)顯著低于假手術(shù)大鼠，即CREB 磷酸化被抑制。因此，我們猜想ATX 對(duì)認(rèn)知功能的改善作用可能與CREB/BDNF通路的激活有關(guān)。研究結(jié)果也證實(shí)了此猜想，經(jīng)ATX 干預(yù)的大鼠海馬組織中p-CREB/CREB 比值和BDNF 表達(dá)明顯升高，說明ATX 可激活CREB/BDNF 通路。此結(jié)果提示ATX 可能通過激活CREB/BDNF 通路減輕CI/R 后認(rèn)知功能障礙，但是尚不清楚介導(dǎo)CREB/BDNF表達(dá)的上游信號(hào)傳導(dǎo)通路。

隨著分子技術(shù)的發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)miRNA 參與海馬突觸可塑性，在學(xué)習(xí)和記憶形成中具有顯著潛力。許多miRNA 已經(jīng)從神經(jīng)系統(tǒng)中分離，據(jù)報(bào)道，miR-134 在缺血性中風(fēng)中其表達(dá)明顯增加，對(duì)CREB的翻譯有限制作用，可通過參與樹突棘大小變化、神經(jīng)元可塑性等過程來影響腦發(fā)育［19］；抑制其表達(dá)可保護(hù)缺血性中風(fēng)小鼠的大腦和神經(jīng)元免受缺氧損傷［20］；并可通過靶向促進(jìn)CREB mRNA 翻譯，從而上調(diào)BDNF 的表達(dá)［21］。因此，miR-134 可能是CREB/BDNF 通路的上游調(diào)節(jié)因子。此外，有研究發(fā)現(xiàn)miR-134 在海馬的過度表達(dá)，與Sirt1缺失的效果非常相似，Sirt1缺失可通過miR-134 減弱CREB 活性，下調(diào)BDNF 的表達(dá)，損害大腦的認(rèn)知功能［12］。白藜蘆醇可通過Sirt1/miR-134 信號(hào)通路在體內(nèi)和體外調(diào)節(jié)海馬中的CREB/BDNF 表達(dá)，預(yù)防慢性不可預(yù)測的輕度應(yīng)激引起的認(rèn)知功能障礙［22］。本研究結(jié)果顯示，在I/R 大鼠海馬組織中Sirt1 的表達(dá)減少，而miR-134 呈高表達(dá)，與以上研究結(jié)果一致；由此可見，Sirt1/miR-134 通路可能是CREB/BDNF 通路的上游信號(hào)傳導(dǎo)通路。最近的研究數(shù)據(jù)表明，ATX 可以調(diào)控Sirt1蛋白表達(dá)［23］，它通過激活Sirt1，減輕小鼠顱腦損傷后的氧化應(yīng)激和神經(jīng)元凋亡［24］；還可上調(diào)BDNF和海馬突觸蛋白的表達(dá)，從而改善衰老模型小鼠的學(xué)習(xí)、認(rèn)知和記憶能力［25］。在本研究中，可觀察到經(jīng)ATX 干預(yù)的大鼠海馬中Sirt1 mRNA 和蛋白表達(dá)明顯高于I/R模型大鼠，miR-134表達(dá)也降低了，故我們推測ATX 對(duì)CI/R 后CREB/BDNF 通路的調(diào)控作用可能與Sirt1/miR-134 信號(hào)通路有關(guān)。為了驗(yàn)證此推測，我們使用Sirt1 特異性抑制劑EX527 與ATX 共同干預(yù)大鼠，結(jié)果顯示ATX 對(duì)CI/R 后認(rèn)知功能的改善作用和對(duì)CREB/BDNF 通路的激活作用明顯被減弱，提示ATX 可能通過激活Sirt1 下調(diào)miR-134 的表達(dá)，進(jìn)而激活CREB/BDNF 通路，然后對(duì)大鼠CI/R后認(rèn)知功能發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，ATX 預(yù)處理可能通過調(diào)控Sirt1/miR-134 通路而激活CREB/BDNF 通路，進(jìn)而減輕大鼠CI/R 后的認(rèn)知功能障礙。本研究僅從動(dòng)物水平上進(jìn)行了初步探究，下一步將采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)此結(jié)論進(jìn)行深入驗(yàn)證。