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    蝦青素預(yù)處理通過調(diào)控Sirt1/miR-134信號(hào)通路改善腦缺血再灌注大鼠認(rèn)知功能*

    2021-10-20 08:03:50古春青張運(yùn)克楊廣華武繼濤
    中國病理生理雜志 2021年9期
    關(guān)鍵詞:海馬實(shí)驗(yàn)

    古春青, 張運(yùn)克, 楊廣華, 武繼濤

    (河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病科,河南鄭州 450000)

    缺血性中風(fēng)是指由于腦血管閉塞引起的腦缺血,具有很高的發(fā)病率、致殘率、致死率和復(fù)發(fā)率,近年來,其發(fā)病呈年輕化趨勢,已成為醫(yī)學(xué)界和社會(huì)關(guān)注的重大問題[1]。缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷在缺血性中風(fēng)的發(fā)生中起重要作用,據(jù)報(bào)道,血管再通后恢復(fù)到缺血區(qū)域的血流會(huì)在一定程度上加重缺血性腦損傷,從而加重病情,這種病理過程被稱為腦缺血再灌注(cerebral ischemia/reperfusion,CI/R)[2]。CI/R 可引起神經(jīng)元損傷,導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙,甚至導(dǎo)致“血管性癡呆”,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,增加中風(fēng)的死亡率和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[3-4。因此,有必要進(jìn)一步探索其潛在的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制,并探索新穎的有希望的干預(yù)措施以減輕中風(fēng)引起的認(rèn)知功能障礙。

    蝦青素(ataxanthin,ATX)是一種類胡蘿卜素,具有強(qiáng)大的抗氧化劑和抗炎活性。最近,ATX 因其預(yù)防或治療包括阿爾茨海默病和帕金森病在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病的作用而受到關(guān)注[5]。ATX 對(duì)大腦具有很強(qiáng)的保護(hù)作用,其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其可以輕松穿越血腦屏障,可減少I/R 損傷引起的神經(jīng)元缺陷[6];還可通過抑制炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激,減輕阿霉素誘導(dǎo)的認(rèn)知障礙[7]及血管性癡呆小鼠的認(rèn)知障礙和海馬神經(jīng)元損傷[8]。然而,目前尚無研究報(bào)道ATX能否減輕CI/R所致認(rèn)知功能障礙。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)參與神經(jīng)元的存活、生長和新神經(jīng)元的分化[9],與神經(jīng)元損傷密切相關(guān),是治療中風(fēng)的重要靶點(diǎn)[10];其表達(dá)受環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)的調(diào)控,而且在多種神經(jīng)退行性疾病中CREB/BDNF 信號(hào)通路的活化與認(rèn)知功能的改善緊密相關(guān)[11]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1,Sirt1)是一種NAD+依賴的脫乙酰酶,在大腦中具有多方面的作用,與神經(jīng)可塑性密切相關(guān),而Sirt1 的缺失可通過miR-134 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后機(jī)制減弱CREB 活性,導(dǎo)致BDNF 的表達(dá)下調(diào),從而削弱突觸可塑性,損害大腦的認(rèn)知功能[12]。以上研究提示Sirt1/miR-134 信號(hào)通路可能介導(dǎo)CREB/BDNF 信號(hào)通路的活化,從而參與大腦認(rèn)知功能的調(diào)節(jié),故本研究擬通過建立CI/R大鼠模型,探究ATX 對(duì)CI/R 大鼠認(rèn)知功能的影響及可能的作用機(jī)制。

    材 料 和 方 法

    1 動(dòng)物

    從北京維通利華動(dòng)物中心購入7~8 周齡SPF 級(jí)雄性SD 大鼠60 只,體重(300±20)g,許可證為SCXK(京)2019-0009。將大鼠飼養(yǎng)在可控的環(huán)境[溫度(22±2)℃,濕度(55±5)%,12 h明/暗交替]中,所有大鼠可自由飲水和攝食。研究遵循《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》,按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R 原則給予人道的關(guān)懷,并由機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

    2 主要試劑與儀器

    ATX(HPLC≥97%)購自Sigma-Aldrich;線栓購自北京西濃科技有限公司;EX527(Sirt1 抑制劑)購自ApexBi;HE 染色試劑、RIPA 裂解液和BCA 試劑盒購自碧云天生物科技公司;TUNEL 原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自武漢博士德公司;Trizol RNA 分離試劑、PrimeScript?RT 試劑盒和SYBR?Premix Ex Taq?II試劑盒購自TaKaRa;兔抗大鼠Sirt1、BDNF、CREB、p-CREB 和β-actin 抗體及山羊抗兔IgG H&L 均購自Abcam;RT-qPCR 引物由GenePharma 公司合成,序列見表1。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置(WMT-100S)購自成都泰盟軟件有限公司;熒光定量PCR 系統(tǒng)(Prism?7300)購自ABI;倒置熒光顯微鏡(IX73)購自O(shè)lympus;蛋白轉(zhuǎn)膜裝置購自Bio-Rad。

    表1 RT-qPCR引物序列Table 1. Sequences of the primers for RT-qPCR

    3 主要方法

    3.1 實(shí)驗(yàn)分組 SD 大鼠60 只隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham 組)、模型組(CI/R 組)、ATX 低劑量(50 mg/kg[13])組(ATX-L 組)、ATX 高 劑 量(100 mg/kg[13])組(ATX-H 組)和ATX(100 mg/kg)+Sirt1 抑制劑EX527(10 mg/kg[14])組(ATX+EX527 組),每組12 只。分組完成后各ATX 組給予相應(yīng)濃度的ATX 溶液(ATX 溶解于5%羧甲基纖維素鈉中)灌胃;ATX+EX527 組在灌胃100 mg/kg ATX 的同時(shí),腹腔注射10 mg/kg 的EX527(DMSO 溶解稀釋);sham 組和CI/R 組給予等體積的5%羧甲基纖維素鈉灌胃和DMSO 腹腔注射,每天1次,連續(xù)給藥3 d。

    3.2 模型制備 末次給藥1 h 后,采用線栓法構(gòu)建CI/R 大鼠模型[6]:用戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,沿中線切開頸部皮膚;然后,仔細(xì)解剖右頸總動(dòng)脈(common carotid artery,CCA)、頸外動(dòng)脈(external carotid artery,ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery,ICA);在CCA 和ECA 的近端結(jié)扎后,將一根線栓從CCA 插入右ICA,直到感覺到輕度的阻力,表明大腦中動(dòng)脈(middle cerebral artery,MCA)閉塞(MCA occlusion,MCAO),導(dǎo)致MCA 提供的區(qū)域血流暫時(shí)停止;MCAO 2 h 后,取出線栓以使血液通過右ICA 回流(實(shí)現(xiàn)再灌注);隨后,用4-0 絲線縫合皮膚,在整個(gè)過程中,保持大鼠的體溫在(37±0.5)℃。sham 組大鼠進(jìn)行相同的手術(shù)程序,不同之處在于不將線栓插入ICA阻塞血管。

    3.3 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 再灌注24 h 后,由對(duì)實(shí)驗(yàn)組不知情的研究人員進(jìn)行神經(jīng)學(xué)評(píng)估。參照Longa評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):0 分,無缺損;1 分,提尾時(shí)不能充分伸展對(duì)側(cè)前肢;2 分,行走時(shí)向?qū)?cè)輕度旋轉(zhuǎn);3 分,行走時(shí)向?qū)?cè)傾斜;4 分,不能自發(fā)行走或伴意識(shí)障礙。分?jǐn)?shù)越高表示神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

    3.4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 包括定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)兩個(gè)部分。將一水池(直徑120 cm,高50 cm)平均分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ象限,在第Ⅳ象限中央距水平1 cm 處放置一圓形隱藏平臺(tái)。水中倒入墨水,保持水溫21~23℃。通過計(jì)算機(jī)視頻跟蹤系統(tǒng)記錄實(shí)驗(yàn)中的逃逸潛伏期和觀察并記錄在目標(biāo)象限(象限Ⅳ)中停留的時(shí)間(時(shí)間百分比)及平臺(tái)穿越的次數(shù)。(1)定位航行實(shí)驗(yàn):每次從不同象限將大鼠放入池中,逃避潛伏期記錄為大鼠從起點(diǎn)到目標(biāo)平臺(tái)的游泳時(shí)間;若大鼠120 s 內(nèi)未找到平臺(tái),則潛伏期記為120 s,并將其引入平臺(tái)停留10 s;每天訓(xùn)練4 次,每次間隔30 min,連續(xù)4 d,記錄每天逃避潛伏期的平均值。(2)空間探索實(shí)驗(yàn):定位航行實(shí)驗(yàn)第5 天,撤掉平臺(tái),將大鼠從第Ⅰ象限放入水中,記錄大鼠60 s內(nèi)在目標(biāo)象限中停留時(shí)間的百分比和平臺(tái)穿越次數(shù)。逃避潛伏期越長,在目標(biāo)象限中停留的時(shí)間越短,穿越平臺(tái)的次數(shù)越少,表示實(shí)驗(yàn)大鼠的認(rèn)知功能越差。

    3.5 HE 染色觀察海馬神經(jīng)元損傷 行為學(xué)檢測完成后,大鼠麻醉、經(jīng)心灌注后,通過斷頭迅速處死大鼠并取出腦組織。隨機(jī)選取6 只大鼠的腦組織,在室溫下用4%多聚甲醛固定7 d 后,梯度乙醇溶液脫水,石蠟包埋,將組織切成4 μm 切片。切片用蘇木精染色2 min,并用伊紅染色30 s。光學(xué)顯微鏡下觀察海馬組織的病理學(xué)變化。

    3.6 TUNEL 染色檢測海馬神經(jīng)元凋亡 取方法3.5 制備的腦組織切片,去石蠟并重新水化。用0.1 mol/L PBS 洗滌2 次后,將切片與10 mg/L 蛋白酶K 工作溶液(pH 7.5~8.0)在37 ℃孵育15 min。然后,再次用PBS 沖洗,在室溫下用綠色熒光素標(biāo)記的dUTP溶液染色10 min。DAPI染核。使用熒光顯微鏡檢測呈綠色熒光顆粒的TUNEL 陽性細(xì)胞。選擇3個(gè)隨機(jī)視野,計(jì)算TUNEL 陽性凋亡神經(jīng)元占DAPI 染色神經(jīng)元總數(shù)的百分比,表示凋亡率。

    3.7 免疫組化法檢測海馬組織BDNF 的表達(dá) 取方法3.5 制備的切片,二甲苯脫蠟,PBS 清洗3 次,微波修復(fù)15 min,加入3% H2O2孵育10 min,再次清洗后,用10%山羊血清封閉30 min,加Ⅰ抗(兔抗大鼠BDNF 抗體,1∶500),4 ℃孵育過夜,然后在室溫下加Ⅱ抗(1∶2 000)孵育1 h,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,常規(guī)脫水、透明、中性樹脂封片,顯微鏡下觀察到胞質(zhì)內(nèi)呈棕黃色為BDNF 陽性細(xì)胞。每張切片隨機(jī)選擇不重疊的3 個(gè)視野,Image-Pro Plus 6.0 對(duì)圖像進(jìn)行分析,計(jì)算BDNF 陽性表達(dá)的平均吸光度(mean absorbance)。

    3.8 RT-qPCR 檢測海馬組織miR-134 表達(dá)及Sirt1、CREB 和BDNF 的mRNA 表達(dá) 每組剩余6 只大鼠,處死后分離海馬組織,使用Trizol 試劑提取總RNA。分光光度計(jì)測量總RNA 的濃度。使用PrimeScript?RT試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA(cDNA)。根據(jù)擴(kuò)增試劑盒的說明,進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)體系(20 μL):SYBR?Premix Ex TaqTM(2×)10 μL,上、下游引物各0.8 μL,cDNA(200 μg/L)2 μL,ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性1 min;95 ℃變性18 s,60℃持續(xù)55 s,最后72 ℃延伸2 min,進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。所有反應(yīng)均重復(fù)3次。將RNA 的表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法計(jì)算,并相對(duì)于內(nèi)參照U6或β-actin進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

    3.9 Western blot 檢 測 海 馬 組 織Sirt1、CREB 和BDNF的蛋白表達(dá) 取海馬組織,在含有蛋白酶抑制劑(PMSF)和磷酸酶抑制劑的RIPA 裂解液中勻漿,12 000 r/min離心15 min,取上清,BCA 法進(jìn)行蛋白定量,RIPA 裂解液平衡蛋白濃度,變性后取等量蛋白質(zhì)樣品上樣(30 μg),SDS-PAGE 分離,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉封閉,加入Ⅰ抗(Sirt1、CREB、p-CREB和BDNF 抗體,1∶1 000;β-actin 抗體,1∶2 000),4 ℃下孵育過夜,加Ⅱ抗(1∶5 000)室溫孵育1 h,ECL 顯色,以β-actin 為內(nèi)參照,通過與內(nèi)參的灰度比,得出目的條帶的相對(duì)表達(dá)水平。

    4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    所得數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 22.0 和Image-Pro Plus 6.0 軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)分布的正態(tài)性和方差齊性分別通過Kolmogorov-Smirnov 檢驗(yàn)和Levene 檢驗(yàn)進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,并使用Bonferroni 進(jìn)行兩兩比較。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分

    MCAO 術(shù)后,造模大鼠表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)功能缺損,與sham 組相比,CI/R 組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著升高(P<0.05);與CI/R 組相比,ATX-L 和ATX-H 組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著降低(P<0.05),且ATX-H 組的效果優(yōu)于ATX-L 組;與ATX-H組相比,ATX+EX527 組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著升高(P<0.05),見表2。

    表2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分Table 2. Neurological deficit scores of the rats in each group(Mean±SD. n=12)

    2 各組大鼠學(xué)習(xí)及認(rèn)知能力

    與sham 組相比,CI/R 組大鼠在MCAO 術(shù)后第2~4 天,在定位航行實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期顯著延長(P<0.05),并且在空間探索實(shí)驗(yàn)中目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少(P<0.05);與CI/R 組相比,ATX-L 和ATX-H 組大鼠的逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05),目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)顯著增加(P<0.05),且ATX-H 組的效果優(yōu)于ATX-L 組;與ATX-H 組相比,ATX+EX527 組大鼠的逃避潛伏期顯著延長(P<0.05),目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)顯著減少(P<0.05),見表3、4。

    表3 定位航行實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期Table 3. Escape latency in positioning navigation experiment(s. Mean±SD. n=12)

    3 各組大鼠海馬組織病理學(xué)變化

    HE 染色結(jié)果顯示,sham 組海馬組織學(xué)正常,神經(jīng)元淡染,細(xì)胞核圓形;與sham 組相比,CI/R 組呈現(xiàn)核固縮、神經(jīng)元數(shù)量減少和神經(jīng)元萎縮等組織病理學(xué)變化;與CI/R組相比,ATX-L和ATX-H組大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量增加,神經(jīng)元萎縮得到緩解,且ATX-H組海馬組織病理損傷較輕;而ATX+EX527 組海馬神經(jīng)元數(shù)量較ATX-H 組明顯減少,病理損傷加重,見圖1。

    Figure 1. HE staining results of hippocampal CA1 region of the rats in each group. A:sham group;B:CI/R group;C:ATX-L group;D:ATX-H group;E:ATX+EX527 group. The scale bar=20 μm.圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)HE染色結(jié)果

    4 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡情況

    與sham 組相比,CI/R 組海馬神經(jīng)元凋亡率顯著升高(P<0.05);與CI/R 組相比,ATX-L 和ATX-H 組海馬神經(jīng)元凋亡率顯著降低(P<0.05);與ATX-H 組相比,ATX+EX527 組海馬神經(jīng)元凋亡率現(xiàn)在升高(P<0.05),見圖2、表5。

    Figure 2. TUNEL(green)staining results of hippocampal tissues of the rats in each group. A:sham group;B:CI/R group;C:ATXL group;D:ATX-H group;E:ATX+EX527 group. The scale bar=20 μm.圖2 各組大鼠海馬組織TUNEL染色結(jié)果

    表4 空間探索實(shí)驗(yàn)中目標(biāo)象限停留時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)Table 4. Residence time in target quadrant and times of crossing platform in space exploration experiment(Mean±SD. n=12)

    5 各組大鼠海馬組織BDNF的表達(dá)

    與sham 組相比,CI/R 組大鼠海馬組織BDNF 陽性表達(dá)顯著降低(P<0.05);與CI/R組相比,ATX-L和ATX-H 組大鼠海馬BDNF 陽性表達(dá)顯著升高(P<0.05);與ATX-H 組相比,ATX+EX527 組大鼠海馬BDNF陽性表達(dá)顯著降低(P<0.05),見圖3、表5。

    表5 各組大鼠海馬神經(jīng)元凋亡和BDNF的表達(dá)Table 5. Neuronal apoptosis and BDNF expression in the hippocampus of rats in each group(Mean±SD. n=6)

    Figure 3. Immunohistochemical staining results of BDNF in hippocampal CA1 region of the rats in each group. A:sham group;B:CI/R group;C:ATX-L group;D:ATX-H group;E:ATX+EX527 group. The scale bar=50 μm.圖3 各組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF免疫組化染色結(jié)果

    6 各組大鼠海馬組織miR-134 表達(dá)及Sirt1、CREB和BDNF的mRNA表達(dá)水平

    與sham 組相比,CI/R 組大鼠海馬組織miR-134表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),Sirt1、CREB 和BDNF的mRNA 表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與CI/R 組相比,ATX-L 和ATX-H 組大鼠海馬組織Sirt1、CREB 和BDNF 的mRNA 表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),miR-134 表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與ATX-H 組相比,ATX+EX527組大鼠海馬組織miR-134表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),Sirt1、CREB 和BDNF 的mRNA 表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),見表6。

    表6 各組大鼠海馬組織miR-134表達(dá)及Sirt1、CREB和BDNF的mRNA表達(dá)Table 6. The expression of miR-134,and the mRNA expression of Sirt1,CREB and BDNF in hippocampal tissues of the rats in each group(Mean±SD. n=6)

    7 各組大鼠海馬組織Sirt1、CREB、p-CREB 和BDNF的蛋白水平

    與sham 組相比,CI/R 組大鼠海馬組織Sirt1 和BDNF 蛋白表達(dá)及p-CREB/CREB 比值顯著降低(P<0.05);與CI/R 組相比,ATX-L 和ATX-H 組大鼠海馬Sirt1和BDNF 蛋白表達(dá)及p-CREB/CREB 比值顯著升高(P<0.05);與ATX-H 組相比,ATX+EX527 組大鼠海馬Sirt1 和BDNF 蛋白表達(dá)及p-CREB/CREB 比值顯著降低(P<0.05),見圖4。

    Figure 4. Protein levels of Sirt1,CREB,p-CREB and BDNF in hippocampal tissues of the rats in each group. A:sham group;B:CI/R group;C:ATX-L group;D:ATX-H group;E:ATX+EX527 group. Mean±SD. n=6.*P<0.05 vs sham group;#P<0.05 vs CI/R group;△P<0.05 vs ATX-H group.圖4 各組大鼠海馬組織Sirt1、CREB、p-CREB和BDNF蛋白水平

    討 論

    ATX 是一種具有高抗炎和抗氧化活性的天然類胡蘿卜素,廣泛分布于藻類、蟹、蝦、鮭魚和甲殼類動(dòng)物中,被認(rèn)為是一種潛在的神經(jīng)保護(hù)藥物,可減輕I/R 所致的腦損傷[6];其預(yù)處理可呈劑量依賴性地抑制急性腦梗死后的氧化應(yīng)激,并上調(diào)神經(jīng)營養(yǎng)因子(如BDNF、NGF)的表達(dá),減輕神經(jīng)損傷[13];可促進(jìn)創(chuàng)傷性腦損傷小鼠恢復(fù)認(rèn)知功能[15]。研究顯示,單次或多次攝入ATX后會(huì)積聚在大鼠大腦的海馬和大腦皮層中,有利于認(rèn)知功能的維持和改善[16-17]。在本研究中,ATX 表現(xiàn)出類似的神經(jīng)保護(hù)作用,可抑制海馬神經(jīng)元凋亡,極大地促進(jìn)了I/R 大鼠的認(rèn)知功能恢復(fù)。說明ATX可改善CI/R后認(rèn)知功能障礙。

    BDNF在海馬組織中廣泛表達(dá),在突觸的正常生長、發(fā)育和可塑性中起重要作用[9]。CREB 家族是BDNF 轉(zhuǎn)錄的主要調(diào)節(jié)劑,敲減CREB將降低BDNF的轉(zhuǎn)錄[18];而CREB/BDNF 通路的激活可減輕海馬神經(jīng)元損傷,改善認(rèn)知功能[11]。在本研究中,I/R 大鼠海馬組織中p-CREB/CREB 比值和BDNF 表達(dá)顯著低于假手術(shù)大鼠,即CREB 磷酸化被抑制。因此,我們猜想ATX 對(duì)認(rèn)知功能的改善作用可能與CREB/BDNF通路的激活有關(guān)。研究結(jié)果也證實(shí)了此猜想,經(jīng)ATX 干預(yù)的大鼠海馬組織中p-CREB/CREB 比值和BDNF 表達(dá)明顯升高,說明ATX 可激活CREB/BDNF 通路。此結(jié)果提示ATX 可能通過激活CREB/BDNF 通路減輕CI/R 后認(rèn)知功能障礙,但是尚不清楚介導(dǎo)CREB/BDNF表達(dá)的上游信號(hào)傳導(dǎo)通路。

    隨著分子技術(shù)的發(fā)展,研究者發(fā)現(xiàn)miRNA 參與海馬突觸可塑性,在學(xué)習(xí)和記憶形成中具有顯著潛力。許多miRNA 已經(jīng)從神經(jīng)系統(tǒng)中分離,據(jù)報(bào)道,miR-134 在缺血性中風(fēng)中其表達(dá)明顯增加,對(duì)CREB的翻譯有限制作用,可通過參與樹突棘大小變化、神經(jīng)元可塑性等過程來影響腦發(fā)育[19];抑制其表達(dá)可保護(hù)缺血性中風(fēng)小鼠的大腦和神經(jīng)元免受缺氧損傷[20];并可通過靶向促進(jìn)CREB mRNA 翻譯,從而上調(diào)BDNF 的表達(dá)[21]。因此,miR-134 可能是CREB/BDNF 通路的上游調(diào)節(jié)因子。此外,有研究發(fā)現(xiàn)miR-134 在海馬的過度表達(dá),與Sirt1缺失的效果非常相似,Sirt1缺失可通過miR-134 減弱CREB 活性,下調(diào)BDNF 的表達(dá),損害大腦的認(rèn)知功能[12]。白藜蘆醇可通過Sirt1/miR-134 信號(hào)通路在體內(nèi)和體外調(diào)節(jié)海馬中的CREB/BDNF 表達(dá),預(yù)防慢性不可預(yù)測的輕度應(yīng)激引起的認(rèn)知功能障礙[22]。本研究結(jié)果顯示,在I/R 大鼠海馬組織中Sirt1 的表達(dá)減少,而miR-134 呈高表達(dá),與以上研究結(jié)果一致;由此可見,Sirt1/miR-134 通路可能是CREB/BDNF 通路的上游信號(hào)傳導(dǎo)通路。最近的研究數(shù)據(jù)表明,ATX 可以調(diào)控Sirt1蛋白表達(dá)[23],它通過激活Sirt1,減輕小鼠顱腦損傷后的氧化應(yīng)激和神經(jīng)元凋亡[24];還可上調(diào)BDNF和海馬突觸蛋白的表達(dá),從而改善衰老模型小鼠的學(xué)習(xí)、認(rèn)知和記憶能力[25]。在本研究中,可觀察到經(jīng)ATX 干預(yù)的大鼠海馬中Sirt1 mRNA 和蛋白表達(dá)明顯高于I/R模型大鼠,miR-134表達(dá)也降低了,故我們推測ATX 對(duì)CI/R 后CREB/BDNF 通路的調(diào)控作用可能與Sirt1/miR-134 信號(hào)通路有關(guān)。為了驗(yàn)證此推測,我們使用Sirt1 特異性抑制劑EX527 與ATX 共同干預(yù)大鼠,結(jié)果顯示ATX 對(duì)CI/R 后認(rèn)知功能的改善作用和對(duì)CREB/BDNF 通路的激活作用明顯被減弱,提示ATX 可能通過激活Sirt1 下調(diào)miR-134 的表達(dá),進(jìn)而激活CREB/BDNF 通路,然后對(duì)大鼠CI/R后認(rèn)知功能發(fā)揮保護(hù)作用。

    綜上所述,ATX 預(yù)處理可能通過調(diào)控Sirt1/miR-134 通路而激活CREB/BDNF 通路,進(jìn)而減輕大鼠CI/R 后的認(rèn)知功能障礙。本研究僅從動(dòng)物水平上進(jìn)行了初步探究,下一步將采用體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)對(duì)此結(jié)論進(jìn)行深入驗(yàn)證。

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