草烏甲素通過(guò)JAK2/STAT3通路抑制Nav1.6表達(dá)減輕奧沙利鉑誘發(fā)的神經(jīng)病理性疼痛*

劉高麗， 劉 靜， 王江栓， 吳 松

（1漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)教研室，河南漯河 462002；2鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室，河南鄭州 450000；3漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校人體解剖學(xué)教研室，河南漯河 462002；4漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校計(jì)算機(jī)教研室，河南漯河 462002）

奧沙利鉑（oxaliplatin，OXA）為用于腫瘤化療的第三代鉑類抗腫瘤藥物，對(duì)晚期和/或轉(zhuǎn)移性消化道腫瘤等均具有較好療效［1］。隨著臨床廣泛的應(yīng)用，神經(jīng)病理性疼痛（neuropathic pain，NP）被發(fā)現(xiàn)為其主要局限性并發(fā)癥，導(dǎo)致部分患者不得不終止治療，影響患者生活質(zhì)量［2］。由于對(duì)OXA 引起NP 的機(jī)制缺乏深入了解，因此目前尚缺乏針對(duì)性的治療。草烏甲素（bulleyaconitine A，BLA）為分離自烏頭（Aconitum bulleyanumDiels）根莖中的萜類生物堿，為我國(guó)自主研發(fā)的有效鎮(zhèn)痛劑，臨床已用于治療風(fēng)濕和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腰肌勞損等引起的慢性疼痛［3］。研究發(fā)現(xiàn)，BLA 可降低辣椒素受體瞬時(shí)受體電位香草酸1 型（transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1）的表達(dá)和神經(jīng)元凋亡，減輕神經(jīng)機(jī)械損傷所致的NP［4］。另有研究顯示，草烏甲素可減輕紫杉醇引起的NP，但未對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行探討［5］，而其對(duì)OXA所致NP的治療效果及作用機(jī)制均不清楚。

Janus激酶（Janus kinase，JAK）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信號(hào)通路可通過(guò)作用于多種蛋白而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、免疫和炎癥等生物學(xué)過(guò)程［6］。JAK2及其底物STAT3 主要分布在神經(jīng)系統(tǒng)中，可調(diào)節(jié)多種神經(jīng)遞質(zhì)受體和離子通道蛋白的表達(dá)，其過(guò)度活化與大鼠NP 癥狀同步，抑制其活化可作為治療NP的新靶點(diǎn)［7-8］。在骨癌相關(guān)疼痛模型中，JAK2/STAT3信號(hào)通路的活化可上調(diào)電壓門控鈉通道（voltagegated sodium channels，Nav）等通道蛋白表達(dá)，增強(qiáng)背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）神經(jīng)元興奮性，引起疼痛的發(fā)生［9］。Li 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，Nav1.6 在DRG 中高表達(dá)參與OXA 所致大鼠NP 的病理過(guò)程。本研究推測(cè)BLA 可能通過(guò)作用于JAK2/STAT3 通路調(diào)控Nav1.6 表達(dá)，進(jìn)而減輕OXA 誘發(fā)的NP，并通過(guò)建立OXA誘導(dǎo)的大鼠NP模型對(duì)此進(jìn)行研究。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性SPF 級(jí)Wistar 大鼠（200～220 g），購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)為SCXK（豫）2017-0001。大鼠均在本校動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的動(dòng)物房中常規(guī)飼養(yǎng)，適應(yīng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

2 主要試劑及儀器

BLA 購(gòu)自云南昊邦制藥公司；注射用奧沙利鉑購(gòu)自齊魯制藥公司；JAK3 激動(dòng)劑C-A1 購(gòu)自MedChemExpress；抗JAK2 和p-JAK2 單克?。ㄍ茫┛贵w及羊抗兔Ⅱ抗購(gòu)自CST；抗Nav1.6 多克?。ㄍ茫┘癝TAT3和p-STAT3單克隆抗體購(gòu)自Abcam；BCA蛋白定量試劑盒和ECL 發(fā)光試劑盒購(gòu)自Thermo；RNA TriPure 試劑、反轉(zhuǎn)錄和FastStart?PCR Master 定量PCR 試劑盒購(gòu)自Roche。Western blot 實(shí)驗(yàn)裝置購(gòu)自BioRad；定量熒光PCR 儀購(gòu)自Roche；膜片鉗放大器購(gòu)自HEKA。

3 方法

3.1 模型制備和分組 大鼠分別于第1、2、7、8、14、15、21 和22 天，每天腹腔注射1 次OXA（4 mg/kg），制備OXA誘發(fā)的NP模型，對(duì)照組大鼠相同時(shí)間注射等量5%葡萄糖注射液［11］。首先，為明確BLA 對(duì)OXA大鼠的治療作用，將模型大鼠分為OXA 組及0.04 mg/kg、0.12 mg/kg和0.36 mg/kg BLA 治療組，并設(shè)置對(duì)照組，每組8 只。然后，為明確JAK2/STAT3 信號(hào)通路在BLA 治療過(guò)程中所發(fā)揮的作用，給予0.36 mg/kg BLA 治療的OXA 大鼠同時(shí)注射JAK3 激動(dòng)劑C-A1，組別設(shè)置為OXA組、0.36 mg/kg BLA治療組和0.36 mg/kg BLA 及C-A1 合用治療組，每組8 只。在OXA 誘發(fā)期間，BLA 采用灌胃給藥，JAK3 激動(dòng)劑CA1 采用腹腔注射給藥（給藥劑量100 μg/kg），每天1次，共給藥28 d。

3.2 行為學(xué)檢測(cè) 分別在制模前和注射OXA 后第7、14、21和28天，采用von Frey 細(xì)絲實(shí)驗(yàn)和冷板實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠的疼痛敏感度進(jìn)行分析。von Frey 細(xì)絲實(shí)驗(yàn)中采用已校準(zhǔn)的細(xì)絲（2.0～26.0 g）對(duì)大鼠右后爪底中心皮膚進(jìn)行垂直刺激，每次時(shí)間3 s，以右后爪快速退縮為陽(yáng)性反應(yīng)。若有響應(yīng)則施加下一個(gè)較低質(zhì)量的細(xì)絲；若無(wú)響應(yīng)則施加下一個(gè)更高質(zhì)量的細(xì)絲。記錄能夠引起陽(yáng)性反應(yīng)的最低質(zhì)量（g），記為機(jī)械縮爪閾值。為了避免測(cè)試對(duì)大鼠的傷害，von Frey 細(xì)絲最高質(zhì)量為26.0 g，且每次實(shí)驗(yàn)間隔5 min。冷板實(shí)驗(yàn)中，將大鼠置于放置有8 ℃冷板的透明塑料盒內(nèi)，將大鼠左后爪接觸冷板，記錄其左后爪撤縮時(shí)間，即為冷刺激縮爪潛伏期。為避免傷害，切斷時(shí)間為20 s，且每次實(shí)驗(yàn)間隔5 min。

3.3 電生理檢測(cè)［9］大鼠麻醉斷頭后，取雙側(cè)L4～L6 DRG 部分組織剪碎，采用膠原酶Ⅰ（1 g/L）和中性蛋白酶Ⅱ（5 g/L）消化后，離心棄上清，采用完全培養(yǎng)基懸浮沉淀以獲取單個(gè)神經(jīng)元懸液。將上述神經(jīng)元懸液加至細(xì)胞爬片（0.1 g/L賴氨酸包被）上培養(yǎng)2 h 后，采用膜片鉗放大器采集誘發(fā)動(dòng)作電位的最小電流、靜息膜電位（resting membrane potential，RMP）和300 pA電流下動(dòng)作電位數(shù)量，以此表示其興奮性。

3.4 Western blot 檢測(cè)蛋白水平 將L4～L6 DRG 組織置于-80 ℃保存。檢測(cè)時(shí)，采用蛋白提取試劑盒提取后，采用BCA 試劑盒定量蛋白濃度。制備SDSPAGE，每組取30 μg蛋白變性后進(jìn)行電泳分離，之后在半干轉(zhuǎn)膜裝置中轉(zhuǎn)印到PVDF 膜。轉(zhuǎn)膜成功后采用脫脂奶粉溶液封閉2 h，接著分別加入Ⅰ抗β-actin（1∶5 000）、Nav1.6（1∶500）、JAK2（1∶1 000）、STAT3（1∶2 000）、p-JAK2（1∶1 000）、STAT3（1∶2 000）抗體稀釋液，4 ℃過(guò)夜后漂洗3 次，加入Ⅱ抗稀釋液（1∶5 000）室溫孵育1.5 h 后漂洗3 次，加入ECL 發(fā)光試劑顯色。采用TANON 成像系統(tǒng)拍攝蛋白條帶并進(jìn)行灰度值分析。

3.5 RT-qPCR 檢測(cè) 將DRG 組織置于TriPure 試劑中勻漿，加入氯仿/異丙醇抽提、乙醇洗滌后離心收集沉淀，干燥后加入RNase-free 水溶解獲得RNA。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)為cDNA，作為RT-qPCR反應(yīng)體系的模板，采用FastStart?PCR Master 定量PCR 試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。采用2-ΔΔCt法以GAPDH 為內(nèi)參照計(jì)算Nav1.6 mRNA 的相對(duì)水平。所需引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The primer sequences for RT-qPCR

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad 8.0 和SPSS 22.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 草烏甲素減輕NP模型大鼠機(jī)械痛和冷痛敏感度

注射OXA 7、14、21 和28 d 后，與對(duì)照組比較，OXA 組機(jī)械痛和冷痛閾值明顯減低（P＜0.05）。治療14、21 和28 d 后，與OXA 組比較，0.12 mg/kg 和0.36 mg/kg 草烏甲素均可顯著升高大鼠的機(jī)械痛和冷痛閾值（P＜0.05）。治療21、28 d 后，0.04 mg/kg 草烏甲素可顯著提高大鼠的冷痛閾值（P＜0.05），但對(duì)機(jī)械痛閾值無(wú)明顯影響（P＞0.05）。0.12 mg/kg 和0.36 mg/kg 草烏甲素對(duì)機(jī)械痛和冷痛閾值的改善作用 明 顯 優(yōu) 于0.04 mg/kg 草 烏 甲 素（P＜0.05）。見圖1。

Figure 1. Comparison of mechanical paw withdrawal threshold（A）and paw withdrawal lantency to cold stimulation（B）in each group. Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs OXA group；&P＜0.05 vs 0.04 mg/kg BLA+OXA group.圖1 各組機(jī)械痛閾值及冷痛閾值的比較

2 草烏甲素抑制NP模型大鼠神經(jīng)元的興奮性

注射OXA 28 d 后，與對(duì)照組比較，OXA 組神經(jīng)元的RMP 和動(dòng)作電位數(shù)量明顯增高，誘發(fā)動(dòng)作電位的最小刺激電流明顯減低（P＜0.05）；治療28 d后，與OXA 組比較，0.12 mg/kg 和0.36 mg/kg 草烏甲素可顯著減低RMP 和動(dòng)作電位數(shù)量，并提高誘發(fā)動(dòng)作電位的最小刺激電流（P＜0.05），0.04 mg/kg 草烏甲素則僅可顯著提高誘發(fā)動(dòng)作電位的最小刺激電流（P＜0.05）。與0.04 mg/kg 草烏甲素組比較，0.12 mg/kg和0.36 mg/kg 草烏甲素組神經(jīng)元的興奮性顯著增加（P＜0.05）。見圖2、表2。

表2 各組神經(jīng)元興奮性的比較Table 2. Comparison of excitability of neurons in each group（Mean±SD. n=8）

Figure 2. Comparison of the number of action potentials of neurons in each group.圖2 各組神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢粩?shù)量的比較

3 草烏甲素抑制NP 模型大鼠Nav1.6 的mRNA 和蛋白表達(dá)

注 射OXA 28 d 后，與 對(duì) 照 組 比 較，OXA 組Nav1.6 的mRNA 和蛋白表達(dá)明顯增高（P＜0.05）。治療28 d 后，與OXA 組比較，0.12 mg/kg、0.36 mg/kg草烏甲素可顯著降低Nav1.6 的mRNA 和蛋白表達(dá)（P＜0.05），0.04 mg/kg 草烏甲素則對(duì)其表達(dá)無(wú)明顯影響（P＞0.05）。0.12 mg/kg 和0.36 mg/kg 草烏甲素對(duì)Nav1.6 mRNA 和蛋白表達(dá)的抑制作用強(qiáng)于0.04 mg/kg草烏甲素（P＜0.05）。見圖3A、圖4。

4 草烏甲素抑制NP 模型大鼠JAK2/STAT3 通路活化

注射OXA 28 d 后，與對(duì)照組比較，OXA 組DRG組織中p-JAK2 和p-STAT3 蛋白水平明顯增高（P＜0.05）；治療28 d 后，與OXA 組比較，0.12 mg/kg 和0.36 mg/kg 草烏甲素可顯著減低OXA 誘導(dǎo)的大鼠DRG 組 織 中p-JAK2 和p-STAT3 的 蛋 白 水 平（P＜0.05），0.04 mg/kg 草烏甲素則對(duì)JAK2 和STAT3 磷酸化無(wú)明顯調(diào)節(jié)作用（P＞0.05）。0.12 和0.36 mg/kg草烏甲素對(duì)JAK2 和STAT3 磷酸化的抑制作用強(qiáng)于0.04 mg/kg草烏甲素（P＜0.05）。見圖3B、圖4。

Figure 3. The images of Western blot for determining the protein levels of Nav1.6（A），and JAK2，STAT3，p-JAK2 and p-STAT3（B）in the rats of each group.圖3 Western blot檢測(cè)各組大鼠Nav1.6、JAK2、STAT3、p-JAK2和p-STAT3蛋白水平的變化

Figure 4. Comparison of Nav1.6 expression at mRNA and protein levels，and protein levels of p-JAK2 and p-STAT3 in each group.Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs OXA group；&P＜0.05 vs 0.04 mg/kg BLA+OXA group.圖4 各組Nav1.6的mRNA和蛋白表達(dá)及p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3蛋白水平的比較

5 草烏甲素調(diào)控JAK2/STAT3通路抑制Nav1.6的表達(dá)和神經(jīng)元興奮性

與OXA 組比較，0.36 mg/kg 草烏甲素可顯著降低OXA 大鼠DRG 組織中p-JAK2、p-STAT3 和Nav1.6的蛋白水平及動(dòng)作電位數(shù)量（P＜0.05）；與0.36 mg/kg 草烏甲素組比較，JAK2 激活劑C-A1 可顯著減弱草烏甲素對(duì)OXA 誘導(dǎo)的大鼠DRG 組織p-JAK2、p-STAT3和Nav1.6的蛋白水平及動(dòng)作電位數(shù)量的作用（P＜0.05）。見圖5、6。

Figure 5. Effect of bulleyaconitine A（BLA）on Nav1.6 protein expression（A）and number of action potentials（B）of neurons by regulating JAK2/STAT3 signaling pathway.圖5 草烏甲素調(diào)控JAK2/STAT3通路對(duì)Nav1.6蛋白表達(dá)和對(duì)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢粩?shù)量的影響

討 論

臨床中目前通常以抗抑郁、抗驚厥等藥物治療化療性NP，但效果并不能達(dá)到預(yù)期目標(biāo)，且會(huì)產(chǎn)生一定副作用［12］，因此尋找安全有效的治療藥物仍有必要。草烏甲素為提取自天然產(chǎn)物的鎮(zhèn)痛劑，廣泛應(yīng)用于臨床中多種疼痛的治療。本研究發(fā)現(xiàn)，給予草烏甲素治療后，OXA 誘導(dǎo)NP大鼠的機(jī)械痛和冷痛閾值明顯增高，可見草烏甲素可降低OXA 大鼠的疼痛敏感度，表明草烏甲素對(duì)化療性NP 也有一定治療作用。OXA 和其他化療藥物一樣，主要積累在DRG中并損傷周圍神經(jīng)，引起大鼠DRG 中神經(jīng)元過(guò)度興奮和Nav1.6表達(dá)上調(diào)，降低Nav1.6表達(dá)可降低神經(jīng)元興奮性并減輕NP 癥狀［10］。本研究在OXA 誘導(dǎo)的大鼠DRG 中觀察到了同樣的變化，且0.12 mg/kg、0.36 mg/kg 草烏甲素均可明顯抑制Nav1.6 表達(dá)，降低神經(jīng)元靜息膜電位和動(dòng)作電位數(shù)量，并提高誘發(fā)動(dòng)作電位的最小電流。由于電壓門控鈉離子通道在神經(jīng)中廣泛分布，其改變可直接調(diào)節(jié)神經(jīng)元的興奮性，引起非正常異位放電，而非正常異位放電又是NP 發(fā)生的病理生理基礎(chǔ)之一［13］。其中，Nav1.6 廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)和DRG 神經(jīng)元中，位于傷害性感覺神經(jīng)元的胞體和軸突起始端。Nav1.6 在DRG 中高表達(dá)，可使鈉離子通道失活率降低及復(fù)位速度加快，增加神經(jīng)元興奮性，參與異位放電的形成，引起疼痛，敲除DRG 中Nav1.6可減弱神經(jīng)損傷處神經(jīng)元的興奮性，減輕神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的機(jī)械性異常疼痛［14］。另外，Nav1.6 參與2 型糖尿病患者病理性神經(jīng)痛的發(fā)生過(guò)程，而Nav1.6在DRG 中的上調(diào)也參與骨癌痛的發(fā)生過(guò)程［15］。因此推測(cè)草烏甲素減輕OXA 誘導(dǎo)的大鼠NP 癥狀可能與其調(diào)控Nav1.6表達(dá)和神經(jīng)元興奮性有關(guān)。

Figure 6. Comparison of protein levels of p-JAK2，p-STAT3 and Nav1.6，and neuronal action potential number（APN）in each group. Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs OXA group；#P＜0.05 vs BLA group.圖6 各組p-JAK2、p-STAT3和Nav1.6蛋白水平及神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢粩?shù)量的比較

已有研究表明，神經(jīng)中Nav1.6 等表達(dá)異?？蓪?dǎo)致神經(jīng)元興奮性增加，并引起NP 等癥狀［16］，但其分子機(jī)制尚不明確。JAK2/STAT3 通路在多種NP 疾病中起重要作用，在神經(jīng)損傷引起的NP 大鼠中發(fā)現(xiàn)，JAK2/STAT3 信號(hào)通路通過(guò)上調(diào)損傷神經(jīng)中炎癥因子的表達(dá)來(lái)介導(dǎo)NP 的維持［17］。紫杉醇可增加JAK2和STAT3 的磷酸化，誘導(dǎo)JAK2/STAT3 通路活化，損傷神經(jīng)系統(tǒng)，產(chǎn)生疼痛［18］。本研究中，草烏甲素可顯著降低OXA 誘導(dǎo)的大鼠DRG 神經(jīng)元中上調(diào)的p-JAK2 和p-STAT3 蛋白水平，揭示了草烏甲素對(duì)JAK2/STAT3 通路的抑制作用。然而，STAT3 途徑的激活可引起Nav1.6 的表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致L5-VRT 誘導(dǎo)的神經(jīng)性疼痛［19-20］。為進(jìn)一步明確JAK2/STAT3信號(hào)通路在草烏甲素改善OXA 誘導(dǎo)大鼠NP 癥狀中的作用，本研究采用JAK 激動(dòng)劑進(jìn)行研究。與草烏甲素單一干預(yù)組比較，JAK2 激動(dòng)劑可顯著減弱草烏甲素對(duì)OXA 誘 導(dǎo) 的 大 鼠DRG 組 織p-JAK2、p-STAT3 和Nav1.6 蛋白水平的調(diào)控作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了草烏甲素對(duì)OXA 誘導(dǎo)的大鼠JAK2/STAT3 通路的調(diào)節(jié)作用，同時(shí)提示草烏甲素對(duì)OXA 誘導(dǎo)的大鼠DRG 組織Nav1.6 表達(dá)的調(diào)控作用可能與其調(diào)節(jié)JAK2/STAT3通路有關(guān)。也有研究指出，蛋白酶激活受體2（proteinase-activated receptor 2，PAR2）和磷酸肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）通路也可能為藥物治療OXA 誘導(dǎo)NP 的作用靶點(diǎn)［21-22］。而本研究也顯示，JAK2 激動(dòng)劑并不能完全逆轉(zhuǎn)草烏甲素對(duì)JAK2/STAT3通路和Nav1.6蛋白的調(diào)節(jié)作用，提示草烏甲素調(diào)節(jié)Nav1.6 蛋白、減輕OXA 誘導(dǎo)的大鼠NP癥狀的分子機(jī)制可能涉及其它通路，值得繼續(xù)探究。

綜上所述，本研究認(rèn)為草烏甲素可調(diào)節(jié)JAK2/STAT3 通路，繼而通過(guò)抑制Nav1.6 蛋白表達(dá)而降低神經(jīng)元興奮性，從而減輕OXA誘導(dǎo)大鼠的NP癥狀。