右美托咪定通過(guò)調(diào)控TXNIP/NLRP3炎癥小體途徑減輕脂多糖誘導(dǎo)的小鼠腸道屏障損傷*

賈 彤， 邢 珍， 王會(huì)娟， 李國(guó)利△

（河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院1麻醉科，2重癥醫(yī)學(xué)科，河北張家口 075061）

腸道作為主要的消化吸收?qǐng)鏊c道黏膜中含有豐富的血管，發(fā)生炎癥會(huì)造成腸道屏障損傷，而腸道屏障損傷參與多種腸道疾病的發(fā)生，與炎癥性腸病、細(xì)菌性腸炎和克羅恩病等關(guān)系密切［1］；腸道損傷會(huì)造成患者消瘦、營(yíng)養(yǎng)不良和生長(zhǎng)受阻，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡［2］。右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）是一種α2受體激動(dòng)藥物，其既可發(fā)揮鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛作用，又可抑制炎癥介質(zhì)釋放而發(fā)揮抗炎作用［3］，在腸道中可以緩解燒傷引起的腸屏障損傷［4］。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體參與腸道屏障損傷過(guò)程，能夠激活胱天蛋白酶1（caspase-1）/白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）通路，從而介導(dǎo)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，加重腸道損傷［5］；NLRP3 與其介質(zhì)硫氧還蛋白相互作用蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）結(jié)合，可以激活NLRP3 炎癥小體［6］。因此，抑制TXNIP/NLRP3 通路的激活可能對(duì)于緩解腸道屏障損傷具有重要的意義。本項(xiàng)工作以小鼠為研究對(duì)象，采用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)小鼠腸道屏障損傷，初步探討DEX 治療腸道屏障損傷的機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

60 只SPF 級(jí)雄性C57BL/6 小鼠，6 周齡，（20±2）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（京）2019-0009。在溫度23 ℃、濕度50%、12 h 黑暗/12 h 光照條件下自由飲水?dāng)z食，所有動(dòng)物暫養(yǎng)1 周，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合3R 原則。本研究經(jīng)河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核并通過(guò)。

2 主要試劑及儀器

鹽酸DEX 注射液（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）；LPS（Santa Cruz）；pcDNA3.1 載體和pcDNA3.1-TXNIP 過(guò)表達(dá)載體購(gòu)自廣州銳博生物有限公司；引物均由上海生工生物技術(shù)有限公司合成；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；小鼠IL-1β和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫 吸 附 測(cè) 定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒及TXNIP、NLRP3、caspase-1 和IL-1β抗體（Abcam）；蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）。RT-qPCR儀（Abbott；型號(hào)：Abbott m2000rt）；蛋白凝膠成像儀（Tanon；型號(hào)：Tanon 4200）。

3 主要方法

3.1 模型制備及分組 實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為對(duì)照（control）組、模型（model）組、DEX組、DEX+pcDNA3.1組和DEX+TXNIP 組，每組12 只。除對(duì)照組外，其余各組小鼠參考文獻(xiàn)［7］方法給予腹腔注射15 mg/kg LPS誘導(dǎo)腸道屏障損傷，對(duì)照組小鼠則注射等體積生理鹽水。在LPS 誘導(dǎo)腸道屏障損傷前30 min，DEX組小鼠腹腔注射30 μg/kg DEX［8］（濃度為30 mg/L），DEX+pcDNA3.1 組和DEX+TXNIP 組分別在DEX 組基礎(chǔ)上皮下注射5 nmol pcDNA3.1 和pcDNA3.1-TXNIP，對(duì)照組和模型組小鼠則皮下注射等體積生理鹽水。

3.2 樣品采集 建模6 h 后處死小鼠，經(jīng)心室采血，1 000×g離心10 min，取上清置于-20 ℃冰箱保存待用；收集回腸組織，部分置于-80 ℃冰箱保存，部分置于4%多聚甲醛中固定。

3.3 ELISA 檢測(cè)血清中IL-1β 和TNF-α 水平 采用小鼠IL-1β 和TNF-α ELISA 試劑盒檢測(cè)血清中IL-1β和TNF-α水平。

3.4 HE 染色觀(guān)察腸道組織形態(tài) 從4%多聚甲醛中取出腸道組織，經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后，切片（5 μm）。切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、蘇木精染色、0.1%鹽酸乙醇分化、伊紅復(fù)染、乙醇脫水、二甲苯透明后封片，光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察腸道組織形態(tài)。根據(jù)腸道組織絨毛破損，細(xì)胞脫落、壞死，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理嚴(yán)重程度進(jìn)行評(píng)分。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：0 分，無(wú)損傷；1 分，細(xì)胞出現(xiàn)局部萎縮、壞死，局部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；2分，細(xì)胞片狀萎縮、壞死，片狀炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜結(jié)構(gòu)完整；3分，細(xì)胞大量萎縮、壞死，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，黏膜結(jié)構(gòu)不完整；4分，細(xì)胞大部分壞死，腸黏膜結(jié)構(gòu)消失，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。

3.5 試劑盒檢測(cè)腸道組織中氧化應(yīng)激指標(biāo) 嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明，檢測(cè)腸道組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、ROS、SOD 和GSH 水平，其中MDA 用硫代巴比妥酸法，ROS 用熒光酶法，SOD 用ELISA 法，GSH 用微量酶標(biāo)法。

3.6 RT-qPCR 檢測(cè)腸道組織中TXNIP、NLRP3、caspase-1 和IL-1β 的mRNA 水平 取30 mg 腸道組織，經(jīng)RNA 提取試劑盒提取總RNA 后，采用cDNA 第一條鏈合成試劑盒合成cDNA，于PCR 儀中進(jìn)行TXNIP、NLRP3、caspase-1 和IL-1β 的mRNA 擴(kuò) 增。20 μL 反應(yīng)體系：2× SYBR Premix Ex TaqTMⅡProbe qPCR Mix 10 μL，ddH2O 8.0 μL，50 mg/L cDNA 1 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃5 min；94 ℃15 s，59 ℃30 s，40 個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法對(duì)TXNIP、NLRP3、caspase-1和IL-1β的mRNA進(jìn)行相對(duì)定量分析。各引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. Primer sequences for RT-qPCR

3.7 Western blot 檢測(cè)腸道組織中TXNIP、NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白水平 30 mg腸道組織經(jīng)手術(shù)剪剪碎，添加蛋白裂解液冰上研磨，研磨后冰上裂解20 min，4 ℃、16 000×g離心20 min，BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度，沸水煮10 min 使蛋白變性。每孔上樣30 μg，凝膠分離蛋白，PVDF 膜轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉溶液室溫封閉2 h；對(duì)應(yīng)加入Ⅰ抗（TXNIP、NLRP3、caspase-1、IL-1β 和β-actin 抗體），4 ℃孵育過(guò)夜；對(duì)應(yīng)加入Ⅱ抗，室溫孵育2 h。DAB 顯色試劑顯色，蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

GraphPad Prism 7.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 DEX對(duì)小鼠血清中IL-1β和TNF-α水平的影響

與對(duì)照組相比，模型組、DEX 組、DEX+pcDNA3.1 組和DEX+TXNIP 組小鼠血清中IL-1β 和TNF-α 水平均升高（P＜0.05）；與模型組相比，DEX 組和DEX+pcDNA3.1 組血清中IL-1β 和TNF-α 水平降低（P＜0.05）；分別與DEX 組和DEX+pcDNA3.1 組相比，DEX+TXNIP 組小鼠血清中IL-1β 和TNF-α 水平升高（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

Figure 1. The levels of IL-1β and TNF-α in the serum of mice. Mean±SD. n=12.#P＜0.05 vs control group；*P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs DEX group；△P＜0.05 vs DEX+pcDNA3.1 group.圖1 各組小鼠血清中IL-1β和TNF-α水平

2 DEX對(duì)腸道組織形態(tài)的影響

對(duì)照組腸上皮細(xì)胞完整，層次清晰，病理評(píng)分0分；模型組腸道組織完整性被破壞，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞脫落現(xiàn)象，炎癥浸潤(rùn)明顯，病理評(píng)分為3.76±0.19，與對(duì)照組相比評(píng)分升高（P＜0.05）；DEX 組和DEX+pcDNA3.1組腸道組織完整，但出現(xiàn)明顯的炎癥浸潤(rùn)現(xiàn)象，病理評(píng)分分別為1.96±0.23 和2.03±0.17，與模型組相比評(píng)分降低（P＜0.05）；DEX+TXNIP 組腸道完整性被破壞，出現(xiàn)細(xì)胞脫落現(xiàn)象，炎癥浸潤(rùn)明顯，病理評(píng)分為3.16±0.21，與DEX+pcDNA3.1 組相比評(píng)分升高（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

3 DEX 對(duì)小鼠腸道組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、ROS、SOD和GSH的影響

與對(duì)照組相比，模型組腸道組織中MDA 含量和ROS 水平升高（P＜0.05），而SOD 和GSH 活性降低（P＜0.05）；與模型組相比，DEX 組腸道組織中MDA含量和ROS 水平降低（P＜0.05），SOD 和GSH 活性升高（P＜0.05）；分別與DEX 組和DEX+pcDNA3.1 組相比，DEX+TXNIP 組腸道組織中MDA 含量升高（P＜0.05），SOD和GSH活性降低（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

Figure 3. MDA content，ROS level，SOD activity and GSH activity in mouse intestinal tissues of each group. Mean±SD. n=12.#P＜0.05 vs control group；*P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs DEX group；△P＜0.05 vs DEX+pcDNA3.1 group.圖3 各組小鼠腸道組織中MDA含量、ROS水平及SOD和GSH活性

4 DEX 對(duì)小鼠腸道組織中TXNIP、NLRP3、caspase-1和IL-1β mRNA和蛋白水平的影響

與對(duì)照組相比，模型組小鼠腸道組織中TXNIP、NLRP3、caspase-1 和IL-1β 的mRNA 和蛋白水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，DEX 組小鼠腸道組織中TXNIP、NLRP3、caspase-1 和IL-1β 的mRNA 和蛋白水平降低（P＜0.05）；分別與DEX 組和DEX+pcDNA3.1 組相比，DEX+TXNIP 組腸道組織中TXNIP、NLRP3、caspase-1 和IL-1β 的mRNA 和蛋白水平升高（P＜0.05），見(jiàn)圖4、5。

Figure 4. TXNIP，NLRP3，caspase-1 and IL-1β mRNA levels in mouse intestinal tissues of each group. Mean±SD. n=12.#P＜0.05 vs control group；*P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs DEX group；△P＜0.05 vs DEX+pcDNA3.1 group.圖4 各組腸道組織中TXNIP、NLRP3、caspase-1和IL-1β的mRNA水平

討 論

腸黏膜損傷的主要損傷機(jī)制包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡等，炎癥反應(yīng)是腸道屏障功能損傷的關(guān)鍵原因［9］，Zhang 等［10］研究顯示，在小鼠中腸道菌群異位會(huì)刺激腸黏膜炎癥，導(dǎo)致腸道機(jī)械屏障和黏膜免疫發(fā)生障礙，引起免疫抑制。因而，減少炎癥因子釋放對(duì)于緩解腸黏膜損傷具有重要作用。DEX作為新型α2腎上腺素受體激動(dòng)劑，已廣泛應(yīng)用于臨床，能完全溶于水，可快速被吸收，半衰期僅6 min，具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗焦慮、鎮(zhèn)痛和神經(jīng)保護(hù)等作用［11］；也可調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，能夠抑制免疫反應(yīng)，同時(shí)抑制炎癥因子TNF-α 和IL-1β 等的作用［12］。在本研究中，DEX 能夠降低血清中炎癥因子IL-1β和TNF-α水平，且能夠減輕LPS 誘導(dǎo)的腸道完整性破壞現(xiàn)象和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象，緩解LPS誘導(dǎo)的腸黏膜損傷。

Figure 5. TXNIP，NLRP3，caspase-1 and IL-1β protein levels in the intestinal tissues of mice in each group. Mean±SD. n=12.#P＜0.05 vs control group；*P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs DEX group；△P＜0.05 vs DEX+pcDNA3.1 group.圖5 各組小鼠腸道組織中TXNIP、NLRP3、caspase-1和IL-1β的蛋白水平

腸黏膜上皮細(xì)胞在正常腸道環(huán)境不發(fā)生炎癥反應(yīng)，呈現(xiàn)免疫耐受狀態(tài)，當(dāng)腸黏膜上皮細(xì)胞通過(guò)自身模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs）識(shí)別病原菌時(shí)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)揮機(jī)體防御作用［13］。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs）是PRRs之一，NLRP3 屬于NLRs 家族成員，在免疫細(xì)胞中廣泛表達(dá)，也在腸黏膜上皮細(xì)胞中表達(dá)，能夠識(shí)別大部分病原微生物，LPS 是其中之一［14］。受LPS 刺激后，NLRP3 炎癥小體異?；罨軌虼龠M(jìn)caspase-1 和IL-1β等效應(yīng)分子的產(chǎn)生，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)效能，參與機(jī)體炎癥和免疫過(guò)程［15］。本研究顯示，NLRP3 炎癥小體在LPS 誘導(dǎo)的腸黏膜損傷中處于激活狀態(tài)，DEX能夠降低NLRP3 mRNA 和蛋白的表達(dá)水平，進(jìn)而緩解疾病。炎癥損傷伴隨氧化損傷在LPS 誘導(dǎo)的腸黏膜損傷中發(fā)生，在本研究中檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA含量、ROS 水平及SOD 和GSH 活性，結(jié)果顯示，在LPS 誘導(dǎo)的腸黏膜損傷中MDA 含量、ROS 水平升高及SOD 和GSH 活性降低。而MDA 具有細(xì)胞毒性和誘變性，是氧化應(yīng)激標(biāo)志；ROS 表示氧化應(yīng)激情況；SOD 和GSH 作為保護(hù)因子，可在氧化應(yīng)激反應(yīng)下，清除機(jī)體自由基及過(guò)氧化物［16-17］，提示LPS 誘導(dǎo)的腸黏膜損傷中抗氧化應(yīng)激水平降低，氧化應(yīng)激水平升高，腸道組織發(fā)生氧化應(yīng)激損傷。DEX 能夠減輕自由基的產(chǎn)生，影響MDA 水平及過(guò)氧化氫酶活性，進(jìn)而降低機(jī)體中氧化應(yīng)激水平［18］。與He 等［19］研究結(jié)果類(lèi)似，本研究中DEX 能夠降低MDA 含量、ROS 水平，升高SOD和GSH活性，從而清除機(jī)體自由基，緩解腸道組織氧化應(yīng)激損傷。TXNIP 作為硫氧還蛋白的內(nèi)源性抑制蛋白，可通過(guò)與硫氧還蛋白活性部分相互結(jié)合引起細(xì)胞內(nèi)活性氧化物的堆積進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體損傷，還可激活NLRP3炎癥小體從而調(diào)控炎癥反應(yīng)［20］。本研究在DEX 干預(yù)基礎(chǔ)上過(guò)表達(dá)TXNIP 后，機(jī)體氧化應(yīng)激指標(biāo)、炎癥因子水平升高，推測(cè)DEX通過(guò)抑制TXNIP 水平進(jìn)而調(diào)控NLRP3 表達(dá)從而降低LPS 誘導(dǎo)的炎癥、氧化應(yīng)激損傷，實(shí)現(xiàn)對(duì)腸黏膜的保護(hù)作用。