山柰酚減輕慢性阻塞性肺疾病模型小鼠的炎癥反應*

劉彩虹， 楊紅輝， 盧俊娟

（中南大學湘雅三醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，湖南長沙 410013）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種以呼吸氣流受阻為主要特征的慢性氣道炎癥性疾病，并伴有各種炎癥細胞浸潤和氣道重塑，其已成為影響約6 億多人群的全球公共衛(wèi)生問題之一［1］。據流行病學調查顯示，40歲以上人群的COPD 發(fā)病率為8.2%，且隨著人口老齡化、吸煙、粉塵和感染等因素影響，其發(fā)病率和死亡率有上升趨勢，預計2030 年，COPD 將成為全球第三大死亡原因［2］。臨床常用藥糖皮質激素、β2受體激動劑、抗膽堿劑、平滑肌舒張劑和抗生素等藥物雖對緩解COPD 癥狀有益，但對疾病的預后無明顯改善［3］。因此，迫切需要尋找或開發(fā)治療COPD 新的替代藥物。

山柰酚（kaempferol，Kae）是從姜科植物山柰和小檗科植物窩兒七的根莖以及豆科植物槐樹的干燥種子中提取的一種黃酮類化合物，其具有抗氧化、抗腫瘤和抗炎等廣泛的藥理學活性［4-5］。Molitorisova等［6］報道，山柰酚能降低卵清蛋白誘導的過敏性氣道炎癥模型豚鼠支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BLAF）中促炎因子白細胞介素5（interleukin-5，IL-5）、IL-13、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）及嗜酸性粒細胞數量，并改善哮喘癥狀。但是，山柰酚在COPD 中發(fā)揮的作用及機制尚不清楚。因此，本研究通過構建COPD 小鼠模型，檢測山柰酚對COPD 模型小鼠肺組織的組織形態(tài)改變、BLAF 中促炎性細胞因子含量、肺組織中氧化應激標志物水平的影響，并探討其機制。

材 料 和 方 法

1 實驗試劑

山柰酚（純度≥98.0%）購自Sigma；小鼠單核細胞 趨 化 蛋 白1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-1β 和IL-5 ELISA 試劑盒均購自江蘇凱基生物技術有限公司；谷胱甘肽（glutataione，GSH）、一氧化氮（nitric oxide，NO）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和 超 氧 化 物 歧 化 酶（superoxide dismutase，SOD）ELISA 檢測試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；蘇木精和伊紅（HE）染色試劑盒購自武漢百皓天生物科技有限公司；BCA 蛋白含量檢測試劑盒、ECL 化學發(fā)光試劑盒、GAPDH 抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（H+L）和Alexa Fluor 488 標記的山羊抗兔IgG（H+L）均購自上海碧云天生物技術有限公司；p-NF-κB p65（Ser536）抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司。

2 方法

2.1 COPD 小鼠模型建立和實驗方案 24 只6 周齡

SPF 級雄性C57BL/6 小鼠（18～20 g）購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證編號為SCXK（湘）2019-0004，飼養(yǎng)于中南大學湘雅二醫(yī)院實驗動物中心，在實驗前，適應性飼養(yǎng)1 周。用隨機數表法將小鼠隨機分為4組（每組6只）：對照（control）組、模型組（COPD 組）和低、高劑量山柰酚治療組（COPD+25 mg/kg Kae 組和COPD+100 mg/kg Kae 組）。對照組小鼠在正常條件下飼養(yǎng)。模型組小鼠暴露于香煙煙霧暴露環(huán)境裝置系統(tǒng)（自制煙霧暴露箱100 cm×80 cm×30 cm，一側開出煙口，另一側開小孔放置香煙，頂部設置5 cm×30 cm 觀察窗）中，COPD 小鼠造模方法根據文獻［7］所述：10支/日，箱中煙霧濃度控制在7%左右，暴露時間持續(xù)40 min，每間隔5 min 敲打煙箱壁1 次以避免小鼠扎堆造成吸煙量不均勻，持續(xù)12 周。低和高劑量山柰酚治療組在煙霧暴露前2 h分別灌胃25和100 mg/kg山柰酚。

2.2 BALF 中IL-1β、IL-5、MCP-1 和TNF-α 含量測定 第13 周，麻醉小鼠，按照文獻［7］方法，用導管插入右肺中葉，用0.8 mL 的37 ℃PBS 灌洗3 次，每次回收量約0.5～0.6 mL，合并3 次回收的灌洗液以1 000×g離 心5 min，收集上清液。取BALF 的上清液，根據ELISA 試劑盒說明書步驟檢測BALF 中IL-1β、IL-5、MCP-1 和TNF-α 的水平。待底物溶液反應終止后，使用SynergyTMH4 Hybrid 型多功能酶標儀（BioTek）測波長450 nm 處的吸光度（A）值。并根據標準曲線計算BALF 中IL-1β、IL-5、MCP-1 和TNF-α的含量。

2.3 組織病理學分析 收集BALF 后，解剖并收集左肺組織，肺組織用石蠟包埋。取肺石蠟組織制作5 μm 厚的石蠟切片，根據HE 染色試劑盒說明書步驟行HE 染色。每個樣品切片任取5 個視野，根據文獻［8］描述方法，對間質炎癥、肺泡壁增厚、支氣管周炎癥和間質水腫影響的區(qū)域，進行肺組織損傷評分。

2.4 肺組織中GSH、NO、MDA和SOD水平測定 取肺組織在冰上勻漿，用BCA 蛋白含量檢測試劑盒測定勻漿液中的蛋白濃度，然后根據試劑盒說明書步驟檢測勻漿液中GSH、NO、MDA 和SOD 的含量。然后根據勻漿液中的蛋白濃度，將勻漿液中GSH、NO、MDA 和SOD 的含量標準化為肺組織中GSH、NO、MDA和SOD的水平。

2.5 免疫熒光 取肺組織，脫蠟至水后，在0.2%Triton X-100 中透化，用10%山羊血清封閉30 min，然后用1∶100稀釋的抗p-NF-κB p65抗體4 ℃孵育過夜；PBS洗滌后，用1∶100稀釋的Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔IgG（H+L）避光室溫溫育1 h，用DAPI 染核15 min，熒光顯微鏡下觀察。

2.6 Western blot 取肺組織，用RIPA 裂解液裂解并提取蛋白，用蛋白含量檢測試劑盒對蛋白定量。蛋白經SDS-PAGE 后，將蛋白電轉至PVDF 膜，PVDF膜經封閉后，室溫分別孵育抗p-NF-κB p65 抗體（1∶1 000稀釋）1.5 h，TBST洗膜3次后，室溫孵育辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（H+L）（1∶2 000 稀釋）45 min，TBST 洗膜3 次后，利用ECL 化學發(fā)光試劑盒對目的條帶顯影，以GAPDH 為內參照，采用Image-Pro Plus軟件測量目的條帶的光密度。

3 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 6 軟件將實驗中所得的數據進行統(tǒng)計分析。數據用均數±標準差（mean±SD）表示，多組之間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 山柰酚對COPD小鼠肺組織形態(tài)學的影響

HE 染色顯示，對照組小鼠肺泡結構正常，肺泡間隔規(guī)則有序；COPD 模型組小鼠肺泡壁增厚，肺泡間隔不規(guī)則甚至不可辨認，在病變的肺泡周圍可見大量炎癥細胞浸潤和出血點，支氣管腔壁增厚，在病變支氣管周可見大量炎癥細胞浸潤且支氣管腔內黏液填充或閉塞；低劑量山柰酚治療組小鼠肺組織改變相對模型組有所改善，肺組織形態(tài)學主要表現(xiàn)為：部分肺泡壁增厚和肺泡間隔不規(guī)則，病變的肺泡周圍可見炎癥細胞浸潤和小量出血點，在病變支氣管周可見炎癥細胞浸潤且支氣管腔內黏液分泌較多；高劑量山柰酚治療組絕大多數肺泡結構趨向正常，肺泡間隔趨向規(guī)則，在少量肺泡壁增厚的肺間質可見少量炎癥細胞浸潤，見圖1A。肺組織損傷評分結果顯示，與對照組比較，COPD 模型組小鼠肺組織損傷評分顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，低和高劑量山柰酚治療組小鼠肺組織損傷評分均顯著降低，且以高劑量山柰酚治療組最為顯著（P＜0.01），見圖1B。

Figure 1. Effect of kaempferol（Kae）on histomorphological changes of lung tissues in COPD mice（HE staining，scale bar=50 μm）.Mean±SD. n=6.##P＜0.01 vs control group；**P＜0.01 vs COPD group.圖1 山柰酚對COPD小鼠肺組織形態(tài)學的影響

2 山柰酚對COPD 小鼠BLAF 中促炎癥因子水平的影響

ELISA 結果顯示，與對照組比較，COPD 模型組小鼠BALF 中促炎癥因子IL-1β、IL-5、MCP-1 和TNFα 水平均顯著升高（P＜0.01）；與COPD 模型組比較，低和高劑量山柰酚治療組小鼠BALF 中上述促炎癥因子水平均顯著降低（P＜0.05），且以高劑量山柰酚治療組降低最為顯著（P＜0.01），見圖2。

Figure 2. Effect of kaempferol（Kae）on the levels of pro-inflammatory factors in BLAF of COPD mice. IL-1β（A），IL-5（B），MCP-1（C）and TNF-α（D）levels in BLAF of mice in each group. Mean±SD. n=6.##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs COPD group.圖2 山柰酚對COPD小鼠BLAF中促炎癥因子水平的影響

3 山柰酚對COPD 小鼠肺組織中氧化應激標志物水平的影響

與對照組比較，COPD 模型組小鼠肺組織中MDA 和NO 水平均顯著升高（P＜0.01），SOD 和GSH水平顯著降低（P＜0.01）；與COPD 模型組比較，低和高劑量山柰酚治療組小鼠肺組織中MDA 和NO 水平均顯著降低（P＜0.01），SOD 和GSH 水平則顯著升高（P＜0.01），且以高劑量山柰酚治療組變化最為顯著（P＜0.01），見圖3。

Figure 3. Effect of kaempferol（Kae）on the levels of oxidative stress markers in lung tissue of COPD mice. MDA（A），SOD（B），GSH（C）and NO（D）levels in lung tissues of mice in each group. Mean±SD. n=6.##P＜0.01 vs control group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs COPD group.圖3 山柰酚對COPD小鼠肺組織中氧化應激標志物水平的影響

4 山柰酚對COPD小鼠肺組織NF-κB活化的影響

免疫熒光結果顯示，對照組小鼠肺組織中可見極少量p-NF-κB p65 陽性細胞；COPD 模型組小鼠肺組織中可見大量p-NF-κB p65陽性細胞；低和高劑量山柰酚治療組小鼠肺組織中p-NF-κB p65 陽性細胞數較COPD 模型組有所降低，以高劑量山柰酚治療組尤為明顯，見圖4A。Western blot 結果顯示，與對照組比較，COPD 模型組小鼠肺組織中p-NF-κB p65蛋白水平顯著增加（P＜0.01）；與COPD 模型組比較，低和高劑量山柰酚治療組小鼠肺組織中p-NF-κB p65 蛋白水平均顯著降低（P＜0.01），且以高劑量山柰酚治療組最為顯著（P＜0.01），見圖4B。

Figure 4. Effect of kaempferol（Kae）on the activation of NF-κB in lung tissue of COPD mice. A：representative images of immunofluorescence of p-NF-κB p65（scale bar=100 μm）；B：Western blot assay of p-NF-κB p65 protein. Mean±SD. n=6.##P＜0.01 vs control group；**P＜0.01 vs COPD group.圖4 山柰酚對COPD小鼠肺組織NF-κB活化的影響

討 論

COPD 的主要危險因素為長期吸煙。香煙煙霧中含有如一氧化碳、尼古丁、苯酚和醛等大量有害物質，這些物質可導致氣道以及肺實質中炎癥因子生成以及炎癥細胞浸潤，從而引起炎癥損傷以及氣道重塑和小氣道阻塞，造成肺功能障礙［9-10］。抑制氣道和肺實質中炎癥反應能減輕COPD 癥狀和氣道重塑［11］。山柰酚已被證明在哮喘、急性氣管炎和急性肺損傷等多種模型中具有抑制氣道和肺實質炎癥反應 以 及 抑 制 黏 液 蛋 白 合 成 的 作 用［6，12-16］，而 其 對COPD 模型小鼠的影響并不清楚。本研究結果顯示，山柰酚不僅能改善香煙煙霧誘導的COPD 模型小鼠肺組織形態(tài)表現(xiàn)，還能顯著降低COPD 小鼠BALF 中促炎性因子MCP-1、TNF-α、IL-1β 和IL-5 水平。NFκB 是最重要的炎癥信號之一，文獻［17-18］證實，NF-κB途徑的激活與COPD 的發(fā)生和發(fā)展密切相關，長期香煙煙霧暴露能使肺組織中NF-κB 激活，而NF-κB活性過度激活能進一步促進肺組織中炎癥級聯(lián)反應和氣道重塑，進而加重COPD 癥狀。且已有報道［14-16］顯示，山柰酚可通過抑制NF-κB 活性來降低LPS 和H9N2 豬流感病毒誘導的急性肺損傷。本研究結果也顯示，經山柰酚治療后，COPD 小鼠肺組織中p-NFκB p65蛋白水平明顯降低，提示山柰酚能降低COPD小鼠肺組織中NF-κB信號活化水平。

氧化應激不僅是COPD 發(fā)病機制中的一個主要的誘發(fā)因素，也是促進COPD 進展的重要驅動因素之一［19］。香煙煙霧中的外源性氧化劑以及吸煙導致的肺部炎癥細胞和結構細胞生成的內源性活性氧，可以破壞機體的抗氧化劑/氧化劑平衡，導致COPD患者的肺部氧化應激增加［19-20］。氧化應激能放大肺部和氣道的慢性炎癥，并能直接損害肺組織，誘導肺氣腫形成，從而導致氣流阻塞［9，20］。研究表明［9，20-21］，抑制氧化應激反應能減輕COPD 癥狀并能阻止氣道重塑。本研究結果顯示，山柰酚能降低COPD 模型小鼠肺組織中MDA 和NO 水平，并能升高SOD 和GSH 水平，提示山柰酚能在一定程度上修復COPD模型小鼠肺組織中抗氧化劑/氧化劑失衡，降低肺組織中氧化應激反應。

綜上所述，山柰酚對小鼠COPD 能發(fā)揮治療作用，且這一作用可能與其抗炎、抗氧化和抑制NF-κB信號通路相關。