去鐵胺通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)促進(jìn)小鼠深部組織壓力性損傷創(chuàng)面愈合*

張子銳， 張亞萍， 郭景琳， 山 慧， 張 菊△

（1青島大學(xué)護(hù)理學(xué)院，山東青島 260001；2山東大學(xué)第二附院醫(yī)院，山東濟(jì)南 250000）

隨著社會(huì)發(fā)展及人口老齡化現(xiàn)象日益凸顯，慢性傷口已經(jīng)成為危害公共健康的主要疾病，包括壓力性損傷、下肢動(dòng)靜脈潰瘍和糖尿病足潰瘍等［1］，其中，壓力性損傷又稱壓瘡、褥瘡，其醫(yī)療成本消耗在國內(nèi)位居第3 位。深部組織壓力性損傷（deep tissue pressure injury，DTPI）是一類嚴(yán)重的壓力性損傷，因難愈合、進(jìn)展快和易復(fù)發(fā)成為防治的重點(diǎn)和難點(diǎn)［2-3］，是臨床醫(yī)護(hù)工作中亟需解決的難題。

壓力性損傷是由壓力因素為主導(dǎo)驅(qū)動(dòng)的局部微循環(huán)紊亂和重復(fù)缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷。I/R 損傷引起局部組織血管內(nèi)皮損傷、炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激，產(chǎn)生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS）［4-5］。在諸多I/R 損傷性疾病中存在鐵超載［6-7］。鐵是一種對(duì)細(xì)胞和生物體至關(guān)重要的基本微量元素，具有獨(dú)特的電化學(xué)性質(zhì)，過量的游離鐵會(huì)引起氧化應(yīng)激，與多種代謝性疾病、腫瘤和慢性傷口的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)［8］。去鐵胺（deferoxamine，DFO）是美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)的一種小分子鐵絡(luò)合劑，對(duì)游離鐵離子具有高度的穩(wěn)定性、特異性和選擇性［9］。研究顯示，局部使用DFO 可有效地抑制ROS的產(chǎn)生，具有抗氧化作用［10］。此外，DFO 可誘導(dǎo)慢性低氧環(huán)境中低氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）的穩(wěn)定表達(dá)，并刺激新生毛細(xì)血管再生，促進(jìn)傷口愈合［11］。

基于此，本研究擬通過構(gòu)建小鼠DTPI 模型，探討DTPI 中鐵離子的含量，以及DFO 的治療效果和作用機(jī)制，為治療慢性傷口提供參考資料。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性C57BL/6 小鼠，體重（20±2）g，6～8 周齡，購自華富康生物科技有限公司（北京）。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（QYFY WZLL 25887），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（魯）2019-0003。人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（human immortalized keratinocytes）HaCaT 由協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物所惠贈(zèng)。

2 主要試劑

DFO 購 于Sigma-Aldrich；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒購于美侖生物科技（大連）有限公司；ROS 檢測(cè)試劑盒（WLA070a）購自萬類生物科技（沈陽）有限公司；蘇木精購自索萊寶科技（北京）有限公司；曙紅Y（醇溶性）購自生工生物工程（上海）有限公司；普魯士藍(lán)染色試劑盒購于索萊寶科技（北京）有限公司；Masson 三色染色試劑盒購于雷根生物技術(shù)（北京）有限公司；Taq PCR Master Mix 試劑盒購于百泰克生物科技（北京）有限公司；鼠抗HIF-1α 抗體、鼠抗血管內(nèi)皮生長因子α（vascular endothelial growth factor-α，VEGF-α）抗體、鼠抗基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）抗體和鼠抗腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抗體均購于萬類生物科技（沈陽）有限公司；山羊抗鼠IgG Ⅱ抗（Proteintech）。

3 主要儀器

BX53 正置顯微鏡購自O(shè)lympus；熒光定量PCR儀購自BIONEER；ELx 800 全自動(dòng)酶標(biāo)儀購自BioTek。

4 主要方法

4.1 CCK-8 法檢測(cè)HaCaT 細(xì)胞活力 將培養(yǎng)的處于對(duì)數(shù)生長期的HaCaT 細(xì)胞株接種于96 孔板中（每孔5×103個(gè)），每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞貼壁24 h后，每孔加入100 μL 含不同藥物的培養(yǎng)液，分別于24 h，48 h和72 h 棄去含藥培養(yǎng)液，每孔加入含有10% CCK-8的DMEM 培養(yǎng)液，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱避光孵育30 min，置于酶標(biāo)儀450 nm處讀取吸度光（A）值。

4.2 HaCaT 細(xì)胞內(nèi)ROS 的含量 將HaCaT 細(xì)胞以每孔6×104個(gè)的密度接種于96 孔板24 h。分別加入不同濃度（100 μmol/L、500 μmol/L 和1 mmol/L）DFO預(yù)處理1 h 或2 h，然后加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS 清洗3 次，滴加ROS 探針反應(yīng)液，37 ℃孵育30 min，PBS 漂洗，封片，最后，使用熒光顯微鏡（BX53，OLUMPUS）觀察熒光，最大激發(fā)波長為485 nm，發(fā)射光譜為525 nm。

4.3 DTPI 模型的構(gòu)建與分組 選用C57BL/6 雄性小鼠，根據(jù)文獻(xiàn)［12-14］，去除其背部和腹部毛發(fā)，在坐骨棘突的背部和腹部兩側(cè)各使用磁鐵（直徑12 mm，厚度5 mm，質(zhì)量2.4 g，表面磁通密度1 000 Gs）施加壓力12 h，之后將磁鐵卸下，緩沖12 h。在施加壓力期間，小鼠進(jìn)食正常，行動(dòng)自由。將小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)（sham）組、模型（model）組、DFO 低濃度（2 g/L）組和DFO高濃度（20 g/L）組，每組6只小鼠。DTPI模型建立完成后第1、3、5、7、9、11 和13 天分別皮下注射給藥，每天1次。

4.4 電感耦合等離子體質(zhì)譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）檢測(cè)DTPI 肌肉組織中鐵含量 頸椎脫臼處死小鼠后，取20 mg小鼠肌肉組織至25 mL 消解容器中，加入8 mL 王水和2 mL H2O2水，使用石墨加熱板120～200 ℃消解60 min至樣品完全消解，冷卻至室溫，取出，置于電熱消解器中去除多余氮氧化合物，冷卻后過濾定容至10 mL 量瓶中。使用ICP-MS檢測(cè)勻漿組織中鐵離子的含量。4.5 普魯士藍(lán)染色 分別在第1 和7 天取材，將皮膚肌肉組織標(biāo)本置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h。梯度乙醇脫水：將沖洗后的標(biāo)本分別置于75%、85%、95%及100%乙醇中24 h。使用純二甲苯透明，總時(shí)間不超過4 h。過濾包埋：棄二甲苯，石蠟包埋，組織切片機(jī)切片，厚度為5 μm，使用普魯士藍(lán)染色后將切片置于37 ℃蒸餾水浸泡5 min，洗去表面結(jié)晶物質(zhì)（白色沉淀物）后行HE 染色。最后封片，鏡檢。400倍顯微鏡下觀察，每張切片用隨機(jī)數(shù)字表法取5個(gè)不重疊視野，用Image Pro Plus 6.0軟件計(jì)算其平均吸光度值，進(jìn)行分析。

4.6 創(chuàng)面收縮率 在損傷后的0～14 d中，相同條件下使用數(shù)碼相機(jī)拍攝局部傷口，將第3 天傷口面積設(shè)置為1（設(shè)為參考點(diǎn)），記錄不同時(shí)點(diǎn)的傷口面積，使用Image-Pro Plus 6.0 軟件按下列公式計(jì)算傷口收縮率。傷口收縮率（%）=（第3 天傷口面積-特定時(shí)點(diǎn)傷口面積）/第3 天傷口面積×100%。若傷口收縮率為負(fù)值，表明傷口面積增加；若傷口收縮率為正值，表明傷口面積減小。

4.7 HE 染色和Masson 染色 取創(chuàng)面組織（1.5 cm×1.5 cm），4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯使其透明，石蠟包埋組織，切片厚度為5 μm，染色，脫水，透明，封片后，顯微鏡觀察HE 染色和Masson染色組織切片。每張切片用隨機(jī)數(shù)字表法取5個(gè)不重疊視野，用Image-Pro Plus 6.0 軟件計(jì)算其平均吸光度值，進(jìn)行分析。

4.8 免疫組化染色 取創(chuàng)面組織于4%多聚甲醛中固定，于70%乙醇中梯度脫水，石蠟包埋，使用石蠟塊切片機(jī)（RM2235）切成5 μm 厚切片。用CD31 抗體染色（稀釋1∶500）進(jìn)行免疫組化分析。最后，使用DP73顯微攝影成像系統(tǒng)（OLUMPUS）采集圖像數(shù)據(jù)。4.9 Western blot 按照標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室規(guī)程提取總蛋白。行8%～12%SDS-PAGE分離蛋白，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。Ⅰ抗分別為抗VEGF-α（稀釋比1∶100）、HIF-1α（稀釋比1∶100）、SDF-1（稀釋比1∶500）、TNF-α（稀釋比1∶500）和β-actin（稀釋比1∶100）抗體，Ⅱ抗為山羊抗兔IgG-HRP（稀釋比1∶5 000），使用Western blot 檢測(cè)軟件（Gel-Pro Analyzer）檢測(cè)蛋白表達(dá)。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較采用單因素方差分析和Tukey 檢驗(yàn)，使用GraphPad Prism 5.0 軟件對(duì)平均值進(jìn)行比較。重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 DTPI肌肉組織中鐵離子含量增高

采用ICP-MS檢測(cè)DTPI肌肉組織中鐵離子含量，ICP-MS測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)品和測(cè)試樣品的質(zhì)譜圖及結(jié)果顯示，正常組鐵離子含量為（41.57±4.48）mg/L。在傷口形成第1天時(shí)，模型組和DFO（20 g/L）組鐵離子含量分別為（63.21±4.48）mg/L和（48.83±2.89）mg/L；第7天時(shí)，模型組和DFO（20 g/L）組鐵離子含量分別為（88.91±2.81）mg/L和（52.20±3.61）mg/L，模型組肌肉組織中鐵離子含量較正常組顯著升高（P＜0.01），DFO（20 g/L）組鐵離子含量相比模型組顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），見圖1A、表1。普魯士藍(lán)染色結(jié)果顯示，藍(lán)色區(qū)域集中于模型組的肌肉區(qū)，真皮和表皮內(nèi)少見，在第1 天時(shí)，模型組與DFO（20 g/L）組均無明顯鐵沉積現(xiàn)象；第7 天時(shí)，模型組出現(xiàn)了明顯的鐵沉積現(xiàn)象；相反，DFO（20 g/L）組中鐵沉積數(shù)量較模型組有顯著減少，見圖1B。

表1 小鼠DTPI肌肉組織鐵含量測(cè)定Table 1. Determination of iron content in mouse muscle tissues（mg/L. Mean±SD. n=6）

Figure 1. Mass spectra of standard samples（upper left in A）and test samples（lower left in A），the standard curve（right in A），and local iron deposition（B）in muscle tissues of C57BL/6 mice on day 1 and day 7（Prussian blue staining，scale bar=500 or 100 μm）. Iron ion"accumulation"phenomenon was obviously observed in model group.圖1 標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)樣品的質(zhì)譜圖、標(biāo)準(zhǔn)曲線及普魯士藍(lán)染色評(píng)估局部鐵沉積

2 DFO對(duì)HaCaT細(xì)胞無顯著毒性

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度的DFO對(duì)HaCaT細(xì)胞活力均無顯著影響，細(xì)胞狀態(tài)良好，見表2。

表2 CCK-8法檢測(cè)不同濃度DFO對(duì)HaCaT細(xì)胞活力的影響Table 2. The effects of different concentrations of DFO on viability of HaCaT cells were detected by CCK-8 assay（Mean±SD. n=6）

3 DFO抑制HaCaT細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生

紅色的熒光強(qiáng)度代表的是HaCaT 細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。結(jié)果表明DFO 可顯著抑制HaCaT 細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，紅色熒光強(qiáng)度的減弱證明了這一點(diǎn)，見圖2A。不同濃度DFO 預(yù)處理1 h 和2 h 后，結(jié)果顯示相比于模型組，DFO 對(duì)HaCaT 細(xì)胞內(nèi)ROS 的生成具有顯著抑制作用（P＜0.01），且具有濃度依賴性，其中1 000 μmol/L的DFO抑制效果最好，見圖2B。

Figure 2. Inhibitory effect of DFO on ROS production in HaCaT cells. Red fluorescence intensity represents the ROS level in HaCaT cells. Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs control group.圖2 DFO抑制HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生

4 DFO促進(jìn)DTPI傷口愈合

DFO 組創(chuàng)面愈合速度與模型組相比顯著加快。在創(chuàng)面早期，DFO 組的創(chuàng)面初始面積小于對(duì)照組；第7 天，模型組的創(chuàng)面面積為（106±1.25）%，DFO（2 g/L）組和DFO（20 g/L）組的創(chuàng)面面積分別為（69.0±2.45）%和（77.3±2.62）%，DFO組較模型組創(chuàng)面面積顯著降低（P＜0.05）；第14 天，模型組愈合面積為（73.0±1.25）%，DFO（2 g/L）組和DFO（20 g/L）組的創(chuàng)面面積分別為（45.0±1.60）%和（39.0±1.20）%。結(jié)果表明，DFO 組在14 d 內(nèi)傷口愈合率達(dá)到約60%以上，然而，模型組在14 d 內(nèi)未完全愈合，傷口愈合率為（28.0±1.25）%。見圖3。

Figure 3. Wound healing after DTPI in C57BL/6 mice. The representative pictures of the three groups record the healing process at different time points. Each image is a square with an actual distance of 1.5 cm. Wound healing results were presented as the percentages of initial area. Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs model group.圖3 C57BL/6小鼠DTPI后的傷口愈合情況

組織學(xué)結(jié)果顯示，第7 天，DFO 組中真皮層內(nèi)的炎癥細(xì)胞較模型組相比顯著減少，可見新血管生成，而模型組未見明顯的新生血管；第14 天，DFO（2 g/L）組和DFO（20 g/L）組創(chuàng)面表皮變薄，真皮增厚，有少量的毛囊，膠原沉積明顯及相對(duì)規(guī)則的細(xì)胞排列，與正常皮膚結(jié)構(gòu)相似，不同濃度藥物組之間沒有顯著差異；模型組表皮增厚，真皮變薄，皮膚附屬器再生不良，細(xì)胞排列不規(guī)則、膠原沉積不明顯，見圖4。

Figure 4. Histomorphological assessment was performed on days 7 and 14 after DTPI in the mice. A：images of HE staining on days 7 and 14（scale bar=500 or 100 μm）；B：on days 7 and 14，amount of angiogenesis，degree of epithelialization，inflammatory cell infiltration and skin appendages were assessed；C：images of Masson′s trichrome staining on days 7 and 14，and quantitative analysis of collagen deposition（scale bar=500 μm）. Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs model group.圖4 DTPI后第7和14天時(shí)小鼠的組織形態(tài)學(xué)評(píng)估

免疫組化染色結(jié)果顯示，第7 天，DFO（2 g/L）組和DFO（20 g/L）組的CD31 陽性表達(dá)率為（6.3±1.24）%和（8.0±0.81）%，模型組的CD31陽性表達(dá)率為（2.7±0.47）%（P＜0.01）；第14 天時(shí)，DFO（2 g/L）組、DFO（20 g/L）組與模型組的CD31 陽性表達(dá)率分別為（9.0±0.84）%、（10.0±0.82）%和（4.3±0.47）%（P＜0.01），藥物組之間沒有顯著差異，見圖5。

Figure 5. CD31 expression level was assessed by immunohistochemical staining on day 7 and 14 after DTPI. The scale bar=500 μm. Mean±SD. n=6.**P＜0.01 vs model group.圖5 免疫組化染色評(píng)估DTPI后第7和14天的CD31表達(dá)水平

5 傷口愈合相關(guān)蛋白的表達(dá)分析

Western blot 結(jié)果顯示DFO 可調(diào)節(jié)愈合組織中相關(guān)蛋白（HIF-1α、VEGF-α、SDF-1 和TNF-α）的表達(dá)。第14 天，DFO 組肌肉組織中HIF-1α 和SDF-1 蛋白表達(dá)水平顯著高于模型組（P＜0.01），其中20 g/L DFO 組表達(dá)最高，DFO（20 g/L）組較DFO（2 g/L）組表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；此外，DFO（20 g/L）組中TNF-α 蛋白的表達(dá)水平顯著低于模型組和DFO（2 g/L）組（P＜0.01）；DFO 組中VEGF-α 蛋白水平表達(dá)較模型組具有顯著升高（P＜0.01），見圖6。

Figure 6. Relative protein expression of HIF-1α，TNF-α，VEGF-α and SDF-1 after DTPI was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.**P＜0.01 vs model group.圖6 小鼠DTPI后創(chuàng)面組織中HIF-1α、TNF-α、VEGF-α和SDF-1的蛋白表達(dá)

討 論

本研究顯示小鼠DTPI 肌肉組織中鐵離子沉積異常，而局部應(yīng)用DFO 可有效地加速傷口愈合并提高愈合質(zhì)量。DTPI 主要由I/R 損傷引起局部組織內(nèi)皮血管損傷，紅細(xì)胞內(nèi)血紅蛋白鐵離子“障室封閉”系統(tǒng)瓦解，可螯合狀態(tài)的鐵離子水平升高［15-16］?；钚澡F離子通過驅(qū)動(dòng)Fenton 型Haber-Weiss 化學(xué)反應(yīng)誘導(dǎo)泛化炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激產(chǎn)生大量的ROS，加重氧化應(yīng)激［17］。

鐵貯存于肌肉組織中，檢測(cè)DTPI 肌肉組織的鐵貯備水平，可直接反映DTPI 后有無鐵蓄積。本研究結(jié)果顯示DTPI 肌肉組織中鐵離子含量增高，促使傷口呈現(xiàn)一種過度的氧化應(yīng)激反應(yīng)，刺激細(xì)胞內(nèi)不斷生成ROS，且HIF-1α 的表達(dá)隨著ROS 的增加而降低。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也證實(shí)DFO 能下調(diào)HaCaT 中ROS的含量，通過減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)組織愈合。

創(chuàng)傷愈合是多種細(xì)胞、細(xì)胞因子和生長因子相互作用的過程，其改變會(huì)導(dǎo)致愈合過程的延遲［18-19］。缺氧可誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，刺激成纖維細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和遷移，局部缺氧可穩(wěn)定HIF-1α，促進(jìn)創(chuàng)面愈合［20］。DFO在缺氧條件下能誘導(dǎo)HIF-1α的積累，提高老年小鼠缺血皮瓣的存活，加速新生血管的形成。同樣，Bonham 等［21］也證實(shí)了局部注射DFO 能夠促進(jìn)老年壓力潰瘍的愈合。本研究結(jié)果表明，DFO 組傷口愈合率較模型組顯著增加，至第14天創(chuàng)面幾乎完全愈合。通過分子生物學(xué)方法分析顯示，DFO 上調(diào)HIF-1α 和VEGF-α 蛋白的表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道的DFO 可穩(wěn)定HIF-1α 表達(dá)是一致的，VEGF-α是其調(diào)控細(xì)胞因子之一［21］。另外，HIF-1α 也能激活SDF-1 的表達(dá)［22］。SDF-1 可激活/調(diào)節(jié)特定整合素分子來調(diào)節(jié)骨髓造血祖細(xì)胞的黏附/趨化能力，動(dòng)員和招募血管前體細(xì)胞的歸巢信號(hào)，在血管生成中發(fā)揮重要作用［23］。同時(shí)，本研究顯示，DFO 治療組的TNF-α 蛋白表達(dá)與模型組相比顯著下降。TNF-α 被認(rèn)為是傷口愈合過程中的促炎癥細(xì)胞因子，參與啟動(dòng)早期傷口愈合反應(yīng)［24-25］，提示DFO 可能通過下調(diào)TNF-α 表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)，在組織修復(fù)中發(fā)揮積極作用。此外，經(jīng)過DFO 治療后，HE 染色和Masson 染色結(jié)果表明小鼠傷口中膠原沉積均勻且致密。這些結(jié)果說明DFO 能有效促進(jìn)小鼠DTPI 創(chuàng)面愈合，可能與HIF-1α激活的信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，小鼠DTPI 肌肉組織中鐵離子異常分布，DFO 可抑制鐵離子引起的氧化應(yīng)激損傷，通過調(diào)節(jié)HIF-1α/VEGF信號(hào)通路參與傷口愈合。