重組人腦鈉肽對高糖誘導下內皮細胞的作用*

金啟輝， 夏江柳， 魯聞燕， 有傳剛， 韓春茂△

（浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院1老年病科，2燒傷與創(chuàng)面修復科，浙江杭州 310009）

高血糖引起的血管內皮細胞受損是糖尿病血管病變主要發(fā)病機制之一。內皮細胞凋亡是內皮細胞功能障礙的重要表現(xiàn)形式，同時也是動脈粥樣硬化形成的始動因素［1］。自噬對于維持細胞穩(wěn)態(tài)具有重要生理意義，通常情況下細胞在遭受損傷時，通過自噬，降解受損的蛋白質和（或）細胞器，促進細胞存活［2］。糖尿病導致血管內皮細胞損傷以及動脈粥樣硬化形成涉及分子機制眾多，治療困難，使得研究糖尿病機體內環(huán)境的變化對血管病變的作用顯得更有意義。有臨床研究發(fā)現(xiàn)，腦鈉肽（brain natriuretic peptide，BNP）與糖尿病密切相關，BNP 在糖尿病患者中明顯升高，甚至在糖尿病前期就有升高［3］。Pauriah 等［4］的研究發(fā)現(xiàn)BNP 與血管內皮舒張功能密切相關，是內皮功能的獨立預測因子。BNP 是心肌細胞合成的具有生物學活性的激素。以往研究均把BNP 與心力衰竭聯(lián)系在一起，臨床也把BNP 靜脈輸注改善心力衰竭寫進指南。BNP 對心肌細胞保護作用已得到廣泛研究和認可，實驗證明BNP 預處理能保護心肌細胞缺血再灌注損傷［5］，能減少缺氧心肌細胞凋亡［6］，內源性或外源性BNP 能通過與特異性利尿鈉肽受體A（natriuretic peptide receptor-A，NPRA）結合，該受體與鳥苷酸環(huán)化酶偶聯(lián)，引起細胞內cGMP 濃度升高，作為第二信使活化cGMP 依賴的蛋白激酶，發(fā)揮心肌保護作用。筆者前期臨床研究也發(fā)現(xiàn)，糖尿病合并下肢血管病變患者的BNP 水平明顯升高［7］。但BNP 對高糖環(huán)境下血管內皮細胞的效應及作用機制究竟如何，糖尿病患者代償性升高的BNP 對血管是否有保護作用，未見基礎研究報道。本研究以人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）為實驗對象，建立高糖誘導的HUVECs 模型，觀察高糖對HUVECs 凋亡和自噬的影響；接著使用重組人BNP（recombinant human BNP，rhBNP）干預高糖誘導的HUVECs，觀察rhBNP對HUVECs 凋亡和自噬功能的影響，并探討其可能的機制。

材 料 和 方 法

1 細胞株和主要試劑

原代HUVECs 購自Clonetics。胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和低糖DMEM 培養(yǎng)基（杭州吉諾生物醫(yī)藥）；葡萄糖粉（G7021-110G）和Western blot實驗相關試劑（Sigma）；抗beclin-1 抗體（Abacm）；抗Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK、微管相關蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）-I 和LC3-II 抗體，ERK 通路抑制劑U-0126，以及3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）均購自CST；凍干rhBNP（商品名新活素，中國成都諾迪康生物制藥有限公司）。

2 方法

2.1 HUVECs的培養(yǎng)及處理 將含有HUVECs的凍存管從液氮罐中取出，置于37 ℃水浴鍋中，使得凍存液快速融化。將細胞懸液轉移至細胞培養(yǎng)瓶中，用含5%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基在37.0 ℃、飽和濕度、5% CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。以無菌PBS 洗滌細胞后，加入0.25%的胰酶（含EDTA）消化傳代，用ECM 培養(yǎng)基重懸，調整細胞密度至5×107L-1，接種于培養(yǎng)板中，充分貼壁后，去血清預處理12 h 后，用于實驗。處理穩(wěn)定后加入不同濃度葡萄糖處理細胞24 h，分為4 組：培養(yǎng)液含葡萄糖分別為11.1、33.3和50 mmol/L 的高糖處理組；不做任何處理的細胞（培養(yǎng)液含葡萄糖5.5 mmol/L）作為對照組。

2.2 rhBNP 濃度的確定 用不同濃度（0.1、1 和10 mg/L）rhBNP 和33.3 mmol/L 葡萄糖孵育HUVECs 24 h，以5.5 mmol/L 葡萄糖作為對照組，評估自噬蛋白表達的改變，確定后續(xù)實驗中rhBNP的濃度。

2.3 實驗分組 按給予不同干預因素分為以下實驗組：（1）對照組：5.5 mmol/L 葡萄糖；（2）高糖組：33.3 mmol/L 葡 萄 糖；（3）高 糖+rhBNP 組：1 mg/L rhBNP+33.3 mmol/L 葡萄糖共孵育24 h；（4）高糖+rhBNP+3-MA 組：1 mg/L rhBNP 和3-MA 共同預處理6 h 后，與33.3 mmol/L 葡萄糖共孵育24 h；（5）高糖+rhBNP+U-0126組：1 mg/L rhBNP 和10 μmol/L U-0126共同預處理6 h 后，與33.3 mmol/L 葡萄糖共孵育24 h。

2.4 CCK-8 法檢測細胞活力 將HUVECs 按照每孔1×104的密度接種于96孔板，按照細胞分組進行干預后，每孔加入10 μL 的CCK-8 試劑，培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h，酶標儀檢測450 nm波長處各孔的吸光度（A），按公式換算為細胞相對活力。細胞相對活力（%）=處理組A值/正常對照組A值×100%。

2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 用不含EDTA的胰酶消化各組細胞，收集各組細胞至離心管中，2 000 r/min 離心5 min 后棄上清，然后用預冷的PBS洗滌，2 000 r/min 離心5 min 各2 次。加入500 μL 的結合緩沖液懸浮細胞，每組細胞中加入5 μL 的annexin V-FITC 混勻，再加入5 μL 的PI 混勻，室溫下避光反應10～15 min，上樣流式細胞儀檢測。

2.6 細胞劃痕試驗 細胞種于48孔板，24 h后細胞培養(yǎng)至80%融合度時，以200 μL 移液器吸頭在培養(yǎng)皿中央垂直劃線，用PBS 清洗2 次，加入無血清的DMEM 培養(yǎng)液，處理穩(wěn)定后加入不同濃度葡萄糖，在劃痕處拍照作為初始對照。其中高糖處理組加入不同濃度rhBNP，繼續(xù)孵育24 h，于顯微鏡下拍照，采用Image-Pro Plus 6.0 軟件測量劃痕的距離，細胞遷移率（%）=（原劃痕寬度-現(xiàn)劃痕寬度）/原劃痕寬度×100%。

2.7 Western blot檢測蛋白表達 收集各組細胞，分別加入120 μL細胞裂解液，置于冰上裂解10 min，收集細胞懸液于4 ℃、12 000 r/min 離心30 min，取上清。BCA 工作法進行蛋白定量，以40 μg總蛋白上樣然后進行SDS-PAGE，電泳完成后將蛋白轉移至PVDF 膜上，以含5%脫脂奶粉的TBST 封閉90 min。分別將各種不同抗體用Ⅰ抗稀釋液按照說明書上的比例稀釋后與PVDF 膜置于4 ℃搖床孵育過夜，次日用TBST 洗膜3 遍后再與Ⅱ抗（1∶4 000）室溫孵育60 min，TBST 洗膜3 遍，ECL 發(fā)光成像，β-actin 作為內參照，用Image Lab 圖像分析軟件對樣本每一個條帶的灰度值進行半定量分析。

3 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 8 軟件進行統(tǒng)計分析。滿足正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。各組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），并行Bonferroni 事后檢驗對多組數(shù)據(jù)進行組間兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 高糖對臍靜脈內皮細胞活力、凋亡和自噬的影響

HUVECs 予不同濃度（11.1、33.3 和50 mmol/L）的高糖干預24 h，以5.5 mmol/L 葡萄糖做為正常對照組（細胞活力100%），則高糖3 組的細胞活力依次為81.17%、59.61%和46.13%，表明隨著葡萄糖濃度的升高，細胞活力下降；11.1 mmol/L 組與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學顯著性，葡萄糖濃度在33.3和50.0 mmol/L 時HUEVCs 的細胞活力顯著下降（P＜0.01），見圖1。

Figure 1. The effects of glucose at different concentrations on the viability of HUVECs. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs 5.5 mmol/L glucose group；△P＜0.05 vs 11.1 mmol/L glucose group.圖1 不同濃度葡萄糖對HUVECs活力的影響

以annexin V-FITC/PI 雙染法及流式細胞術檢測細胞凋亡，結果顯示，5.5 mmol/L 葡萄糖組HUVECs的凋亡率為8.6%，11.1 mmol/L 組為17.4%，33.3 mmol/L 組為37.6%，50 mmol/L 組為42.1%，隨著葡萄糖濃度升高，HUVECs 凋亡率亦逐漸升高（P＜0.05或P＜0.01），見圖2。

Figure 2. The effects of glucose at different concentrations on the apoptosis of HUVECs. Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 5.5 mmol/L glucose group；△△P＜0.01 vs 11.1 mmol/L glucose group.圖2 不同濃度葡萄糖對HUVECs凋亡的影響

隨著葡萄糖濃度的升高，凋亡相關蛋白Bax/Bcl-2 比值和cleaved caspase-3 蛋白水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），見圖3。

Figure 3. The effects of glucose at different concentrations on the protein levels of apoptosis-related molecules in HUVECs. The protein levels of cleaved caspase-3（A），Bax and Bcl-2（B）in the HUVECs exposed to different concentrations of glucose were measured by Western blot. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs 5.5 mmol/L glucose group；△P＜0.05 vs 11.1 mmol/L glucose group.圖3 不同濃度葡萄糖對HUVECs凋亡相關蛋白表達的影響

隨著葡萄糖濃度的升高，自噬蛋白beclin-1 水平和LC3-II/LC3-I比值均呈下降趨勢，在葡糖糖濃度為11.1 mmol/L 時自噬蛋白下降不明顯（P＞0.05），而在33.3 和50 mmol/L 時 下 降 最 明 顯（P＜0.05 或P＜0.01）；在葡糖糖濃度為33.3 mmol/L 時，與11.1 mmol/L相比，beclin-1和LC3-II/LC3-I也顯著下降（P＜0.05），見圖4。

Figure 4. The effects of glucose at different concentrations on the protein levels of autophagy-related molecules in HUVECs. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs 5.5 mmol/L glucose group；△P＜0.05 vs 11.1 mmol/L glucose group.圖4 不同濃度葡萄糖對HUVECs自噬相關蛋白表達的影響

2 不同濃度葡萄糖的干預對HUVECs 自噬相關信號通路的影響

不同濃度的葡萄糖與HUVECs 共孵育24 h，結果顯示，ERK 磷酸化水平在葡萄糖濃度為33.3 和50 mmol/L 時 與5.5 mmol/L 組相比均顯著下降（P＜0.01），與11.1 mmol/L 組相比的差異亦有統(tǒng)計學意義（P＜0.05 或P＜0.01），見圖5A；而AKT 磷酸化水平在不同濃度葡萄糖作用下的變化均不顯著（P＞0.05），見圖5B。

Figure 5. The effects of glucose at different concentrations on the protein levels of ERK（A）and AKT（B）were measured by Western blot. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs 5.5 mmol/L glucose group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs 11.1 mmol/L glucose group.圖5 不同濃度葡萄糖對HUVECs的ERK和AKT蛋白水平的影響

3 不同濃度rhBNP 對高糖誘導下HUVECs 活力和遷移能力的影響

為確定rhBNP 對高糖誘導下HUVECs 生長的影響，我們用33.3 mmol/L 的葡萄糖聯(lián)合不同濃度的rhBNP 處理HUVECs。結果顯示，與高糖組相比，0.1和10 mg/L 的rhBNP 對HUVECs 活力影響的差異無統(tǒng)計學顯著性（P＞0.05），而1 mg/L 的rhBNP 可顯著提高HUVECs 活力（P＜0.01），說明rhBNP 在1 mg/L時具有一定的促進高糖誘導HUVECs 生長能力的作用，見圖6。

Figure 6. The effects of rhBNP at different concentrations on the viability of HUVECs induced by high glucose. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 5.5 mmol/L glucose group；##P＜0.01 vs 33.3 mmol/L glucose group.圖6 不同濃度rhBNP對高糖誘導下HUVECs活力的影響

體外遷移實驗結果顯示，與高糖（33.3 mmol/L葡萄糖）組和高糖+0.1 mg/L rhBNP 組比較，1 和10 mg/L 的rhBNP 均能顯著改善高糖誘導下HUVECs 的遷移能力（P＜0.05或P＜0.01），見圖7。

Figure 7. The effects of rhBNP at different concentrations on the migration ability of HUVECs induced by high glucose. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs 5.5 mmol/L glucose group；##P＜0.01 vs 33.3 mmol/L glucose group；△P＜0.05 vs 33.3 mmol/L glucose+0.1 mg/L rhBNP group.圖7 不同濃度rhBNP對高糖誘導下HUVECs遷移能力的影響

4 不同濃度rhBNP 對高糖誘導下HUVECs 凋亡蛋白水平的影響

以不同濃度的rhBNP 干預高糖（33.3 mmol/L 葡萄糖）誘導下的HUVECs，發(fā)現(xiàn)1 和10 mg/L 的rhBNP處理可顯著降低高糖條件下cleaved caspase-3 蛋白水平（P＜0.05），但0.1 mg/L rhBNP的作用不顯著（P＞0.05）；不同濃度的rhBNP 處理后Bax/Bcl-2的比值均顯著下降（P＜0.05），但與正常5.5 mmol/L 葡萄糖組比較仍有一定的差異（P＜0.05），而不同濃度rhBNP組間Bax/Bcl-2 比值的差異無統(tǒng)計學顯著性（P＞0.05），見圖8。這提示rhBNP 具有抑制高糖環(huán)境下內皮細胞凋亡的作用，但不能使高糖濃度下的凋亡蛋白水平完全恢復正常。

Figure 8. The effects of rhBNP at different concentrations on the protein levels of apoptosis-related molecules in HUVECs induced by high glucose. The protein levels of cleaved caspase-3（A），Bax and Bcl-2（B）in the HUVECs were measured by Western blot. Mean±SD. n=3. *P＜0.05，**P＜0.01 vs 5.5 mmol/L glucose group；△P＜0.05 vs 33.3 mmol/L glucose group.圖8 不同濃度rhBNP對高糖誘導下HUVECs凋亡蛋白水平的影響

5 rhBNP提高高糖誘導下HUVECs的自噬水平

以1 mg/L rhBNP干預高糖（33.3 mmol/L葡萄糖）誘導下的HUVECs，與33.3 mmol/L 葡萄糖組相比，LC3-II/LC3-I 比值和beclin-1 水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；加入自噬抑制劑3-MA 后自噬蛋白表達被抑制，用U-0126 抑制ERK 后，自噬蛋白略有提高，但差異無統(tǒng)計學顯著性（P＞0.05），說明抑制自噬和ERK 通路后rhBNP 無法發(fā)揮促進LC3-II/LC3-I 和beclin-1自噬蛋白表達的作用，見圖9。這提示rhBNP能促進高糖誘導下HUVECs自噬蛋白的表達。

Figure 9. The effect of rhBNP on the expression of autophagy-related proteins beclin-1 and LC3 in the HUVECs induced by high glucose. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs 5.5 mmol/L glucose group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs 33.3 mmol/L glucose group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs 33.3 mmol/L gulcose+1 mg/L rhBNP group.圖9 rhBNP對高糖誘導下HUVECs自噬蛋白beclin-1和LC3表達的影響

6 rhBNP 對高糖誘導下HUVECs 中ERK 信號通路蛋白的影響

為進一步證實rhBNP 通過激活ERK 信號發(fā)揮作用，我們以1 mg/L 的rhBNP 干預高糖（33.3 mmol/L葡萄糖）誘導下的HUVECs，結果發(fā)現(xiàn)ERK 的磷酸化水平與高糖組相比顯著升高（P＜0.05），見圖10。這說明rhBNP具有促進ERK磷酸化的作用。

Figure 10. The effect of rhBNP on the protein levels of p-ERK in the HUVECs induced by high glucose. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs 5.5 mmol/L glucose group；#P＜0.05 vs 33.3 mmol/L glucose group；△P＜0.05 vs 33.3 mmol/L glucose+1 mg/L rhBNP group.圖10 rhBNP 對高糖誘導下HUVECs 中p-ERK 蛋白水平的影響

討 論

血管內皮損傷是血管病變的基礎，糖尿病有多種因素可直接或間接導致內皮細胞受損。內皮細胞受損是動脈粥樣硬化起始過程。血管內皮細胞凋亡會減弱血管內皮預防血脂沉積的屏障作用，局部的抗凝和纖溶機制也會改變，產生促凝作用，加速動脈粥樣硬化的發(fā)生和血栓形成，這就是血管病變最危險和致命的改變［8］。葡萄糖可以促進內皮細胞凋亡和自噬來改變細胞功能狀態(tài)。長期的高糖誘導血管內皮細胞凋亡、抑制自噬，造成內皮受損，在糖尿病血管并發(fā)癥中發(fā)揮關鍵性作用［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著葡萄糖濃度的升高，HUVECs 活力下降，33.3 mmol/L 葡萄糖孵育24 h即可使內皮細胞活力下降近一半，是正常血糖的59.55%，細胞凋亡率迅速從正常的2.3%增加到31.9%，50 mmol/L 時更明顯，凋亡率為46.6%。Bax/Bcl-2 比值升高，并最終導致caspase-3也升高，說明高糖誘導對內皮細胞的損傷十分嚴重。與以往研究報道結果類似［10］。

自噬是一種細胞內的應激反應，在細胞的穩(wěn)態(tài)、生長、發(fā)育和疾病發(fā)生中起著重要的作用，很多證據(jù)表明自噬通路是很多疾病潛在的靶向治療通路，其中就包括糖尿?。?1］。自噬作為細胞的保護性機制，調節(jié)內皮細胞的增殖和凋亡，在動脈硬化病變中具有重要作用［12］。研究表明，血管內皮細胞自噬具有抗凋亡及恢復內皮細胞功能的作用［13］。我們發(fā)現(xiàn)隨著葡萄糖濃度的升高，HUVECs 自噬蛋白beclin-1 和LC3-II/LC3-I逐步下降，葡萄糖濃度越高越明顯，說明高糖抑制內皮細胞自噬越明顯，與以往研究結果一致［14］。持續(xù)應激促使血管內皮細胞的自噬作用被抑制，使得細胞走向死亡［15］。自噬作為一種保護機制被削弱，清除損傷細胞器和代謝產物能力下降，促進細胞凋亡。

BNP 是利尿鈉肽家族中的一員。利尿鈉肽家族主要包括心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）、BNP、C 型利尿鈉肽（C-type natriuretic peptide，CNP）、腎利尿鈉肽（renal natriuretic peptide，RNP）及樹眼鏡蛇屬利尿鈉肽（Dendroaspisnatriuretic peptide，DNP）。利尿鈉肽系統(tǒng)在心腎調節(jié)中起重要作用，可抑制水鈉潴留及血管收縮肽的產生和作用，還能促進血管舒張和抑制交感神經過度反應。BNP主要由心室肌細胞分泌，當心臟處于負荷狀態(tài)時，心室肌細胞分泌BNP的量增加。外源性BNP能夠通過提高內皮祖細胞的數(shù)量和功能而促進血管再生［16］。本研究以33.3 mmol/L 葡萄糖誘導的HUVECs 為研究對象，不同濃度的rhBNP 均可顯著促進HUVECs活力，1 mg/L rhBNP 最明顯。BNP 具有抗心肌細胞凋亡的作用：BNP 通過降低活性氧簇水平、改變線粒體滲透性而減少心肌細胞凋亡［17］；BNP 預處理可以提高Bcl-2/Bax 比值，降低caspase-3 水平，減少心肌缺血再灌注壞死和凋亡［18］。此外，rhBNP 可以通過抑制氧化應激和改變線粒體膜電位，阻止ox-LDL 誘導的巨噬細胞凋亡［19］；通過抑制MAPK 和NF-κB 通路活性，減輕脂多糖誘導人胎兒肺成纖維細胞損傷［20］；還能通過抑制氧化應激、提高抗氧化酶、抑制NF-κB/MMP-9通路而緩解創(chuàng)傷失血性休克引起的急性肺損傷［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，外源性rhBNP 能顯著降低Bax/Bcl-2 比值和cleaved caspase-3 蛋白水平，說明外源性rhBNP具有顯著的抗凋亡作用；rhBNP還能促進LC3-II/LC3-I 和beclin-1 蛋白表達，給予自噬抑制劑3-MA 后，rhBNP 促使自噬蛋白表達的作用明顯被削弱。

自噬調控相關的信號通路中PI3K/Akt/mTOR 和MAPK/ERK/mTOR 信號通路被證明在自噬形成過程中扮演著最重要的角色。這2 條信號通路均參與細胞的增殖與分化、細胞形態(tài)維持、細胞骨架的構建、細胞凋亡等多種生物學反應，被認為是內皮細胞促生存的關鍵信號通路［22］。在高糖誘導的HUVECs 中我們發(fā)現(xiàn)隨著葡萄糖濃度的升高，ERK 活性明顯被抑制，而AKT 活性改變不明顯，說明高糖抑制ERK 的磷酸化，降低其活性。進一步驗證發(fā)現(xiàn)rhBNP干預后ERK通路被激活，予ERK抑制劑U-0126后，自噬蛋白LC3-II/LC3-I比值和beclin-1表達也下降，說明rhBNP促進自噬是通過ERK信號通路發(fā)生作用的。

綜上所述，rhBNP 可減少高糖誘導下內皮細胞凋亡，促進內皮細胞增殖和遷移，其機制可能與激活ERK信號通路，促進自噬蛋白表達，減少caspase-3和Bax 凋亡蛋白表達有關。但rhBNP 具體的分子機制還有待進一步的研究。