右美托咪定通過Akt/mTOR自噬通路介導NLRP3炎癥小體失活而減輕膿毒癥大鼠腸損傷*

陳 浩， 李慧利， 杜 亮， 周長浩， 陳 歡， 王 欣

（河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院麻醉手術科，河北石家莊 050031）

膿毒癥由感染引發(fā)，患者全身發(fā)生有害反應，會出現(xiàn)低血壓、惡病質(zhì)和發(fā)熱等癥狀，嚴重影響生命安全，危害嚴重［1］。膿毒癥會導致炎癥因子和自由基增多、出現(xiàn)線粒體損傷等，這些情況均導致細胞自噬增多，而自噬在膿毒癥中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用［2］。蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）自噬通路作為上游通路匯合點，在膿毒癥大鼠中對于自噬調(diào)控發(fā)揮重要作用［3］。膿毒癥中激活自噬可以抑制炎癥反應，從而減少細胞死亡，減輕患者癥狀［4］。右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）作為α2受體激動藥物，對膿毒癥患者有保護作用，可降低28 d死亡率和縮短機械通氣時間［5］，但作用機制尚需進一步探討。因此，本研究采用盲腸結(jié)扎穿孔術（cecal ligation and puncture，CLP）建立膿毒癥大鼠模型，探究DEX 對自噬及核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體的作用，以期尋找DEX緩解膿毒癥的機制。

材 料 和 方 法

1 動物

50 只SPF 級雄性Wistar 大鼠，10 周齡，體質(zhì)量（200±10）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（京）2016-0011。所有大鼠均在溫度（23.5±0.5）℃、濕度（50±5）%、12 h黑暗/12 h 光照條件下自由飲水攝食，暫養(yǎng)1 周后進行實驗，實驗動物符合3R 原則。本研究經(jīng)河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院動物倫理審查委員會審核并通過。

2 主要試劑

鹽酸DEX注射液（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；國藥準字H20090248；規(guī)格：2 mL、200 μg）；PI3K/mTOR 抑制劑NVP-BEZ235（MedChemExpress；規(guī)格：200 mg；純度：99.68%）；自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA；Sigma；規(guī)格：100 mg）；蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；大鼠白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、兔源Ⅰ抗［beclin-1、LC3-II、Akt、磷 酸 化（phosphorylated，p）-Akt、mTOR、p-mTOR、NLRP3、含caspase 募集結(jié)構域的凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）及caspase-1 及其前體pro-caspase-1、GAPDH］及Ⅱ抗羊抗兔IgG（Abcam）。光學顯微鏡（深圳市隆基金相儀器設備有限公司，型號：LJ-JX2030）；透射電鏡（Thermo Scientific，型號：Talos）；蛋白凝膠成像儀（北京中西華大科技有限公司，型號：JY02G）。

3 主要方法

3.1 分組及處理 將大鼠分成假手術（sham operation，sham）組、模型（model）組、DEX 組、DEX+NVPBEZ235組和DEX+3-MA組，每組10只。除假手術組外，其余各組參考文獻［6］采用CLP建立膿毒癥大鼠模型：大鼠術前禁食但不禁水，麻醉大鼠，大鼠仰臥固定在鼠板上，腹腔經(jīng)消毒后在正中切開約1.5 cm 切口，找出盲腸，結(jié)扎回盲瓣及遠端盲腸，無菌注射器針頭在結(jié)扎處與盲腸末端中點處做2 次貫通穿孔，擠出腸內(nèi)容物，盲腸連同擠出的腸內(nèi)容物一同回納腹腔，逐層縫合切口。假手術組大鼠除了不結(jié)扎穿孔盲腸外其余處理相同。造模結(jié)束后DEX組、DEX+NVP-BEZ235 組和DEX+3-MA 組分別在0、3 和6 h 腹腔 注 射10 μg/kg DEX［7］，DEX+NVP-BEZ235 組 在DEX 組基礎上腹腔注射30 mg/kg NVP-BEZ235，DEX+3-MA 組在DEX 組基礎上腹腔注射15 mg/kg 自噬抑制劑3-MA。

3.2 樣品采集 造模24 h，腹主動脈采血，斷頭法處死大鼠，收集腸道組織，部分置于4%多聚甲醛中固定、部分置于-80 ℃冰箱保存。

3.3 HE 染色觀察腸道組織形態(tài)和肉眼觀察結(jié)腸大體形態(tài) 4%多聚甲醛中固定組織，梯度乙醇脫水后進行常規(guī)包埋、切片、貼片、烤片，切片（厚度5 μm），切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，晾干后蘇木精染色、0.1%鹽酸酒精分化、伊紅復染，乙醇脫水、二甲苯透明后封片，光學顯微鏡下觀察腸道組織形態(tài)。另外，肉眼觀察大鼠結(jié)腸標本，進行結(jié)腸大體形態(tài)損傷指數(shù)（colon macroscopic damage index，CMDI）評分。評分標準：0 分，無損傷；1 分，輕度水腫、充血，表明光滑、無糜爛；2分，充血、水腫，組織表面呈顆粒狀，有糜爛或腸黏連；3分，高度水腫、充血，黏膜表明壞死或潰瘍，潰瘍最大縱徑＜10 mm，腸壁增厚或表面壞死及炎癥；4 分，在3 分基礎上潰瘍最大縱徑≥10 mm，或出現(xiàn)全腸壁壞死。

3.4 ELISA 檢測血清中IL-1β 和TNF-α 水平 腹主動脈血室溫靜置2 h，1 400×g離心10 min，上清為血清。參考大鼠IL-1β 和TNF-α ELISA 試劑盒檢測血清中IL-1β和TNF-α水平。

3.5 免疫組化檢測腸道組織中beclin-1 和LC3-II 蛋白表達情況 3.3 中切片經(jīng)0.1 mol/L 枸櫞酸鈉緩沖液高溫抗原修復，3% H2O2甲醇溶液封閉抗原，加入beclin-1（1∶100）和LC3-II（1∶250）抗體，4 ℃孵育過夜；37 ℃孵育HRP 標記的山羊抗兔IgG（1∶500），DAB 染色，蘇木素染核。顯微鏡下觀察腸道組織中beclin-1和LC3-II蛋白情況：beclin-1和LC3-II目的蛋白為胞質(zhì)、胞核中棕褐色團狀物質(zhì)。蛋白陽性率（%）=陽性細胞/總細胞×100%。

3.6 Western blot 檢 測 腸 道 組 織 中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、NLRP3、ASC、caspase-1 和pro-caspase-1 蛋白水平 從-80 ℃冰箱中取腸道組織30 mg，手術剪剪碎，添加蛋白裂解液，冰上研磨后冰上裂解20 min，10 000×g、4 ℃離心20 min，BCA 試劑盒測定蛋白濃度，每孔上樣30 μg，凝膠電泳分離蛋白，PVDF 轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；加入Ⅰ抗［Akt（1∶10 000）、p-Akt（1∶500）、mTOR（1∶10 000）、pmTOR（1∶1 000）、NLRP3（1∶1 000）、ASC（1∶1 000）、caspase-1（1∶1 000）、pro-caspase-1（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000）］；對應加入Ⅱ抗羊抗兔IgG（1∶5 000），室溫孵育2 h。DAB 顯色試劑顯色，蛋白凝膠成像儀拍照和定量分析。

4 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 7.0 進行統(tǒng)計學分析。計量數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，組內(nèi)比較用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 DEX對腸道組織形態(tài)的影響

假手術組腸上皮細胞大小均勻一致、排列整齊緊密，層次分明，無明顯病理改變；模型組腸道組織完整性破壞嚴重，存在壞死脫落細胞，炎癥浸潤現(xiàn)象明顯，基底面細胞染色較深，細胞擠壓明顯，游離面細胞有不同程度潰損；DEX 組腸道組織屏障較為完整，細胞形態(tài)清晰，無明顯細胞碎片脫落，炎癥浸潤較輕；DEX+NVP-BEZ235組細胞形態(tài)改變，游離面排列不平整，膠原帶增生明顯，炎癥浸潤明顯；DEX+3-MA 組腸道完整破壞，基底面細胞排列紊亂，膠原帶增厚，細胞形態(tài)破壞嚴重，有較多游離的細胞碎片，見圖1。

Figure 1. The morphological changes of rat intestinal tissues in the 5 groups. A：sham group；B：model group；C：DEX group；D：DEX+NVP-BEZ235 group；E：DEX+3-MA group. The black star indicates the collagen band. The scale bar=100 μm.圖1 各組大鼠腸道組織形態(tài)變化

與假手術組相比，模型組、DEX 組、DEX+NVPBEZ235 組和DEX+3-MA 組CMDI 評分顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，DEX 組和DEX+NVP-BEZ235組CMDI 評分顯著降低（P＜0.05）；與DEX 組相比，DEX+3-MA 組CMDI 評 分 顯 著 升 高（P＜0.05），見圖2。

Figure 2. The colon macroscopic damage index（CMDI）in each group. Mean±SD. n=10.#P＜0.05 vs sham group；*P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs DEX group.圖2 各組大鼠結(jié)腸標本CMDI評分

2 DEX對血清中IL-1β和TNF-α水平的影響

與假手術組相比，模型組、DEX 組、DEX+NVPBEZ235 組和DEX+3-MA 組血清中IL-1β 和TNF-α 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，DEX 組和DEX+NVP-BEZ235 組血清中IL-1β 和TNF-α 水平顯著降低（P＜0.05），DEX+3-MA 組血清中IL-1β水平顯著 降 低（P＜0.05）；與DEX 組 相 比，DEX+NVPBEZ235 組和DEX+3-MA 組血清中IL-1β 和TNF-α 水平顯著升高（P＜0.05），見圖3。

Figure 3. Comparison of serum levels of IL-1β and TNF-α in the 5 groups. Mean±SD. n=10.#P＜0.05 vs sham group；*P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs DEX group.圖3 5組血清中IL-1β和TNF-α水平比較

3 DEX 對腸道組織中beclin-1 和LC3-II 蛋白的影響

與假手術組相比，模型組、DEX 組、DEX+NVPBEZ235 組和DEX+3-MA 組腸道組織中beclin-1 和LC3-II 蛋白陽性率升高（P＜0.05）；與模型組相比，DEX 組腸道組織中beclin-1 和LC3-II 蛋白陽性率升高（P＜0.05），DEX+3-MA 組腸道組織中beclin-1 和LC3-II 蛋白陽性率降低（P＜0.05）；與DEX 組相比，DEX+NVP-BEZ235 組和DEX+3-MA 組腸道組織中beclin-1 和LC3-II 蛋白陽性率降低（P＜0.05）；與DEX+NVP-BEZ235 組相比，DEX+3-MA 組腸道組織中beclin-1蛋白陽性率降低（P＜0.05），見圖4。

Figure 4. The protein expression of beclin-1 and LC3-II in intestinal tissues of the rats in the 5 groups was detected by immunohistochemical staining（scale bar=100 μm）. Mean±SD. n=10.#P＜0.05 vs sham group；*P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs DEX group；△P＜0.05 vs DEX+NVP-BEZ235 group.圖4 免疫組化檢測各組大鼠腸道組織中beclin-1和LC3-II蛋白的表達情況

4 DEX 對 腸 道 組 織 中Akt、p-Akt、mTOR、pmTOR、NLRP3、ASC、caspase-1 和pro-caspase-1 蛋白水平的影響

5組腸道組織中Akt、mTOR 和pro-caspase-1蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與假手術組相比，模型組、DEX 組、DEX+NVP-BEZ235 組和DEX+3-MA組 腸 道 組 織 中p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、NLRP3、ASC 和caspase-1/pro-caspase-1 蛋 白 水 平 升 高（P＜0.05）；與模型組相比，DEX 組和DEX+NVP-BEZ235組腸道組織中p-Akt/Akt 和p-mTOR/mTOR 蛋白水平升 高（P＜0.05），NLRP3、ASC 和caspase-1/pro-caspase-1 蛋白水平降低（P＜0.05），DEX+3-MA 組腸道組織中p-Akt/Akt 蛋白水平升高（P＜0.05），NLRP3 和ASC 蛋白水平降低（P＜0.05）；與DEX 組相比，DEX+NVP-BEZ235 組和DEX+3-MA 組腸道組織中p-Akt/Akt 和p-mTOR/mTOR 蛋 白 水 平 降 低（P＜0.05），NLRP3、ASC 和caspase-1/pro-caspase-1 蛋 白 水 平 升高（P＜0.05）；與DEX+NVP-BEZ235 組相比，DEX+3-MA 組腸道組織中NLRP3 蛋白水平升高（P＜0.05），ASC蛋白水平降低（P＜0.05），見圖5。

Figure 5. The protein levels of Akt，p-Akt，mTOR，p-mTOR，NLRP3，ASC，caspase-1 and pro-caspase-1 in intestinal tissues of the rats in the 5 groups were detected by Western blot. Mean±SD. n=10.#P＜0.05 vs sham group；*P＜0.05 vs model group；&P＜0.05 vs DEX group；△P＜0.05 vs DEX+NVP-BEZ235 group.圖5 Western blot檢測各組大鼠腸道組織Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、NLRP3、ASC、caspase-1和pro-caspase-1蛋白水平

討 論

DEX 作為臨床上常用麻醉藥物輔助劑，在重癥監(jiān)護室可鎮(zhèn)定插管或呼吸機患者，安全性較高，較大劑量也不會損害心、肝、腎等重要器官，危害?。?］。隨著研究深入，在臨床上使用DEX 可以降低炎癥因子，減輕水腫，在膿毒癥中具有較高潛在價值［9］，但具體機制尚需進一步研究，為探討其機制進行本研究。在本研究結(jié)果，膿毒癥大鼠腸道組織完整性遭到破壞，細胞脫落和炎癥浸潤現(xiàn)象明顯，出現(xiàn)明顯的病理損傷；經(jīng)DEX治療后大鼠腸道組織恢復完整性，僅存在部分細胞脫落和炎癥浸潤現(xiàn)象，且炎癥因子IL-1β 和TNF-α 水平降低。這提示DEX 能夠修復由于膿毒癥造成的腸道功能破壞，緩解膿毒癥大鼠中的炎癥，具體機制尚需進一步探究。

本研究結(jié)果顯示膿毒癥大鼠腸道組織NLRP3、ASC 和caspase-1/pro-caspase-1 蛋白水平均處于升高狀態(tài)。NLRP3炎癥小體可活化ASC和caspase-1從而引起促炎因子IL-1β 的成熟和釋放，促進炎癥反應［10］；且NLRP3與膿毒癥的多器官損傷關系密切，在膿毒癥大鼠中抑制NLRP3 炎癥小體活化可抑制caspase-1 和IL-1β 釋放，從而穩(wěn)定血管內(nèi)皮鈣黏蛋白，緩解膿毒癥引起的肺損傷［11］。DEX 在膿毒癥患者中能夠減輕NLRP3炎癥小體從而減輕膿毒癥誘發(fā)的腎損傷［12］，提示膿毒癥大鼠腸道組織中NLRP3 炎癥小體處于激活狀態(tài)，活化的炎癥小體促進促炎因子IL-1β 和TNF-α 的表達，加重炎癥反應。添加DEX 后能夠抑制NLRP3炎癥小體的激活，進而減輕炎癥指標，緩解炎癥損傷。

炎癥損傷導致細胞自噬增多，膿毒癥引發(fā)的多臟器功能衰竭器官中也存在自噬增多現(xiàn)象［13］。Akt/mTOR 通路作為自噬調(diào)節(jié)最經(jīng)典的mTOR 信號轉(zhuǎn)導通路，在膿毒癥大鼠中處于激活狀態(tài)，且自噬小體水平升高，機體處于自我保護狀態(tài)［14］。beclin-1 是自噬活化的關鍵因子，LC3是自噬重要標志蛋白［15］。DEX能夠激活Akt/mTOR 通路，降低促炎因子水平，從而減輕七氟醚誘導的大鼠炎癥損傷［16］。本研究中膿毒癥大鼠腸道組織中p-Akt/Akt 和p-mTOR/mTOR 蛋白水平及beclin-1 和LC3-II 蛋白陽性率升高，提示膿毒癥大鼠腸道組織處于自噬激活狀態(tài)，但本研究中膿毒癥大鼠腸道組織中炎癥因子水平升高，可能是自噬能力有限，整體上導致炎癥加劇。添加DEX 后p-Akt/Akt 和p-mTOR/mTOR 的蛋白水平及beclin-1 和LC3-II 蛋白陽性率進一步升高，提示添加DEX 后能進一步促進自噬，自噬清除炎癥因子，緩解炎癥。進一步研究顯示，分別在DEX的基礎上添加Akt/mTOR通路抑制劑和自噬抑制劑后，beclin-1 和LC3-II 蛋白陽性率降低，炎癥因子IL-1β 和TNF-α 水平升高，提示Akt/mTOR 通路抑制劑與自噬抑制劑功能類似，DEX通過激活Akt/mTOR 通路而促進自噬，進而減輕炎癥反應，實現(xiàn)對膿毒癥大鼠腸道組織損傷的緩解。

綜上所述，DEX 能夠激活Akt/mTOR 通路而促進自噬、減輕炎癥，從而實現(xiàn)對膿毒癥大鼠腸道的保護。但DEX與信號通路之間的具體調(diào)控尚需進一步研究。