海帶多糖通過抑制NF-κB和JNK通路減輕放射誘導的小鼠下頜下腺炎癥反應*

趙 歆， 徐 楊， 柴 溶， 玉洪榮， 敖 翩， 張馨月， 韋 力△， 曾啟新△

（1廣西醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院，廣西南寧 530000；2廣西醫(yī)科大學人體解剖學教研室，廣西南寧 530000）

頭頸部惡性腫瘤是高發(fā)的惡性腫瘤之一，放射治療是大部分頭頸部惡性腫瘤患者首選的治療方式［1］，而放射（radiation，Rad）治療會給患者帶來程度不一的副作用，口腔干燥癥就是其中之一［2］。導致口腔干燥的主要原因是唾液腺損傷引起的唾液分泌量減少，大部分患者因此會發(fā)生口腔黏膜炎和猖獗齲等癥狀，嚴重降低患者的生活質量［3］。研究表明在Rad 引起的急性唾液腺功能障礙中，炎癥反應發(fā)揮重要的作用，還能導致后期的慢性唾液腺萎縮［4］。目前常采用唾液刺激劑（如毛果蕓香堿等）、唾液替代品［5］、中藥和針灸［6］等方法治療，這些方法只能緩解患者的不適，并不能從根本上解決問題［7］。海帶多糖（Laminaria japonicapolysaccharides，LJP）是一種天然的植物多糖，目前多從海帶中提取，具有抗肥胖、抗炎和抗Rad［8-9］等作用。LJP 可通過減少炎癥因子［10］，抑制核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）通路來發(fā)揮抗炎作用［11］。但LJP 對于放射性唾液腺損傷是否也有保護作用尚不清楚。因此，本研究建立小鼠放射性下頜下腺損傷模型，探討LJP對Rad 造成的唾液腺功能障礙的作用及其可能的機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 動物及分組 SPF 級雄性昆明小鼠96 只，2 月齡，體重28～32 g，購于廣西醫(yī)科大學動物實驗中心，許可證號為SCXK（桂）2014-0002。小鼠隨機分為4組：對照（control，Ctrl）組、LJP 組、Rad 組和LJP+Rad組，每組24只。小鼠飼養(yǎng)于清潔級動物房1周，提供充足的水和食物。動物實驗經(jīng)廣西醫(yī)科大學動物倫理委員會批準，并按照《實驗動物飼養(yǎng)管理和使用指南》進行。

1.2 藥品試劑和儀器 LJP（純度＞98%）購自Sigma；抗細胞間黏附分子1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）抗體（ab179707）、抗NF-κB p65抗體（ab32536）、抗NF-κB 抑制蛋白α（inhibitor of NF-κB α，IκBα）抗體（ab7217）、抗c-Jun 氨基末端激酶（c-

Jun N-terminal kinase，JNK）抗體（ab179461）、抗磷酸化 JNK （phosphorylated JNK， p-JNK） 抗 體（ab124956）、抗單核細胞趨化蛋白1（macrophage chemoattractant protein-1，MCP-1）抗體（ab25124）和IgG Ⅱ抗均購自Abcam；通用型SP-9000試劑盒（北京中杉金橋生物有限公司）；毛果蕓香堿和HE 染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；ELISA 試劑盒（廣州楚杰生物科技有限公司）。［60Co］治療儀（廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院）。

2 方法

2.1 模型制備 LJP 干預的小鼠于放射前7 d 連續(xù)腹腔注射給藥（100 mg/kg），其他組用等量的0.9%的生理鹽水代替。采用3.5%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉小鼠，經(jīng)腹腔注射麻醉后固定于自制的固定罩內，僅充分暴露小鼠頸部下頜下腺部位，其它部位由鉛板遮蔽，源皮距80 cm，給予15 Gy照射［12-13］。

2.2 樣本采集 在Rad 處理后1 d、3 d、7 d 和14 d取材（n=4），水合氯醛麻醉后取小鼠眼球血，離心后取上層血清，-80 ℃冰箱保存。分離取出小鼠下頜下腺后立即用4%多聚甲醛溶液固定。

2.3 唾液量的測定 在放射后1 d、3 d、7 d 和14 d

各組隨機抽取6 只小鼠檢測唾液量。將小棉球制備成適宜塞入小鼠口中的大小，記錄此時的重量為m1。選擇頸部區(qū)域消毒，皮下推注毛果蕓香堿（2 mg/kg），將準備好的小棉球放入小鼠下切牙后方舌下的區(qū)域，30 min 后拿出棉球，此時棉球的重量記為m2。唾液分泌量（g）=m2-m1。唾液體積按照1 g/mL換算。

2.4 下頜下腺組織形態(tài)學檢測 將下頜下腺組織固定在4%多聚甲醛固定液中，24 h 后取出脫水石蠟包埋。切片厚度為4 μm，HE染色觀察下頜下腺組織的形態(tài)學改變。

2.5 免疫熒光染色 石蠟切片脫蠟和高溫高壓抗原修復后，分別加入抗NF-κB p65抗體和JNK抗體及Ⅱ抗孵育，經(jīng)DAPI 染色后封片，經(jīng)倒置熒光顯微鏡觀察并采集圖片。應用ImageJ軟件分析結果。

2.6 免疫組化 石蠟切片經(jīng)脫蠟和高溫高壓抗原修 復 后，分 別 經(jīng) 抗IκBα、ICAM-1、JNK、p-JNK 和MCP-1 抗體（分別以1∶200、1∶2 000、1∶1 000、1∶250和1∶200 稀釋）及Ⅱ抗孵育后染色封片。每個組織切片隨機選取3 個高倍視野拍照，采用Image-Pro Plus 6.0進行后續(xù)的蛋白表達情況的分析。

2.7 ELISA 實驗 取下頜下腺組織勻漿并吸取上清液，ELISA試劑盒室溫解凍。根據(jù)ELISA試劑盒說明書配制相關的標準品并進行操作，檢測上清中TNF-α、MCP-1 和巨噬細胞炎癥蛋白2（macrophage inflammatory protein-2，MIP-2）的表達。實驗結束后用酶標儀在450 nm處檢測樣本的吸光度（A）值。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20.0 進行數(shù)據(jù)分析。計量數(shù)據(jù)均以均值±標準差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 LJP對小鼠唾液腺功能的影響

與Ctrl 組相比，單純使用LJP 的小鼠分泌的唾液量無顯著差別（P＞0.05），Rad 處理后的小鼠在各個時點與Ctrl 組相比唾液量均顯著減少（P＜0.05），而經(jīng)LJP 干預后小鼠的唾液量比Rad 組顯著增多（P＜0.05），且隨著時間的延長，有逐漸恢復到Ctrl 組水平的趨勢，見圖1。

Figure 1. The saliva amount of the mice after radiation（Rad）.LJP：Laminaria japonica polysaccharides. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control（Ctrl）group；#P＜0.05 vs Rad group.圖1 放射后各組小鼠的唾液量

2 LJP對于小鼠下頜下腺組織形態(tài)的影響

Ctrl組下頜下腺腺體細胞排列緊密規(guī)則，胞核形態(tài)大小正常，胞質均染，未見明顯的炎癥細胞浸潤；Rad 處理后的小鼠均可見下頜下腺間質水腫及炎癥細胞浸潤，且狀況逐漸加重，Rad 處理后7 d，Rad 組可見明顯的核固縮，腺泡細胞空泡化和腺體結構疏松，隨著時間的推移，下頜下腺組織內炎癥細胞數(shù)量增多，腺泡細胞萎縮、核固縮范圍的程度增加；經(jīng)LJP干預的小鼠細胞排列較Rad 組整齊，炎癥細胞浸潤程度顯著減輕，見圖2。

3 LJP 對小鼠下頜下腺組織中炎癥相關細胞因子含量的影響

鏡下可見ICAM-1 在Ctrl 組和LJP 組僅在細胞膜有少量表達，而Rad 和LJP+Rad 組在血管內皮及導管上皮細胞上的表達顯著增多（P＜0.05）；與Ctrl 組相比，Rad組下頜下腺組織中炎癥細胞因子ICAM-1、TNF-α、MCP-1 和MIP-2 表達顯著增高（P＜0.05）；與Rad 組相比，LJP 干預后的ICAM-1、TNF-α、MCP-1 和MIP-2含量顯著降低（P＜0.05），見圖3。

Figure 3. The effect of Laminaria japonica polysaccharides（LJP）on the content of inflammatory cytokines in submandibular gland of mice after radiation（Rad）. The protein expression of ICAM-1（A）and MCP-1（B）was detected by immunohistochemical staining（scale bar=50 μm）. The secretion of TNF-α，MCP-1 and MIP-2 was detected by ELISA（C）. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control（Ctrl）group；#P＜0.05 vs Rad group..圖3 海帶多糖對放射后小鼠下頜下腺組織中炎癥細胞因子含量的影響

4 LJP 對小鼠下頜下腺組織內NF-κB 信號通路的影響

用免疫熒光法定位NF-κB p65 蛋白，結果顯示Ctrl 組和LJP 組各時點NF-κB p65 主要位于胞質區(qū)，而Rad處理后的NF-κB p65位置發(fā)生了改變，由胞質變?yōu)榘?，入核的?shù)量于Rad 處理后1 d 開始增多，在7 d 時入核的量達到了最大，14 d 時入核的量又減少；而經(jīng)LJP干預的小鼠在各時點入核量均較Rad組減少，有恢復到Ctrl 組的趨勢，見圖4A～D。用免疫組化的方法檢測IκBα蛋白的表達，結果顯示IκBα主要位于血管內皮及導管上皮細胞內；Rad 處理后IκBα 的含量較Ctrl 組顯著減少（P＜0.05），并在Rad處理后7 d 達到最低值；與Rad 組相比，LJP 干預后的IκBα的含量顯著增多（P＜0.05），見圖4E。

Figure 4. The effect of Laminaria japonica polysaccharides（LJP）on the activity of NF-κB signaling pathway in the submandibular gland of mice after radiation（Rad）. A to D：the nuclear location of NF-κB p65 was determined by immunofluorescence staining（A：1 d after Rad；B：3 d after Rad；C：7 d after Rad；D：14 d after Rad）；E：IκBα protein expression was detected by immunohistochemical staining. The scale bar=50 μm. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control（Ctrl）group；#P＜0.05 vs Rad group.圖4 海帶多糖對放射后小鼠下頜下腺組織NF-κB信號通路活性的影響

5 LJP 對小鼠下頜下腺組織內JNK 信號通路活性的影響

免疫組化結果顯示，與Ctrl組相比，Rad組p-JNK蛋白水平顯著升高。計算p-JNK 與JNK 蛋白含量的比值，結果顯示，在各時點LJP 組與Ctrl 組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；Rad處理后的p-JNK/JNK 顯著升高（P＜0.05）；Rad 處理后1 d 與7 d，LJP+Rad 組的下調作用不顯著（P＞0.05），而Rad 處理后3 d 和14 d的下調作用顯著（P＜0.05）。見圖5。

Figure 5. The effect of Laminaria japonica polysaccharides（LJP）on the activity of JNK signaling pathway in the submandibular gland of mice after radiation（Rad）. A to D：the expression of JNK was determined by immunofluorescence staining（A：1 d after Rad；B：3 d after Rad；C：7 d after Rad；D：14 d after Rad）. The protein levels of JNK（E）and p-JNK（F）were detected by immunohistochemical staining. The scale bar=50 μm. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control（Ctrl）group；#P＜0.05 vs Rad group.圖5 海帶多糖對放射后小鼠下頜下腺組織JNK信號通路活性的影響

討 論

放射性唾液腺損傷（radiation-induced salivary gland damage）是頭頸部腫瘤患者接受放療后常見的并發(fā)癥［14］，放射線對唾液腺造成的損傷主要表現(xiàn)為唾液分泌量減少及唾液成分改變［15］，導致患者生活質量下降甚至影響到原本的治療［16］。本研究顯示，Rad處理后小鼠的唾液分泌量顯著減少，說明Rad處理對小鼠的唾液腺造成了損傷，與文獻報道一致［15］；而經(jīng)LJP 干預后，小鼠的唾液分泌量有顯著改善，且隨著時間的推移，有恢復到Ctrl 組水平的趨勢，提示LJP 治療可以減輕Rad 引起的唾液腺損傷。研究認為，炎癥在Rad 誘導的下頜下腺早期損傷中發(fā)揮作用［17］。LJP 可以通過抑制NF-κB 活化而減輕全身炎癥反應［18］，也可以明顯抑制哮喘小鼠的氣道炎癥［10］。但LJP 是否也可以在Rad 誘導的小鼠下頜下腺炎癥反應中發(fā)揮相似的作用尚未可知。本實驗中HE 染色結果可見，與Ctrl 組相比，Rad 處理后下頜下腺組織內可見大量炎癥細胞浸潤，而經(jīng)LJP 干預后炎癥減輕，故推測LJP 對放射性下頜下腺損傷的保護作用與抗炎有關。

ICAM-1 在Rad 處理后的肺組織的表達顯著增加，并在Rad 誘導的肺組織炎癥細胞的遷移中發(fā)揮重要作用［19］。在舍格倫綜合征中主要通過誘導淋巴細胞浸潤從而參與唾液腺的炎癥反應［20］。有研究證明在暴露于輻射后，患者唾液內的ICAM-1 蛋白濃度增加［21］。靜息狀態(tài)下ICAM-1 在免疫細胞和血管內皮細胞呈低水平表達，但是在炎癥刺激下表達會上調，幫助白細胞向受損組織的遷移［22］。TNF-α 是炎癥反應中重要的促炎因子，在放射性下頜下腺損傷中發(fā)揮重要作用［23］。MCP-1 是C-C 類趨化家族成員之一，通過激活和趨化單核巨噬細胞到損傷的血管內皮周圍，促進炎癥反應［24］。在舍格倫綜合征中，MCP-1 與C-C 基序趨化因子受體2［chemokine（C-Cmotif）receptor 2，CCR2］的相互作用是促進單核細胞在唾液腺浸潤的主要原因［25］。而MIP-2 主要對中性粒細胞產(chǎn)生趨化和激活作用［26］，在輻射的肺組織中嗜中性粒細胞和巨噬細胞增多，且MIP-2 在胸膜液中的表達水平顯著提高，升高的MIP-2 可以加速炎癥反應的發(fā)生，促進肺的損傷［27］。本研究顯示，與Ctrl 組相比，Rad 處理后的下頜下腺組織內ICAM-1、TNF-α、MCP-1和MIP-2水平升高，提示Rad導致下頜

下腺組織內相關的炎癥細胞因子水平升高，并且不斷促進炎癥細胞的聚集，進而加重組織的炎癥反應；而LJP 可以緩解上述炎癥因子和炎癥細胞的聚集，減輕小鼠Rad處理后下頜下腺的炎癥反應。

NF-κB 和JNK 信號通路在唾液腺炎癥中發(fā)揮重要作用［28-29］。NF-κB 是調節(jié)炎癥相關因子表達的關鍵轉錄因子之一［30］，被Rad 激活后，其下游的TNF-α和ICAM-1 等炎癥因子的表達會被激活［31］。在沒有被激活的狀態(tài)下，IκBα與NF-κB緊密結合，此時主要位于細胞質，當感知到外來刺激時，IκBα 則降解，NF-κB 因此進入細胞核，此時的NF-κB 信號通路就是激活的狀態(tài)［32］。本研究觀察到，NF-κB于Rad處理后入核量不斷增加；LJP 給藥干預可以顯著減少NFκB p65亞基入核，且能顯著提高IκBα 表達，提示LJP可以通過抑制NF-κB 信號通路的激活，從而減少下游炎癥相關因子的表達。JNK 信號轉導通路為MAPKs炎癥通路中的重要成員。有研究顯示JNK抑制劑可以減少感染組織內炎癥相關因子MCP-1 和MIP-2 的表達，從而減輕炎癥反應［33］。在接受Rad 的唾液腺組織內，p-JNK 的蛋白表達水平提高了41.65%，而抑制JNK 信號通路的激活可以改善放射誘導的唾液腺炎癥［34］。因此，我們也檢測了小鼠下頜下腺組織內JNK 的磷酸化水平，與Ctrl 組相比，Rad 組的下頜下腺組織內p-JNK 的表達顯著增加，而LJP 給藥干預可以顯著抑制小鼠下頜下腺組織內JNK 的磷酸化，從而減少下游炎癥相關因子MCP-1和MIP-2 的表達，降低炎癥水平，達到保護下頜下腺組織的作用。由此可見，LJP 顯著抑制Rad 誘導的下頜下腺炎癥反應，其機制可能與抑制NF-κB 核內轉移及降低JNK蛋白磷酸化水平及有關。

總之，LJP 可以降低TNF-α、ICAM-1、MCP-1 和MIP-2 炎癥因子的表達，減輕Rad 處理小鼠下頜下腺組織的炎癥反應，從而發(fā)揮保護作用，而這種作用可能是通過抑制NF-κB 和JNK 信號通路實現(xiàn)的。然而本研究只對涉及的通路機制進行了初步探討，后續(xù)有待深入研究。