非小細胞肺癌組織中T細胞免疫球蛋白區(qū)黏蛋白-3、程序性死亡因子-1及程序性因子配體1的表達分析

梁樂樂,王 鵬 ，劉俊霞， 董 玉，郭 華

(1．陜西省人民醫(yī)院急診科,陜西 西安 710068；2．西北工業(yè)大學(xué)醫(yī)院,陜西 西安 710109； 3．西安市中心醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,陜西 西安 710004)

肺癌為現(xiàn)階段發(fā)病率和病死率較高的惡性腫瘤疾病，此種疾病發(fā)病因素較為復(fù)雜，非小細胞肺癌則為肺癌內(nèi)發(fā)病率最高的腫瘤疾病，可占肺癌總數(shù)約80%左右。多數(shù)非小細胞肺癌患者被確診后已經(jīng)處于中晚期，且由于免疫系統(tǒng)失調(diào)，癌細胞可快速增殖并可轉(zhuǎn)移至其他位置，使得患者預(yù)后效果較差，生存率較低。有研究認為，免疫系統(tǒng)在腫瘤轉(zhuǎn)移和增殖過程中有重要作用[1-2]。在不同腫瘤免疫應(yīng)答細胞內(nèi)，T細胞免疫球蛋白區(qū)黏蛋白-3(T cell immunoglobulin domain mucin-3，TIM-3)可表達于多種細胞內(nèi)，主要為：巨噬細胞、自然殺傷細胞(NK)以及單核細胞等，可有效調(diào)節(jié)機體自然免疫、特意性免疫，充分發(fā)揮負向免疫調(diào)節(jié)。程序性死亡因子-1(Programmed death factor-1，PD-1)和程序性因子配體1(Programmed factor ligand 1，PD-L1)則為負性T細胞刺激分子，可產(chǎn)生負性調(diào)節(jié)機制免疫應(yīng)答，并可介導(dǎo)免疫逃逸[3-4]。免疫治療屬于現(xiàn)階段疾病治療熱點，本次研究主要分析PD-1、PD-L1、TIM-3于非小細胞肺癌組織、正常組織內(nèi)表達狀況，進而判定各種指標和患者疾病之間關(guān)系，進而為疾病治療提供新方向。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2018年6月至2019年12月我院收治的67例非小細胞肺癌患者及健康患者60例。非小細胞肺癌患者中男34例，女33例，年齡55～70歲，平均(63.41±3.87)歲，高分化16例，中分化23例，低分化28例，TNMⅠ期13例，TNMⅡ期29例，TNMⅢ期25例，32例患者存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。健康患者中男30例，女30例，年齡56～68歲，平均(62.94±4.03)歲。病例納入標準：①患者首次確診為非小細胞肺癌;②近期接受手術(shù)切除、放療、化療患者;③患者均簽署知情同意書。排除標準：①合并其他惡性腫瘤患者;②合并肝腎功能異常患者;③合并嚴重惡化。兩組研究對象的一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批。

1.2 實驗方法 腫瘤細胞質(zhì)、細胞膜有棕黃色顆粒時可判定為陽性。使用5個高倍視野×400,依據(jù)細胞染色強度進行評分(0分為五色；1分為淺黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色)；陽性細胞率計分時：0分表示陰性，1分為陽性細胞0～10%；2分為陽性細胞11%～50%；3分為陽性細胞51%～75%；4分為陽性細胞76%～100%。染色強度×陽性細胞率為3分之上可判定為陽性。PD-1 陽性：低倍鏡觀察切片，隨機選擇5個高倍鏡，觀察陽性細胞數(shù)，平均值為PD-1陽性計數(shù)。所有患者出院之后均通過電話方式進行隨訪，主要隨訪內(nèi)容為門診復(fù)查以及住院信息，生存期，腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等狀況。

1.3 觀察指標 對比非小細胞肺癌患者臨床指標變化。其中主要以不同檢測方式陽性率為判定標準，判定TIM-3、PD-1、PD-L1陽性率。

2 結(jié) 果

2.1 非小細胞肺癌患者TIM-3、PD-1、 PD-L1陽性率比較 非小細胞肺癌組TIM-3、PD-1、PD-L1診斷時陽性率高于健康組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05),見表1。

表1 非小細胞肺癌患者TIM-3、PD-1、PD-L1陽性率比較[例(%)]

2.2 非小細胞肺癌患者臨床指標和病理特征關(guān)系 男性、女性，不同年齡患者TIM-3、PD-1等指標陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；無淋巴結(jié)、無轉(zhuǎn)移、中高級患者、Ⅱ期患者PD-1、TIM-3等指標陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05),見表2。

表2 非小細胞肺癌患者臨床指標和病理特征關(guān)系[例(%)]

2.3 非小細胞肺癌患者TIM-3、PD-1、 PD-L1的Logistic回歸分析 以研究TIM-3淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TIM-3分化、TIM-3TNM分期、PD-L1淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、PD-L1分化、PD-L1TNM分期為自變量，以研究對象是否發(fā)生非小細胞肺癌疾病為因變量進行Logistic回歸分析，結(jié)果見表3，TIM-3、PD-L1指標為獨立判定患者肺小細胞癌指標。

表3 非小細胞肺癌患者TIM-3、PD-1、PD-L1的Logistic回歸分析

3 討 論

肺癌為常見疾病，近年有發(fā)病率和病死率逐步提升趨勢，嚴重威脅人們身體健康。多數(shù)患者診斷時已經(jīng)處于晚期，傳統(tǒng)治療方式為化療和放療，雖然可控制疾病但改善效果遠遠無法滿足人們真實需求，深入研究疾病和疾病內(nèi)各指標的變化便十分重要[5-6]。腫瘤細胞在增殖和浸潤、擴散過程中，巨噬細胞和炎癥因子對于促使腫瘤血管生長有重要作用。巨噬細胞活化不僅可加速新陳代謝，同時也可通過免疫介導(dǎo)信號通路促進腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移。T細胞為重要腫瘤免疫應(yīng)答細胞，T細胞激活之后可有效控制腫瘤細胞生長，也可調(diào)控T細胞激活所需協(xié)同信號刺激，在各種免疫檢查方法中主要分子為：TIM-3、PD-1、PD-L1三個指標均在腫瘤發(fā)展過程中起到重要作用。

TIM-3也可稱之為HAVCR-2，此為TIM龐大家族重要成員，主要作用為調(diào)節(jié)免疫細胞功能。其中TIM-3基因結(jié)構(gòu)和家族其他編碼蛋白基因一樣，結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，其中主要包括多個結(jié)構(gòu)域、橫跨細胞膜?，F(xiàn)階段多數(shù)研究認為TIM-3可在多類型腫瘤細胞表達，且在生長和轉(zhuǎn)移過程中可起到重要作用，且嚴重影響預(yù)后效果[7-9]。有學(xué)者提出，干擾腦膠質(zhì)瘤內(nèi)TIM-3表達之后藥物殺傷作用可顯著提升，該研究結(jié)果表示TIM-3參與惡性腫瘤耐藥[10]。也有對于肺癌的研究發(fā)現(xiàn)，肺癌細胞上常會出現(xiàn)TIM-3表達，且PD-1僅于TIL上進行表達，無論為腫瘤細胞還是TIM-3陽性，均和患者高細胞毒性T細胞和CD8表面蛋白相關(guān)[11]。TIM-3主要出現(xiàn)在腫瘤細胞內(nèi)，且和患者疾病惡化程度呈負相關(guān)關(guān)系。TIM-3高表達可引發(fā)免疫抑制、腫瘤免疫逃逸，當TIM-3和陪體Gal-9結(jié)合之后會誘導(dǎo)CTL、Th1細胞凋亡進而表現(xiàn)出免疫耐受。TIM-3也可通過控制T細胞擴增有效抑制樹突狀細胞活化進而出現(xiàn)腫瘤免疫逃逸。本次研究過程中發(fā)現(xiàn)，TIM-3檢測時非小細胞肺癌陽性率可達52.23%之上，且隨著患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、疾病持續(xù)惡化、分化加劇可使得患者陽性率逐步提升。因此可知TIM-3在疾病發(fā)展和惡化過程中有重要作用，同時也影響患者生存的重要因素。也有研究提出隨著TIM-3陽性率提升疾病惡化程度逐步提升，其中淋巴轉(zhuǎn)移以及分期晚的陽性率顯著高于無淋巴轉(zhuǎn)移患者。該研究結(jié)果也表示，隨著TIM-3高表達和患者惡性程度較高，更容易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

PD-1、PD-L1則為負性共刺激分子免疫球蛋白超家族成員，PD-1主要出現(xiàn)在各種細胞內(nèi)，主要為B細胞、T細胞以及樹突狀細胞，其中PD-L1主要出現(xiàn)在內(nèi)皮細胞和B細胞內(nèi)，食管癌和非小細胞肺癌患者也會出現(xiàn)[12]。PD-1也可稱之為CD279，也為268-氨基酸蛋白質(zhì)，主要出現(xiàn)于T細胞，也有少量表達在活化NKT細胞等免疫細胞，PD-L1也可和PD-L2特異性結(jié)合。其中PD-1和配體結(jié)合時可有效控制T淋巴細胞活化，也可引發(fā)腫瘤免疫逃逸。在多數(shù)研究中認為PD-1可在惡性腫瘤中出現(xiàn)表達異常，且可直接影響患者生活質(zhì)量[13-14]。也有研究提出PD-1可直接參與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移，并和患者總生存率有關(guān)，隨著PD-1水平提升患者生存率也逐步降低[15]。也有研究認為隨著PD-1陽性率提升，腫瘤分化程度更為嚴重，且更易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，分期相對更晚，患者生存率也會受到影響[16]。

腫瘤微環(huán)境內(nèi)，PD-L1/PD-1信號主要負責調(diào)控T細胞免疫應(yīng)答，進而形成負性腫瘤環(huán)境，不僅會引發(fā)腫瘤免疫逃逸，同時在疾病發(fā)展過程中也有重要作用。分析本次研究過程數(shù)據(jù)時發(fā)現(xiàn)，PD-L1診斷時患者陽性率為61.19%，同時非小細胞肺癌患者陽性率和腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)關(guān)系，隨著疾病惡化逐步加劇陽性率呈逐步提升趨勢[17-18]。當PD-1和PD-L1結(jié)合之后，可使得PD-1胞質(zhì)區(qū)免疫受體酪氨酸抑制基序結(jié)合內(nèi)酪氨酸磷酸化，也會使得SHP-2磷酸酶逐步提升，進而使得SHP-2磷酸酶可持續(xù)提升，引發(fā)Syk以及磷脂酞肌醇3各種下游分子去磷酸化，抑制喜好傳導(dǎo)。淋巴細胞增殖活化以及輔助細胞T分化也會受到抑制，進而使得患者機體呈現(xiàn)免疫負調(diào)節(jié)。其中PD-1/PD-L1刺激分子也可使得免疫應(yīng)答產(chǎn)生負調(diào)節(jié)，最終使得腫瘤免疫出現(xiàn)逃逸。也有學(xué)者提出，對于無禁忌證非小細胞肺癌患者，采用免疫檢查和抑制劑治療后，總有效率良好，此種治療方式主要原理即為控制PD-1/PD-L1，使得患者產(chǎn)生抗性，其中TIM-3也可作為免疫抑制劑進行治療[19-21]。因此可知TIM-3等指標不僅可用于診斷患者疾病，同時也可用于監(jiān)測患者疾病惡化。

綜上所述，非小細胞肺癌患者中TIM-3、PD-1、PD-L1的陽性率均較高，其中TIM-3、PD-L1可作為監(jiān)測非小細胞肺癌的分子標志物，且各分子也有望成為疾病治療新方向。