咖啡酸衍生物WSY6對H2O2誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞氧化損傷保護(hù)作用及潛在分子機(jī)制研究

陳小艷，惠 坤，馬科黨

(1.延安大學(xué)咸陽醫(yī)院皮膚科，陜西 咸陽 712000；2.陜西省中醫(yī)醫(yī)院皮膚科，陜西 西安 710003)

白癜風(fēng)是臨床常見的一種自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，極難治愈，發(fā)病率較高，損壞患者容貌，對患者的自尊心造成極大的傷害，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1-3]。目前研究顯示[4-5]，白癜風(fēng)發(fā)病的兩個重要因素包括免疫反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，其中氧化應(yīng)激損傷可引發(fā)黑素細(xì)胞損傷，已受到臨床的廣泛關(guān)注?？寡趸钚允潜頉]食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)的一項(xiàng)重要功能，同時EGCG可保護(hù)肝臟、抗突變、抗癌的作用，且可避免抗氧化活性傷害腎細(xì)胞[6]。但EGCG脂溶性較差，生物利用度低，難以被皮膚吸收，對藥物藥效的發(fā)揮造成影響。咖啡酸衍生物WSY6是一種新的衍生物，李成檀等[7]通過的研究提示，咖啡酸及其衍生物是一類重要的多酚化合物，分布廣泛，具有顯著的調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗炎癥等作用。但目前臨床關(guān)于咖啡酸衍生物WSY6是否具有抗氧化作用的相關(guān)報(bào)道較少。因此，本研究將探討咖啡酸衍生物WSY6對H2O2誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及潛在分子機(jī)制研究，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 我院泌尿外科健康人環(huán)切包皮人表皮黑素細(xì)胞，取材時已經(jīng)本人同意且簽訂知情同意書。美國Sigma公司生產(chǎn)的異丁基甲基黃嘌呤(IBMX)、二甲基亞砜(DMSO)、霍亂毒素；美國 Promega 公司生產(chǎn)的乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒、單溶液細(xì)胞增殖檢測(MTS)試劑盒；美國Gibco公司生產(chǎn)的胎牛血清、鏈霉素、青霉素及F12培養(yǎng)基；上海碧云天生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Western印跡上樣緩沖液、活性氧(ROS)檢測試劑盒；美國CST 公司生產(chǎn)的c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、磷酸化p38、caspase-9、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶 3(caspase-3)、細(xì)胞色素 C(Cyto-C)、抗β肌動蛋白、p53(p-p53、p-ERK、p-p38、p-JNK)抗體等Western印跡實(shí)驗(yàn)所用抗體；美國 LI-COR公司生產(chǎn)的Odyssey 雙色紅外熒光成像系統(tǒng)；浙江大學(xué)藥學(xué)院合成WSY6(純度>95%)；美國MD公司生產(chǎn)的Spectra Max酶標(biāo)儀；美國 BD 公司生產(chǎn)的Facsealibur 流式細(xì)胞儀。

1.2 人表皮黑素細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 將包皮壁沿虹膜剪下，設(shè)置溫度為37 ℃，采用0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)及0.25%胰酶將剪下的包皮壁消化10 min；刮下的真皮上及角質(zhì)層下的細(xì)胞采用立體顯微鏡下觀察，以離心率為1000 r/min離心5 min，將沉淀細(xì)胞收集并置入HU16培養(yǎng)基中培養(yǎng)，設(shè)置溫度為37 ℃，5%CO2培養(yǎng)后，接種至每孔1×104個細(xì)胞的96孔板，加入100 μl HU16培養(yǎng)液。培養(yǎng)12 h，細(xì)胞貼壁后將培養(yǎng)液吸棄，將 WSY6培養(yǎng)基(100、50、25、12.5、6.24、3.12、1.56、0.39、0 μmol/L)加入，培養(yǎng)1 d，將MTS 試劑加入，設(shè)置溫度為37 ℃培養(yǎng)60 min，A490值采用酶標(biāo)儀檢測。每組設(shè)置3個復(fù)孔，上述實(shí)驗(yàn)連續(xù)3次。細(xì)胞存活率=[研究組(不同濃度WSY6組)A490值-空白組A490值]/(H2O2組A490值-空白組A490值)×100%。

1.3 細(xì)胞存活率測定 將對數(shù)生長期的黑素細(xì)胞(每孔1×104個)接種于96孔板中，將其設(shè)置為25、12.5、6.25 μmol/L WSY6組、H2O2組及空白組，分別將25、12.5、6.25 μmol/L WSY6預(yù)處理1 h，清洗后(Hu16培養(yǎng)基)，將1 mmol/L H2O2分別加入WSY6組和H2O2組培養(yǎng)1 h，清洗3次(Hu16培養(yǎng)基)，將培養(yǎng)基分別加入WSY6組、H2O2組及空白組，培養(yǎng)24 h。加入MTS，37 ℃孵育1 h，A490值采用酶標(biāo)儀測定。每組復(fù)孔3個。計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.4 黑素細(xì)胞LDH水平測定 將對數(shù)生長期的黑素細(xì)胞(每孔1×104個)接種于96孔板中，將其設(shè)置為25、12.5、6.25 μmol/L WSY6組、H2O2組及空白組，分別將25、12.5、6.25 μmol/L WSY6預(yù)處理1 h，清洗后(Hu16培養(yǎng)基)，培養(yǎng)1 d，對各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH含量采用LDH試劑盒說明書測定，黑素細(xì)胞裂解液不做處理的LDH含量為100。將部分黑素細(xì)胞分為H2O2組和抑制劑組：先采用美國Selleck公司生產(chǎn)的SB203580 p38抑制劑對抑制組預(yù)處理1 h后，將1 mmol/L H2O2分別加入抑制劑組和H2O2組，清洗3次后(Hu16培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)1 d，各組LDH釋放量采用LDH試劑盒說明書測定，LDH釋放量=[研究組(不同濃度WSY6組)上清液A490-空白上清液A490]/(抑制劑組A490-H2O2組A490)×100%。

1.5 黑素細(xì)胞ROS水平測定 在以3×105個為每孔細(xì)胞數(shù)6孔板內(nèi)接種黑素細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后，將黑素細(xì)胞分為WSY6 組、空白組、H2O2組，分別將25、12.5、6.25 μmol/L WSY6預(yù)處理1 h，清洗后(Hu16培養(yǎng)基)，其中WSY6組采用25 μmol/L WSY6預(yù)處理1、2、4 h，H2O2組和WSY6組細(xì)胞再用1 mmol/L H2O2處理1 h，采用培養(yǎng)基清洗，將1 ml 10 mmol/L 2，7-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCF-DA)，設(shè)置溫度為37 ℃，在黑暗中培養(yǎng)30 min,將PBS懸浮細(xì)胞加入，胞內(nèi)ROS水平采用流式細(xì)胞儀測定。該實(shí)驗(yàn)需連續(xù)3次。

1.6 黑素細(xì)胞caspase-3、Cyto-C及caspase-9等蛋白水平采用Western印跡法測定 在每孔細(xì)胞數(shù)量為3×105個6孔板內(nèi)接種黑素細(xì)胞，將對數(shù)生長期的黑素細(xì)胞(每孔1×104個)接種于96孔板中，將其設(shè)置為25、12.5、6.25 μmol/L WSY6組、H2O2組及空白組，分別將25、12.5、6.25 μmol/L WSY6預(yù)處理1 h，清洗后(Hu16培養(yǎng)基)，完成后，收集裂解細(xì)胞，提取裂解細(xì)胞蛋白，電泳，轉(zhuǎn)入蛋白，5%脫脂奶粉，室溫封閉1 h，將一抗(兔抗人Cyto-C、p-ERK、p-p38、caspase-9、p-p53、caspase-3抗體、p-NK抗體及鼠抗人β肌動蛋白)，設(shè)置溫度為4 ℃孵育12 h，洗膜后，將山羊抗兔IgG抗體加入，孵育1 h后，掃描分析。以上實(shí)驗(yàn)為確保準(zhǔn)確性均需連續(xù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 0.39～50 μmol/L WSY6對黑素細(xì)胞存活率的影響 1 d后，0.39～50 μmol/L WSY6組細(xì)胞存活率與空白組比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.892，P>0.05)；加入100 μmol/L WSY6后細(xì)胞存活率與空白組比較顯著降低(t=15.588，P=0.004)，見表1。

表1 0.39～50 μmol/L WSY6對黑素細(xì)胞存活率的影響

2.2 不同濃度WSY6對氧化應(yīng)激下黑素細(xì)胞活性的影響 WSY6組細(xì)胞明顯優(yōu)于H2O2組(圖1)。H2O2組細(xì)胞存活性明顯低于空白組，而0.39～50 μmol/L WSY6預(yù)處理后，細(xì)胞存活率明顯高于H2O2組，且濃度越高細(xì)胞存活率越高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，見表2。

表2 不同濃度WSY6對黑素細(xì)胞存活率的影響

A：空白組，黑素細(xì)胞呈樹枝狀，樹枝連成網(wǎng)狀；B:H2O2組，細(xì)胞貼壁數(shù)量減少，樹突狀消失；C:12.5 μmol/L WSY6組，貼壁細(xì)胞增多，樹突無改變；D:為25 μmol/L WSY6組，增多的貼壁細(xì)胞，細(xì)胞狀態(tài)良好

2.3 不同濃度WSY6對黑素細(xì)胞LDH釋放量的影響 6.25～25 μmol/L WSY6細(xì)胞LDH釋放量均較空白組顯著升高，而較H2O2組均顯著降低(P<0.05)，且WSY6濃度越低則降低越明顯(r=-0.949，P<0.01)。p38抑制劑組和H2O2組黑素細(xì)胞LDH釋放量比較差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 不同濃度WSY6對黑素細(xì)胞LDH釋放量的影響

2.4 黑素細(xì)胞ROS水平受WSY6的影響 將空白組細(xì)胞內(nèi)ROS水平設(shè)定為1，對25 μmol/L WSY6預(yù)處理1、2和4 h后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平分別為7.61±0.87、6.32±0.32、5.21±0.32，H2O2組黑素細(xì)胞內(nèi)ROS水平上升至18.42±1.63，不同時間處理25 μmol/L WSY6與H2O2組比較均顯著降低(P<0.05)。黑素細(xì)胞內(nèi)ROS含量隨WSY6預(yù)處理時間越長而越低(r=-0.892，P<0.05)。

2.5 黑素細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)受WSY6的影響 黑素細(xì)胞僅少量表達(dá)caspase-3、Cyto-C及caspase-9采用H2O2處理，caspase-3、Cyto-C及caspase-9表達(dá)含量均明顯升高，但經(jīng)WSY6分別對caspase-3、Cyto-C及caspase-9處理后，caspase-3、Cyto-C及caspase-9表達(dá)均降低(圖2)。p-p38、p-ERK和p-JNK均采用H2O2對處理后，其表達(dá)水平均高于空白組(圖3)；對WSY6預(yù)處理后，H2O2WSY6濃度明顯低于p-p38的表達(dá)，H2O2WSY6濃度越低則H2O2WSY6表達(dá)越低，而p-JNK、p-ERK的表達(dá)無改變；而WSY6濃度升高后p38 MAPK下游產(chǎn)物p-p53的表達(dá)則降低。聯(lián)合WSY6或單獨(dú)H2O2處理JNK、ERK及p38總蛋白水平均無明顯變化。

1：空白組；2：H2O2組；3～5：16.25、12.5、25μmol/L WSY6組

圖3 p-p38、p-ERK和p-JNK均采用H2O2對處理后表達(dá)變化情況

3 討 論

白癜風(fēng)是一種常見的由表皮黑素細(xì)胞破壞造成的色素脫失性疾病。該病發(fā)病機(jī)制尚不清除，但與氧化應(yīng)激、神經(jīng)精神、免疫、遺傳、功能性黑素細(xì)胞凋亡和丟失等相關(guān)。目前氧化應(yīng)激學(xué)說已成為臨床研究的熱點(diǎn)及重點(diǎn)。趙曉菲等[8]通過的研究證實(shí)，氧化應(yīng)激機(jī)制在白癜風(fēng)中發(fā)揮重要作用，且與病情活動程度相關(guān)。咖啡酸衍生物是茶葉、咖啡、水果、蔬菜等植物中存在的常見形式，屬于中性酚類化合物，已有相關(guān)研究證實(shí)[9-11]，經(jīng)合成的咖啡酸酰胺可作為有效的抗氧化劑，而咖啡酸衍生物WSY6是一種新的衍生物，不僅具有較強(qiáng)的抗氧化作用，而且具有較強(qiáng)的抗菌活性。但咖啡酸衍生物WSY6是否對H2O2誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞氧化損傷具有保護(hù)作用及其機(jī)制的相關(guān)研究較少[12-14]。基于此，本研究探討咖啡酸衍生物WSY6對H2O2誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用及潛在分子機(jī)制研究，以提高治療效果，改善患者生活質(zhì)量，為白癜風(fēng)患者的治療提供新思路，對臨床白癜風(fēng)患者的治療具有重要意義及價值。

本研究結(jié)果顯示，采用100 μmol/L WSY6后，細(xì)胞存活率為(91.0±1.0)%，與空白組比較(P<0.05)，提示咖啡酸衍生物WSY6濃度越高，細(xì)胞存活率越高，細(xì)胞存活率與咖啡酸衍生物WSY6濃度密切相關(guān)。在白癜風(fēng)活動期皮損中過氧化氫酶水平降低，H2O2濃度可達(dá)到毫摩爾濃度，在黑素細(xì)胞自毀學(xué)說中氧化應(yīng)激被認(rèn)為是導(dǎo)致白癜風(fēng)患者表皮黑素細(xì)胞消失的始動因素[15-17]。因此，本研究設(shè)置H2O2組，以觀察咖啡酸衍生物WSY6對黑素細(xì)胞的影響情況。本研究結(jié)果顯示，WSY6組細(xì)胞明顯優(yōu)于H2O2組，保護(hù)效果隨濃度升高而越好；H2O2組細(xì)胞存活性明顯低于空白組，而不同濃度WSY6預(yù)處理后，細(xì)胞存活率明顯高于H2O2組，且濃度越高細(xì)胞存活率越高(P<0.05)，提示咖啡酸衍生物WSY6細(xì)胞存活率明顯優(yōu)于H2O2，且濃度越高，存活率越高。另外本研究對不同濃度WSY6對黑素細(xì)胞LDH釋放量的影響進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，H2O2處理后， 0.39～50 μmol/L WSY6細(xì)胞LDH釋放量均高于空白組(P<0.05)； 0.39～50 μmol/L WSY6預(yù)處理1 h后，不同濃度組LDH釋放量均低于H2O2組(P<0.05)，且WSY6濃度越低則降低越明顯(P<0.01)，提示咖啡酸衍生物WSY6抗黑素細(xì)胞氧化作用較好，對細(xì)胞內(nèi)LDH釋放量具有明顯的降低作用。

Schallreute等[18]通過的研究提示，白癜風(fēng)患者皮損部位存在H2O2，且可導(dǎo)致H2O2積累，其暴露會誘發(fā)黑素細(xì)胞胞內(nèi)ROS水平增加，增加潛在的細(xì)胞毒性，損傷細(xì)胞或?qū)е录?xì)胞凋亡。故治療白癜風(fēng)的一種有效手段是采用抗氧化劑去除ROS。本研究結(jié)果顯示，不同時間處理25 μmol/L WSY6與H2O2組比較(均P<0.05)；對WSY6預(yù)處理時間越長，黑素細(xì)胞內(nèi)ROS含量則越低(均P<0.05)，提示采用H2O2處理黑素細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加，給予WSY6預(yù)處理后，可明顯降低黑素細(xì)胞內(nèi)ROS水平，且隨著處理時間的延長，黑素細(xì)胞內(nèi)ROS含量則越低。

Mastore等[19]通過的研究提示，JNK、ERK1/2、p38 MAPK等MAPK家族成員在細(xì)胞黑素生成中發(fā)揮重要作用。Giovannelli等[20]通過的研究則提示，ROS堆積異常會刺激MAPK旁路，進(jìn)而影響基因表達(dá)，造成炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，黑素細(xì)胞僅少量表達(dá)caspase-3、Cyto-C及caspase-9，采用H2O2處理，caspase-3、Cyto-C及caspase-9表達(dá)含量均明顯升高，但經(jīng)WSY6分別對caspase-3、Cyto-C及caspase-9處理后，caspase-3、Cyto-C及caspase-9表達(dá)均降低；p-p38、p-ERK和p-JNK均采用H2O2處理后，其表達(dá)水平均高于空白組；對WSY6預(yù)處理后，H2O2WSY6濃度明顯低于p-p38的表達(dá)，H2O2WSY6濃度越低則H2O2WSY6表達(dá)越低，而p-JNK、p-ERK的表達(dá)無改變；而WSY6濃度升高后p38 MAPK下游產(chǎn)物p-p53的表達(dá)則降低，提示H2O2對黑素細(xì)胞JNK、ERK及p38 MAPK具有刺激作用，但WSY6預(yù)處理具有抑制H2O2介導(dǎo)的p38磷酸化。故在H2O2介導(dǎo)的黑素細(xì)胞凋亡中激活p38 MAPK可起到重要作用，而WSY6對黑素細(xì)胞的保護(hù)作用主要通過抑制p38 MAPK的活性發(fā)揮。

綜上所述，WSY6減弱H2O2介導(dǎo)的黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和凋亡，主要通過下調(diào)細(xì)胞ROS水平，對Cyto-C表達(dá)和p38 MAPK活性具有抑制作用，提示W(wǎng)SY6可為白癜風(fēng)的治療提供新思路。