血管生成素-2促進內皮細胞基質金屬蛋白酶-2表達實驗研究

吳皓宇，曹懌瑋，汪玲果，常鳳軍，刁佳宇

(陜西省人民醫(yī)院，陜西 西安 710068)

隨著我國社會老齡化和城市化進程速度加快，人們生活水平提高后居民不健康生活方式的普及，心血管危險因素普遍暴露，冠心病的發(fā)病率和病死率具有逐年升高并呈現(xiàn)出年輕化的態(tài)勢，已經進展為威脅人類健康的重要疾病。動脈粥樣硬化斑塊的形成是冠心病發(fā)病的重要病理基礎，深入研究動脈粥樣硬化斑塊形成的機制，早期干預動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生及穩(wěn)定性，建立有效防治動脈粥樣硬化的策略變得極為迫切。

基質金屬蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase-2，MMP-2)是基質金屬蛋白酶家族中重要的一員，主要來源于內皮細胞、血管平滑肌細胞和成纖維細胞等，是一種酶活性鋅離子依賴性肽鏈內切酶家族[1]。MMP-2具有多種生物學效應，生理狀態(tài)下參與機體的正常發(fā)育，當機體受到不利刺激或在病理條件下時MMP-2表達增加和活性增強，其主要功能是降解細胞外基質，影響細胞與細胞和基質之間的信號傳遞，對細胞的生長分化、遷移、黏附、損傷及修復等方面產生影響，在促進動脈粥樣硬化斑塊形成、降低斑塊穩(wěn)定性和促進惡性腫瘤轉移等方面起重要作用[2]。血管生成素-2(Angiopoietin，Ang-2)是血管生成素家族的一員，通過與血管內皮生長因子結合，促進新生血管生成。Ang-2本身能增加血管的通透性，增強單核細胞的生存能力，促進單核細胞遷移，同時增強腫瘤壞死因子-α誘導的單核細胞粘附等。因此Ang-2被認為是炎性因子，在動脈粥樣硬化形成過程中發(fā)揮作用，在急性冠脈綜合征患者中表達明顯增加[3]。Ang-2還在許多惡性腫瘤組織中表達增加，參與腫瘤組織的轉移，通過腫瘤病理組織分析發(fā)現(xiàn)，Ang-2可能通過整合素αvβ1促進MMP-2表達進而促進腫瘤轉移[4]，但在動脈粥樣硬化中缺乏相關研究。Ang-2和MMP-2在動脈粥樣硬化斑塊進展及穩(wěn)定性中的相互作用和關系目前僅局限于臨床觀察，缺乏具體機制的探討，尚無體外實驗依據。本研究通過細胞實驗探討Ang-2與MMP-2的關系及可能的作用機制，為進一步探討兩者在動脈粥樣硬化中的作用和關系提供實驗支持。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 人臍靜脈血管內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)購自武漢益普生物科技有限公司。Ang-2腺病毒和αvβ1 siRNA腺病毒購自賽業(yè)生物科技有限公司?？笰ng-2、αvβ1和MMP-2多克隆抗體購自Abcam公司。

1.2 HUVECs培養(yǎng)和分組 HUVECs接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，細胞貼壁生長，將培養(yǎng)基置于5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中。細胞長至融合時用0.25%胰蛋白酶消化、傳代。HUVECs形態(tài)為多角形，單層緊密排列。當細胞匯合度達到80%左右時，終止消化，用移液器頭端吹打培養(yǎng)瓶底部，成為細胞懸液。將細胞接種于12孔培養(yǎng)板中(每孔200 μl，密度約為105/ml細胞)，將其分為四組：①對照組(NC):未干預的HUVECs；②空腺病毒轉染組(Ad)：空腺病毒(50 pfu/ml)轉染HUVECs；③Ang-2腺病毒轉染組(Ad-Ang-2)：Ang-2腺病毒(50 pfu/ml)轉染HUVECs；④αvβ1 siRNA+Ang-2腺病毒轉染組(Ad-αvβ1 siRNA+Ang-2)：αvβ1 siRNA和Ang-2腺病毒(各50 pfu/ml)共同轉染HUVECs。每組6個復孔，然后將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中72 h。

1.3 Western blot檢測蛋白表達水平 將培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出，丟掉上清液，加入蛋白裂解液，移至1.5 ml離心管中，離心10 min，將上清液移至新的離心管中。于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。用Western blot法檢測Ang-2、αvβ1和MMP-2蛋白表達水平，以化學發(fā)光模式測定結果，分別與GAPDH蛋白條帶灰度比值作為半定量結果。為方便分析，對照組與GAPDH蛋白條帶灰度比值轉換為1，其余組等比例轉換。

2 結 果

2.1 四組Ang-2蛋白表達水平比較 Western blot法檢測Ang-2和αvβ1 siRNA腺病毒轉染HUVECs對Ang-2表達水平的影響。結果顯示空腺病毒轉染HUVECs后，Ang-2表達水平較對照組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。Ang-2腺病毒轉染HUVECs后，Ang-2表達水平較對照組明顯升高(P<0.05)，說明Ang-2腺病毒轉染有效，能促進HUVECs表達Ang-2。αvβ1 siRNA和Ang-2腺病毒共同轉染HUVECs后，Ang-2表達水平較對照組明顯升高(P<0.05)，但與Ang-2腺病毒轉染組比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，說明αvβ1 siRNA不影響Ang-2表達(圖1)。

注：與NC組比較，*P<0.05

2.2 四組αvβ1蛋白表達水平比較 Western blot法檢測Ang-2和αvβ1 siRNA腺病毒轉染HUVECs對αvβ1蛋白表達水平的影響。結果顯示空腺病毒轉染HUVECs后，αvβ1表達水平較對照組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。Ang-2腺病毒轉染HUVECs后，αvβ1表達水平較對照組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，說明Ang-2腺病毒轉染HUVECs后能使Ang-2表達水平升高但不影響αvβ1水平。αvβ1 siRNA和Ang-2腺病毒共同轉染HUVECs后，αvβ1表達水平較對照組明顯下降(P<0.05)，說明αvβ1 siRNA腺病毒轉染有效，能抑制HUVECs表達αvβ1(圖2)。

注：與NC組比較，*P<0.05

2.3 四組MMP-2蛋白表達水平比較 Western Blot法檢測Ang-2和αvβ1 siRNA腺病毒轉染HUVECs對MMP-2表達水平的影響。結果顯示空腺病毒轉染HUVECs后，MMP-2表達水平較對照組無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。Ang-2腺病毒轉染HUVECs后，MMP-2表達水平較對照組明顯升高(P<0.05)，說明Ang-2腺病毒轉染后能促進HUVECs表達Ang-2的同時還能促進MMP-2表達。αvβ1 siRNA和Ang-2腺病毒轉染HUVECs后，MMP-2蛋白表達水平較Ang-2腺病毒轉染組明顯下降(P<0.05)，說明αvβ1 siRNA腺病毒轉染后低水平的αvβ1能抑制HUVECs表達MMP-2(圖3)。

注：與NC組比較，*P<0.05；與Ad-Ang-2組比較，△P<0.05

3 討 論

動脈粥樣硬化作為冠心病發(fā)病的基礎，其發(fā)生是多種因素參與的長期慢性過程，主要涉及血管內皮損傷、內皮下脂質沉積、炎性因子激活、單核細胞激活和遷移以及平滑肌細胞增殖和遷移等[5-6]。MMP-2作為基質金屬蛋白酶家族的主要成員，其主要作用是降解細胞外基質，能夠降解膠原、纖維蛋白和彈性蛋白，破壞基底膜，有利于脂質在內皮下沉積、單核細胞遷移至內皮下形成巨噬細胞，巨噬細胞內吞脂質形成泡沫細胞，同時各種生長因子刺激血管平滑肌細胞增殖，引起動脈粥樣硬化斑塊形成[7-8]。MMP-2還可以促進白介素、腫瘤壞死因子-α等炎癥因子的釋放，加重炎癥反應，加速動脈粥樣硬化斑塊的形成[9]。由此可見MMP-2在促進動脈粥樣硬化斑塊形成過程中具有重要作用。MMP-2在動脈粥樣硬化斑塊的肩部區(qū)域表達明顯增加，通過特異性分解Ⅳ型膠原，降解細胞外基質，能夠降低斑塊的穩(wěn)定性，引起斑塊破裂，導致急性冠脈綜合征的發(fā)生[10-11]。因此，MMP-2能促進動脈粥樣硬化斑塊形成和降低斑塊穩(wěn)定性。

Ang-2是一種具有血管活性的因子，參與血管的新生到成熟，但其首先是在腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)，目前已在胃癌、肝癌、乳腺癌、膠質瘤、非小細胞肺癌等多種腫瘤組織中檢測到Ang-2的存在，尤其是在許多惡性腫瘤組織中高表達，認為其具有促進腫瘤組織快速增殖、轉移和侵襲的作用[12-13]。Hu等[14]首先通過分析大量人腦膠質瘤組織，發(fā)現(xiàn)腫瘤侵襲區(qū)域Ang-2表達量均明顯升高，同時MMP-2的表達水平也明顯增加，兩者具有明顯的相關性。體外實驗發(fā)現(xiàn)Ang-2重組病毒質粒轉染的膠質瘤細胞可引起MMP-2的表達量明顯增加，同時腫瘤的侵襲能力也相應增強。相反，加入MMP-2抑制劑，能明顯抑制腫瘤的侵襲。這些結果表明，Ang-2在誘導腫瘤細胞浸潤中起著關鍵作用，并且這種作用可能是通過促進MMP-2的表達引起的。Hu等[4]隨后通過人腦膠質瘤組織發(fā)現(xiàn)，Ang-2可能通過與整合素αvβ1結合促進MMP-2表達和分泌。

Ang-2除了在血管新生和腫瘤轉移中起作用，還影響動脈粥樣硬化斑塊形成和穩(wěn)定性[15-17]。Theelen等[18]通過高脂飲食構建動脈粥樣硬化小鼠模型，腹腔注射Ang-2阻斷性抗體來阻斷Ang-2與其受體結合，從而抑制Ang-2的生理功能。結果發(fā)現(xiàn)Ang-2的生理作用被阻斷后，小鼠甘油三酯水平明顯降低，同時還能改善內皮細胞功能和抑制單核細胞遷移，認為Ang-2可促進動脈粥樣硬化斑塊的形成。Lee等[19]對126例急性冠脈綜合征患者(82例急性心肌梗死和44例不穩(wěn)定型心絞痛)外周血Ang-2水平進行了分析，并與40例穩(wěn)定型心絞痛患者和40例健康對照者進行對比，結果顯示急性冠脈綜合征患者Ang-2水平明顯增高，且急性心肌梗死患者升高更明顯。Zeng等[20]通過研究也發(fā)現(xiàn)冠心病患者外周血Ang-2表達水平較健康人群明顯升高，血漿Ang-2濃度與冠狀動脈狹窄程度顯著正相關，且冠狀動脈介入治療后血漿Ang-2濃度明顯降低。我們前期對84例急性冠脈綜合征患者(急性心肌梗死患者和不穩(wěn)定型心絞痛患者各42例)、42例穩(wěn)定型心絞痛患者和45名健康對照者血漿Ang-2和MMP-2濃度進行分析，發(fā)現(xiàn)急性冠脈綜合征患者Ang-2和MMP-2水平均明顯升高，急性心肌梗死患者升高更明顯，且Ang-2與MMP-2水平呈顯著的正相關[21]。

結合Ang-2和MMP-2在腫瘤中的作用，本研究進一步探討內皮細胞Ang-2和MMP-2的相互作用關系。體外培養(yǎng)HUVECs，通過轉染Ang-2腺病毒和αvβ1 siRNA腺病毒來調控Ang-2和αvβ1表達水平，觀察對MMP-2表達的影響。結果顯示Ang-2腺病毒轉染HUVEC后能升高Ang-2水平，提示Ang-2腺病毒轉染有效，還能促進MMP-2蛋白表達，但對整合素αvβ1無影響。當加入αvβ1 siRNA腺病毒抑制αvβ1表達后，MMP-2表達水平也明顯下降。因此,本研究結果發(fā)現(xiàn)Ang-2能促進內皮細胞MMP-2的表達，可能通過與整合素αvβ1結合有關。