沙蔥螢葉甲核糖體蛋白基因GdRpS3a的克隆、分子特性及表達分析

馬紅悅，李 玲，烏亞汗，田 羽，李艷艷，龐保平*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學草原昆蟲研究中心, 呼和浩特 010020; 2.內(nèi)蒙古鑲黃旗草原工作站, 內(nèi)蒙古鑲黃旗 013250)

核糖體蛋白S3a(RpS3a)是一種核糖體小亞基蛋白，除參與蛋白質(zhì)合成外，還有許多生理功能，如細胞凋亡(Naoraetal., 1998)、細胞轉(zhuǎn)化(Lecomteetal., 1997)、卵子形成(Reynaudetal., 1997；Zuritaetal., 1997)、信號傳導(Norihisaetal., 2002)及免疫功能(Huetal., 2000)等。目前，從高等的哺乳動物到低等的細菌，已有許多物種的S3a基因被成功解析，并且S3a蛋白的一些核糖體外的功能也得到了證實(朱保健等，2010)。然而，目前昆蟲核糖體蛋白的研究較少，且主要集中于模式昆蟲-黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(Schmidtetal., 1996; Reynaudetal., 1997; van Beestetal., 1998; 李艷紅, 2014)、經(jīng)濟昆蟲-家蠶Bombyxmori(Yang and Sehnal, 1998)、柞蠶Antheraeapernyi(朱保建等, 2010)和衛(wèi)生害蟲-尖音庫蚊Culexpipiens(Robichetal., 2007; Heetal., 2009; Kimetal., 2010; Kim and Denlinger, 2010)、埃及伊蚊Aedesaegyptt(Mazzacano and Fallon, 1996; Niu and Fallon, 2000)、家蠅Muscadomestica(胡亞等, 2016)及麻蠅Sarcophagacrassipalpis(Craiq and Denlinger, 2000)等，對農(nóng)業(yè)害蟲核糖體蛋白的研究僅限于對幾種主要害蟲核糖體蛋白基因的克隆及表達譜分析，如煙草天蛾Manducasexta(Song and Gilbert, 1997)、地中海實蠅Ceratitiscapitate(Gagouetal., 2000; Verrasetal., 2004)、菜蛾(Wangetal., 2005)、甜菜夜蛾Spodopteraexigua(潘湛清等, 2008)、粘蟲Mythimnaseparata(李柯等, 2010; 李柯, 2012)、褐飛虱Nilaparvatalugens(朱家俊等, 2016; Zhuetal., 2017)及松墨天牛Monochamusalternatus(羅淋淋等, 2016)等。

滯育是昆蟲為躲避不利的環(huán)境條件而暫時停止發(fā)育的季節(jié)性適應策略，在昆蟲生命活動中起著重要作用。然而，核糖體蛋白在昆蟲滯育中的作用卻很少了解。Robich等(2007)首次發(fā)現(xiàn)RpS3a在尖音庫蚊滯育初期顯著下調(diào)。Kim等(2010)進一步證實，RpS3a在非滯育雌成蟲中持續(xù)表達，而在滯育初期(成蟲羽化后7～10 d)急劇下調(diào)，應用RNAi沉默RpS3a可使非滯育雌蟲卵泡停止發(fā)育，但沉默效應只有10 d，RNAi短暫的RpS3a抑制不能持續(xù)地阻止卵巢發(fā)育，并且外用保幼激素可抵消RpS3a的干擾效應。卵巢發(fā)育停止是成蟲滯育的主要特征(Kimetal., 2010)，上述研究表明核糖體蛋白可能在昆蟲成蟲滯育中起著重要作用。

沙蔥螢葉甲Galerucadaurica(Joannis)屬鞘翅目Coleoptera葉甲科Chrysomelidae螢葉甲亞科Galerucinae，是近年來在內(nèi)蒙古草原上猖獗成災的新害蟲，主要啃食沙蔥Alliummongolium、多根蔥A.polyrhizum、野韭A.ramosum等百合科蔥屬牧草(昊翔等, 2015)。沙蔥螢葉甲一年發(fā)生一代，以卵滯育越冬(高靖淳等, 2015; Zhouetal., 2016)，幼蟲最早于4月上中旬開始出現(xiàn)，夏季成蟲羽化取食約7～10 d后停止取食活動，聚集于草叢、牛糞及石塊下滯育越夏，為專性滯育；成蟲羽化約80～90 d后滯育解除，開始取食、交配及產(chǎn)卵(陳龍等, 2018a；Maetal., 2019)。目前對沙蔥螢葉甲成蟲夏滯育及其機理的了解還很少，主要集中在不同滯育階段體內(nèi)糖類、蛋白、脂肪含量(陳龍等, 2018a)及海藻糖酶(陳龍等, 2018b)和熱激蛋白(陳龍等, 2019)基因表達量的變化。本研究前期應用蛋白組學技術分析了沙蔥螢葉甲成蟲夏滯育不同階段蛋白組成的變化，結果發(fā)現(xiàn)多個核糖體蛋白差異表達(Maetal., 2019)。因此，本試驗擬克隆沙蔥螢葉甲RpS3a基因，分析其在沙蔥螢葉甲不同發(fā)育階段及不同溫度脅迫下的表達特性，以期為進一步揭示RpS3a在沙蔥螢葉甲生長發(fā)育及其夏滯育中的調(diào)控作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗所用的供試沙蔥螢葉甲越冬卵于2019年 4月采自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟鑲黃旗草原。將越冬卵置于溫度25℃±1℃、相對濕度70%±5%、光周期為14 L∶10 D的PRX-350C智能型人工氣候箱(寧波海曙賽福實驗儀器廠)中孵育，幼蟲孵化后以沙蔥飼養(yǎng)。期間收集：(1)發(fā)育階段：卵、幼蟲1～3齡、預蛹、蛹、成蟲羽化3、7、10、15、25、40、60、80和100 d。每組3個生物學重復，每個生物學重復：卵50粒，1～3齡幼蟲各5～10頭，預蛹和蛹各5頭，成蟲4頭(♀∶♂=2∶2)。(2)溫度處理：選擇羽化3 d的成蟲，分別在0、5、10、15、20、25、30、35及40℃處理1 h，每組3個重復，每個重復雌雄各2頭。用液氮迅速冷凍后置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit, PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time), SMARTer?RACE 5′/3′ Kit User Manual, TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit, pMD19-T Vector Cloing Kit, DNA 2000 Marker等均購自大連TaKaRa有限公司；PGEM-T Easy載體，T7 RiboMAXTM Express RNAi System試劑盒，GoTaq?qPCR Master Mix(2×), T4 DNA連接酶等均購自美國Promega公司；Taq PCR Master Mix(2×, blue dye)購自上海生工有限公司；感受態(tài)細胞DH5α購自Tiangen生化科技有限公司。

1.3 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

將1.1節(jié)中超低溫凍存的樣品分別用液氮研磨，采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit試劑盒提取總RNA，使用分光光度計(NanoPhotometerTMP-Class)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的濃度及完整性。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)說明書操作，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第1鏈，并置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 沙蔥螢葉甲RpS3a中間片段的克隆

根據(jù)本實驗室建立的沙蔥螢葉甲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選注釋為沙蔥螢葉甲RpS3a的基因序列，并通過NCBI網(wǎng)站序列進行比對鑒定。利用Primer Premier 5.0軟件設計引物RpS3a-F和RpS3a-R(表1)，引物由上海生工生物有限公司合成。反應體系(25 μL): PCR Master Mix 12.5 μL, 上/下游引物(0.2 μmol/L)各1 μL，cDNA模板1 μL(100 ng/μL)和RNase-free Water 9.5 μL。PCR反應程序：94℃預變性5 min; 94℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸1 min, 30個循環(huán); 72℃延伸10 min，4℃保存。PCR反應結束后，將產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將目的DNA片段純化、回收后連接pMD?19-T載體并且轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5α，吸取200 μL菌液涂平板，在37℃下倒置過夜培養(yǎng)12～16 h，待菌落長出后，進行藍白斑篩選，挑取陽性克隆菌落并PCR驗證后，送至北京六合華大基因有限公司測序。

1.5 沙蔥螢葉甲RpS3a的3′端序列和5′端序列克隆

以沙蔥螢葉甲成蟲羽化3 d的RNA為模板，利用SMARTer?RACE 5′/3′ Kit User Manual試劑盒合成5′-RACE-Ready cDNA和3′-RACE-Ready cDNA。根據(jù)測序驗證后的中間片段，分別設計5′/3′特異性引物(gene-specific primer, GSP)和嵌套基因特異性引物(nested gene-specific primer, NGSP)(表1)。分別用試劑盒中自帶的10×Universal Primer A Mix(UPM)引物和特異性引物GSP配對進行Touchdown PCR。反應體系共50 μL：5′-or 3′-RACE-Ready cDNA 2.5 μL，10×UPM 5 μL，5′ or 3′ GSP(10 μmol/L)1 μL，Master Mix 41.5 μL。反應程序：94℃ 30 s變性，70℃ 3 min延伸，5個循環(huán)；94℃ 30 s變性，70℃ 30 s退火，72℃ 3 min延伸，5個循環(huán)；94℃ 30 s變性，68℃ 30 s退火，72℃ 3 min延伸，25個循環(huán)。用Tricine-EDTA稀釋Touchdown PCR反應產(chǎn)物15倍為模板，以試劑盒自帶short引物和NGSP為配對進行巢式PCR反應，反應體系同1.4節(jié)，反應程序：90℃ 5 min預變性，90℃ 30 s變性，68℃ 30 s退火，72℃ 3 min延伸，30個循環(huán)。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物后，純化回收目的片段、連接載體、轉(zhuǎn)化、測序等同1.4。

表1 引物信息

1.6 生物信息學分析

利用NCBI ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預測沙蔥螢葉甲RpS3a的開放閱讀框，采用NCBI中的BlastP(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)和DNAMAN 6.0(Lynnon Biosoft，加拿大)進行同源性分析及序列比對，使用在線軟件SignalIP 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預測沙蔥螢葉甲RpS3a的信號肽序列，運用DNAMAN 6.0軟件(Lynnon Biosoft，加拿大)進行分子量和等電點的預測，蛋白跨膜區(qū)分析采用TMHMM在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)，用Phylosuite軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹(貝葉斯法MrBayes)，1 000次抽樣分析(Zhangetal., 2020)。

1.7 沙蔥螢葉甲RpS3a的表達譜分析

利用熒光定量技術(qPCR)檢測RpS3a在沙蔥螢葉甲不同發(fā)育時期以及不同溫度下的相對表達量。定量實驗在FTC-3000實時熒光定量PCR儀(Funglyn Biotech, 加拿大)上進行。qPCR特異性引物為qRpS3a-F/qPRS3a-R，內(nèi)參為SDHA(Tanetal., 2017)，反應體系(20 μL): cDNA模板2 μL, qRpS3a-F和qRpS3a-R引物(10 μmol/L)各0.4 μL, GoTaq?qPCR Master Mix 10 μL, ddH2O 7.2 μL。反應程序：95℃預變性3 min，95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)；95℃ 15 s，65℃ 15 s，95℃ 15 s。每個處理3個生物學重復，進行4次技術重復，采用2-ΔΔCt方法進行定量分析(Livak and Schmittgen, 2001)。

1.8 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 20.0進行單因素方差分析，Duncan法進行多重比較，數(shù)據(jù)結果用平均值±標準誤(SE)表示，顯著水平P<0.05。

2 結果與分析

2.1 沙蔥螢葉甲RpS3a的cDNA全長克隆及序列分析

根據(jù)沙蔥螢葉甲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選注釋為沙蔥螢葉甲RpS3a的基因序列，設計引物進行中間片段的PCR擴增，獲得目的片段的大小為690 bp，所得測序結果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中的序列信息完全一致。在3′和5′ RACE中分別獲得350 bp和170 bp兩個片段，通過序列拼接及測序驗證得到RpS3a的cDNA全長序列，命名為GdRpS3a(GenBank登錄號為：MN660144)。GdRpS3a的全長為800 bp，開放閱讀框(open-reading frame, ORF)為687 bp，共編碼228個氨基酸，5′非編碼區(qū)(untranslated region, UTR)長度為58 bp，3′ UTR長度為55 bp；具有核糖體蛋白S3a家族的保守功能域。推測的編碼蛋白分子量為25.63 kDa，預測等電點(pI)為10.53。SignalIP 4.1 Server預測結果顯示該蛋白無信號肽。TMHMM在線軟件分析蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域結果表明，GdRpS3a不含跨膜結構。

2.2 GdRpS3a的同源序列對比及系統(tǒng)進化分析

利用NCBI Blast同源性搜索，得到其它8個同為鞘翅目物種的RpS3a序列，利用DNAMAN軟件進行氨基酸序列比對。結果顯示，沙蔥螢葉甲RpS3a的氨基酸序列與同一亞科的玉米根螢葉甲DiabroticavirgiferavirgiferaRpS3a的一致性最高，為54.10%；其次是馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata和光肩星天牛Anoplophoraglabripennis，同為52.99%。此外，白楊葉甲Chrysomelatremula、小蜂窩甲蟲Aethinatumida、米象Sitophilusoryzae、山松大小蠹Dendroctonusponderosae、赤擬谷盜Triboliumcastaneum的氨基酸一致性分別為49.44%、49.25%、43.98%、42.32%和41.20%(圖1)。

圖1 沙蔥螢葉甲與其它昆蟲RpS3a的氨基酸序列比對

所建立的系統(tǒng)發(fā)育樹表明(圖2)：沙蔥螢葉甲RpS3a與玉米根螢葉甲的RpS3a親緣關系最近，首先聚為一分支，置信度為83%；然后與同為葉甲科的馬鈴薯甲蟲聚在一起，再與白楊葉甲聚為一大分支，在一定程度上反應其親緣關系。

圖2 基于氨基酸序列構建沙蔥螢葉甲與其它昆蟲RpS3a的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 沙蔥螢葉甲RpS3a在不同發(fā)育階段的表達模式

RpS3a在沙蔥螢葉甲的不同發(fā)育階段均有表達，且存在顯著差異(P<0.05)。成蟲滯育結束后(80 d和100 d)表達量最高，其次60日齡成蟲、幼蟲、預蛹和蛹，最低為卵和3～40日齡成蟲(圖3)。

圖3 GdRpS3a在沙蔥螢葉甲不同發(fā)育階段的表達水平

2.4 不同溫度下沙蔥螢葉甲RpS3a的表達模式

沙蔥螢葉甲成蟲經(jīng)不同溫度處理1 h后，GdRpS3a的相對表達量存在顯著差異(P<0.05)，其中30℃下表達量最高，約為常溫對照25℃的10倍；其次為15℃，約為對照的6倍；最低為0℃和25℃；其它溫度處理間表達量差異不顯著(P>0.05)(圖4)。

圖4 沙蔥螢葉甲GdRpS3a在不同溫度下的表達水平

3 結論與討論

核糖體蛋白在生物體內(nèi)普遍存在且種類繁多，參與一系列的生命過程，包括細胞凋亡、調(diào)控轉(zhuǎn)錄、惡性轉(zhuǎn)化及免疫應答等細胞功能(Warner and Mclntosh, 2009)。核糖體蛋白S3a存在于40S的核糖體亞基上，在蛋白質(zhì)翻譯過程中起著重要作用，是生命體中蛋白質(zhì)合成和細胞代謝的重要調(diào)控因子(Shemeretal., 2000)。本研究通過RACE技術，首次從沙蔥螢葉甲中成功克隆了RpS3a的cDNA全長序列。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，沙蔥螢葉甲RpS3a與玉米根螢葉甲RpS3a的親緣關系上最近，二者同屬于鞘翅目葉甲科螢葉甲亞科。該基因編碼的氨基酸序列與玉米根螢葉甲、馬鈴薯甲蟲等物種的RpS3a序列進行比對，存在一個RpS3a蛋白家族的保守功能域。因此，本研究所克隆的基因?qū)儆诤颂求w蛋白S3a家族中的一員。

核糖體蛋白主要作用是參與蛋白質(zhì)的合成，但許多核糖體蛋白還具有次要功能(Wool, 1996)。RpS3a在果蠅Drosophilidae的整個發(fā)育過程中均有表達(van Beestetal., 1998)，特別是在胚胎發(fā)育過程和卵巢發(fā)育的雌成蟲中高表達，是卵子形成必需的(Reynaudetal., 1997)。隨后在其他昆蟲中的研究中也獲得了類似的結果，如：地中海實蠅CcRpS21在胚胎和幼蟲中的表達量高于蛹和成蟲，且雌成蟲高于雄成蟲(Verrasetal., 2004)；一種搖蚊Chironomusriparius的RpL11、RpL13、RpS3和RpS6在胚胎形成過程中的表達量顯著高于幼蟲、蛹和成蟲(Martínez-Guitarteetal., 2007; Park and Kwak, 2012)；尖音庫蚊RpS4在卵中高表達而在幼蟲中低表達(Huetal., 2007)；褐飛虱NlRPL5在抱卵的雌成蟲中最高，其次為若蟲，雄成蟲和剛羽化的雌成蟲最低；RNAi沉默該基因?qū)е侣殉舶l(fā)育遲緩、產(chǎn)卵量下降(Zhuetal., 2017)。上述研究表明，核糖體蛋白與昆蟲生長發(fā)育，特別是與胚胎發(fā)育有關。通過對沙蔥螢葉甲GdRpS3a在整個生命周期中的表達檢測發(fā)現(xiàn)，幾乎在整個昆蟲的發(fā)育階段都有表達。本研究中，GdRpS3a在沙蔥螢葉甲不同發(fā)育階段差異表達，卵及羽化40 d內(nèi)成蟲中的表達量顯著低于幼蟲、預蛹、蛹及羽化60 d后成蟲中的表達量。前期研究表明，沙蔥螢葉甲成蟲秋季產(chǎn)卵后即以卵滯育越冬，越冬卵必須經(jīng)過秋冬季的低溫才能解除滯育(Zhouetal., 2016)。夏季成蟲羽化后大量取食，約羽化7～10 d后停止取食或少量取食，活動停止，進入專性滯育狀態(tài)。羽化約80～90 d后結束滯育，開始逐漸取食、交尾產(chǎn)卵等(陳龍等, 2018a)。核糖體蛋白在細胞分化活躍的組織中高表達(Jainetal., 2004; Martínez-Guitarteetal., 2007)。因此，GdRpS3a在細胞分化基本停滯的滯育卵和滯育前(3 d和7 d)及滯育前、中期(10、15、25和40 d)的成蟲中表達量低而在生長發(fā)育較快的幼蟲期、預蛹期、蛹期以及滯育后期(60 d)和解除后的成蟲期(80 d和100 d)高表達是合理的。Reynaud等(1997)也發(fā)現(xiàn)RpS3a在未滯育的雌蚊中高表達，而在滯育的雌蚊中低表達。蛋白組學研究表明，包括RpS3a在內(nèi)的多種核糖體蛋白在滯育解除后上調(diào)表達(Maetal., 2019)。因此，可認為RpS3a上調(diào)表達可能促進了沙蔥螢葉甲成蟲卵巢的發(fā)育，隨著卵巢的發(fā)育，成蟲夏滯育逐漸解除。但該推論還需通過對卵巢的解剖觀察及其它實驗進一步驗證。

溫度是影響昆蟲生長發(fā)育及繁殖的重要因素之一。然而，目前溫度對核糖體蛋白表達影響的研究卻很少。本研究中，溫度對沙蔥螢葉甲GdRpS3a的表達有顯著影響，但沒有一定的規(guī)律性，表達量不隨溫度的上升而升高或下降。GdRpS3a在30℃下表達量最高，而超過30℃(35℃和40℃)表達量下降，這可能是因為高溫不利于昆蟲的生長發(fā)育。而Martínez-Guitarte等(2007)的研究卻表明35℃高溫對搖蚊RpL11和RpL13的表達無顯著影響。造成差異的原因可能與核糖體蛋白或昆蟲種類不同有關。