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    橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)中可培養(yǎng)細(xì)菌的分離鑒定

    2021-10-20 13:28:12楊海燕胡凱平宋水林王廣利王建國李小珍
    環(huán)境昆蟲學(xué)報 2021年5期
    關(guān)鍵詞:生殖系統(tǒng)實蠅雌雄

    楊海燕,胡凱平,宋水林,王廣利,徐 業(yè),王建國,李小珍*

    (1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,南昌 330045;2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)產(chǎn)業(yè)處,南昌 330045)

    昆蟲生殖系統(tǒng)是內(nèi)生細(xì)菌生長、發(fā)生和繁殖的理想場所,在長期特定環(huán)境的進(jìn)化過程中,昆蟲生殖系統(tǒng)與內(nèi)生細(xì)菌之間相互選擇、相互適應(yīng),導(dǎo)致不同來源、不同性別、不同發(fā)育階段昆蟲生殖系統(tǒng)內(nèi)生細(xì)菌屬種存在差異(Huangetal., 2010)。在昆蟲生殖系統(tǒng)中,不同內(nèi)生細(xì)菌屬種,具有不同生理功能。例如,豆蚜Acyrthosiphonpisum生殖系統(tǒng)共生菌Buchneraaphidicola能促進(jìn)豆蚜的生長和繁殖(Douglas, 1996; Russelletal., 2013);地中海實蠅Ceratitiscapitata生殖系統(tǒng)中克雷伯氏菌Klebsiellaoxytoca能夠延長成蟲壽命,提高成蟲交配能力(Beharetal., 2008);伯克氏菌屬Burkholderia能夠促進(jìn)昆蟲生殖系統(tǒng)卵黃生成素的沉積,提高昆蟲的產(chǎn)卵能力(Leeetal., 2017)。因此,研究雌雄昆蟲生殖系統(tǒng)內(nèi)生細(xì)菌屬種及內(nèi)生細(xì)菌在性別間的差異,對進(jìn)一步探索昆蟲生殖系統(tǒng)內(nèi)生細(xì)菌的功能,及其對昆蟲生殖行為和生殖能力的調(diào)控有積極意義。

    橘小實蠅Bactroceradorsalis(Hendel)屬雙翅目Diptera實蠅科Tephritidae,是美國、日本和韓國等國家的重要檢疫性害蟲(張彬等, 2008; Wanetal., 2011)。橘小實蠅寄主多,能夠為害柑橘、芒果和楊桃等46科250多種果蔬作物(胡凱平等, 2019; Zidaetal., 2020);成蟲營兩性生殖,具有極強(qiáng)的繁殖和擴(kuò)張能力,每雌可產(chǎn)卵400~1 800粒,每年可擴(kuò)張50~100 km(Duycketal., 2004; Lietal., 2019)。橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)中的內(nèi)生細(xì)菌存在差異,能夠調(diào)控橘小實蠅種群的生殖行為和生殖能力,進(jìn)而影響到種群在田間的發(fā)生、危害與擴(kuò)張(Yaoetal., 2016)。目前橘小實蠅腸道內(nèi)生細(xì)菌已經(jīng)受到科研人員的廣泛關(guān)注(Wangetal., 2011; Wangetal., 2014);而生殖系統(tǒng)內(nèi)生細(xì)菌的研究相對較少。僅王莉莉(2011)研究了室內(nèi)飼養(yǎng)的橘小實蠅生殖系統(tǒng)中的細(xì)菌群落,并在雌性成蟲生殖系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)植生拉烏爾菌Raoultellaplanticola、產(chǎn)氣腸桿菌Enterobacteraerogenes、日溝維腸桿菌E.gergoviae和河生腸桿菌E.amnigenus等10種可培養(yǎng)菌群;而Shietal.(2012)發(fā)現(xiàn),橘小實蠅雌性生殖系統(tǒng)的5種內(nèi)生細(xì)菌,包括土生拉烏爾菌R.terrigena、產(chǎn)酸克雷伯氏菌K.oxytoca和肺炎克雷伯菌K.pneumoniae等的代謝產(chǎn)物,對橘小實蠅成蟲本身具有一定的引誘作用。這些研究為揭示橘小實蠅生殖系統(tǒng)內(nèi)生細(xì)菌的群落構(gòu)成,分析內(nèi)生細(xì)菌的生理功能提供了信息。

    然而,由于橘小實蠅生殖系統(tǒng)內(nèi)生細(xì)菌群落受眾多外界因素影響,致使特定環(huán)境條件下橘小實蠅生殖系統(tǒng)內(nèi)生細(xì)菌的組成存在差異。本研究以來源于江西贛南臍橙基地、以臍橙為主要食料的橘小實蠅為研究對象,采用LB培養(yǎng)基,對橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)中的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離培養(yǎng),分析菌株16S rRNA基因擴(kuò)增序列,明確橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)內(nèi)生細(xì)菌的多樣性與差異,為進(jìn)一步研究橘小實蠅生殖系統(tǒng)內(nèi)生細(xì)菌在生殖調(diào)控中的作用奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 采集橘小實蠅樣本

    橘小實蠅樣本采集時間為2018年9月中旬,采集地點(diǎn)為江西贛南臍橙基地(東經(jīng)114°00′~114°40′,北緯25°42′~26°01′)。采集橘小實蠅樣本時,收集攜帶橘小實蠅卵和幼蟲的贛南臍橙果實,帶回江西農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲實驗室,在溫度28℃±1℃、相對濕度60%~90%和自然光照條件下,用贛南臍橙果實果肉組織飼養(yǎng);老熟幼蟲轉(zhuǎn)移到用高溫消毒后的沙土中,化蛹;成蟲用酵母粉、清水和濃度為15%蜂蜜稀釋液飼養(yǎng)10 d,收集成蟲置于-20℃冰箱中保存、備用。

    1.2 提取生殖系統(tǒng)

    選取無病變、品相良好的橘小實蠅雌雄成蟲各10頭,無菌水沖洗干凈。在超凈工作臺內(nèi)用75%酒精沖洗2次,每次2 min,倒掉酒精;用無菌水漂洗3次,去除雜質(zhì);再在加有少量無菌水的培養(yǎng)皿中解剖,取出雌雄成蟲生殖系統(tǒng),放入2 mL EP管中,加入1 mL無菌水后充分研磨混勻,用于內(nèi)生細(xì)菌培養(yǎng)。雌雄成蟲各重復(fù)3次。

    1.3 培養(yǎng)生殖系統(tǒng)內(nèi)生細(xì)菌

    上述配制的菌液,用無菌水按照10-2~10-5進(jìn)行梯度稀釋,移液槍吸取50 μL,置于LB培養(yǎng)基上,用無菌涂布棒涂布均勻,靜置10 min,將培養(yǎng)基移至32℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)。培養(yǎng)2 d后,用接種環(huán)挑取生長良好的不同形態(tài)或顏色性狀的單菌落,采用稀釋涂布劃線法,在提前準(zhǔn)備好的經(jīng)過滅菌消毒的LB培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng),得到單一純菌落。將純化后的菌株轉(zhuǎn)至NA培養(yǎng)基斜面上,置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。各稀釋菌液均重?fù)3次。

    1.4 觀察菌落的表觀特征

    接種環(huán)挑取NA斜面上的純菌株,再次接入LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d,觀察記錄菌落形態(tài)、顏色、隆起度、邊緣形狀、表面狀態(tài)、光澤、干濕情況、透明度、細(xì)菌形狀、芽孢有無和革蘭氏染色等特征。

    1.5 擴(kuò)增16S rRNA基因片段

    無菌條件下,挑取NA斜面上的純菌株,接入1 mL高壓滅過菌的NB液態(tài)培養(yǎng)基中,在32℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)3 d。菌液PCR擴(kuò)增反應(yīng)的上游細(xì)菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和下游細(xì)菌通用引物1492R(5′-TACGACTTAACCCCAATCGC-3′),均由上海生物工程股份技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系共30 μL:10×PCR bufferⅡ(with Mg2+)3.0 μL,dNTP Mixture 0.5 μL,968GC和L1401各0.5 μL,菌液1 μL,TaKaRaLaTaq酶(5 U/μL)0.5 μL,ddH2O 24.0 μL。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,56℃退火30 s,72℃復(fù)性1 min;循環(huán)30次,72℃延伸10 min,4℃保溫。擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物送美因基因公司檢測并測序。

    1.6 分析可培養(yǎng)細(xì)菌屬種

    利用DNAstar軟件對得到的序列進(jìn)行編輯、整理,然后在NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST數(shù)據(jù)庫檢索和同源性比對,找出同源性最高的序列。利用Clustal X軟件對測序獲得的16S rRNA基因序列和與之近緣的已知序列進(jìn)行多序性匹配排列,確定測試序列代表的細(xì)菌分類地位(Saitou and Nei, 1987; Thompsonetal., 1997)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 可培養(yǎng)細(xì)菌的菌落特征

    采用LB培養(yǎng)基,從飼養(yǎng)10 d的橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)中,培養(yǎng)出具有不同形態(tài)或顏色性狀的細(xì)菌15株。其中,雌性成蟲9株,雄性成蟲6株。不同菌株菌落,顏色多變,但多為白色、灰白色、黃白色或黃色。革蘭氏染色表明,15株細(xì)菌菌落中11株呈革蘭氏染色陰性反應(yīng),4株呈革蘭氏染色陽性反應(yīng)。顯微鏡觀察顯示,13株細(xì)菌呈桿狀,2種呈球狀(表1)。這些細(xì)菌均可以在32℃條件下生長,培養(yǎng)2~3 d后菌落形態(tài)、顏色性狀明顯。

    2.2 可培養(yǎng)細(xì)菌屬種鑒定

    以橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)分離培養(yǎng)出來的15株細(xì)菌,分別配制的菌液為模板,對菌株16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物送美因基因公司檢測、測序,比對鑒定可培養(yǎng)菌株屬種。

    測得的序列提交到NCBI進(jìn)行blast同源性比對,發(fā)現(xiàn)橘小實蠅雌性生殖系統(tǒng)可培養(yǎng)的9株細(xì)菌來自4門、9屬。變形菌門Proteobacteria內(nèi)有4屬,不動桿菌屬Acinetobacter,蒼白桿菌屬Ochrobactrum、無色桿菌屬Achromobacter和劍菌屬Ensifer;擬桿菌門Bacteroidetes內(nèi)有2屬,金黃桿菌屬Chryseobacterium和鞘脂桿菌屬Sphingobacterium;放線菌門Actinobacteria內(nèi)有2屬,微桿菌屬M(fèi)icrobacterium和細(xì)球菌屬M(fèi)icrococcus;厚壁菌門Firmicutes內(nèi)1屬,芽孢桿菌屬Bacillus。橘小實蠅雄性成蟲生殖系統(tǒng)可培養(yǎng)的6株細(xì)菌來自3門、6屬。變形菌門內(nèi)有3屬,不動桿菌屬、蒼白桿菌屬和假單胞菌屬;擬桿菌門內(nèi)2屬,金黃桿菌屬和擬桿菌屬Bacteroides;厚壁菌門1屬,芽孢桿菌屬(表2)。

    對比分析表明,橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)共有4個相同的細(xì)菌屬,分別是不動桿菌屬、蒼白桿菌屬、金黃桿菌屬和芽孢桿菌屬。雌性成蟲生殖系統(tǒng)特有的細(xì)菌屬,無色桿菌屬、劍菌屬、鞘脂桿菌屬、微桿菌屬和細(xì)球菌屬;雄性成蟲生殖系統(tǒng)特有的細(xì)菌屬,假單胞菌屬和擬桿菌屬(表2)。

    表2 橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)的可培養(yǎng)細(xì)菌屬種

    2.3 可培養(yǎng)的優(yōu)勢細(xì)菌屬

    橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)可培養(yǎng)細(xì)菌各屬菌株數(shù)量所占比例不同。變形菌門內(nèi)的不動桿菌屬菌株所占比例最高,分別占雌雄成蟲生殖系統(tǒng)菌株數(shù)量的35.00%和31.58%,為可培養(yǎng)細(xì)菌的優(yōu)勢菌屬。此外,在雌成蟲生殖系統(tǒng)中,蒼白桿菌屬、無色桿菌屬、擬桿菌屬和鞘脂桿菌屬所占比例較高;在雄成蟲生殖系統(tǒng)中,微桿菌屬和芽孢桿菌屬所占比例較高(圖1)。

    圖1 橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)不同細(xì)菌屬的比例

    3 結(jié)論與討論

    本研究從橘小實蠅雌性成蟲生殖系統(tǒng)中,分離培養(yǎng)出內(nèi)生細(xì)菌9株,分別是不動桿菌屬、蒼白桿菌屬、無色桿菌屬、劍菌屬、金黃桿菌屬、鞘脂桿菌屬、微桿菌屬、細(xì)球菌屬和芽孢桿菌屬;從雄性成蟲生殖系統(tǒng)中,分離培養(yǎng)出內(nèi)生細(xì)菌6株,分別是不動桿菌屬、蒼白桿菌屬、假單胞菌屬、金黃桿菌屬、擬桿菌屬和芽孢桿菌屬。這與王莉莉(2011)從橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)中分離培養(yǎng)出的內(nèi)生細(xì)菌屬種存在差異??赡茉?,一是本研究種群來源于江西贛南臍橙基地,以臍橙為主要食料,飼養(yǎng)到成蟲后直接研究細(xì)菌屬種構(gòu)成;而王莉莉(2011)的研究種群來源于廣東出入境檢驗檢疫部門,以香蕉為主要食料,且在室內(nèi)飼養(yǎng)多代。二是分離培養(yǎng)條件不一致,雖然都采用了LB培養(yǎng)基,但培養(yǎng)基的制備、培養(yǎng)的溫度和時間設(shè)置存在差異。三是測試方法亦存在差異,本研究通過擴(kuò)增16S rRNA基因片段,然后分析鑒定細(xì)菌屬種;而相關(guān)研究則采用高通量測序技術(shù)來分析橘小實蠅生殖系統(tǒng)細(xì)菌屬種(王莉莉, 2011)。因此,研究材料來源、分離培養(yǎng)和測試方法的差異,決定本研究與前人的研究結(jié)果并不一樣。

    本研究結(jié)果表明,橘小實蠅雌性成蟲生殖系統(tǒng)中的內(nèi)生細(xì)菌門、屬,均比雄性多。昆蟲生殖系統(tǒng)中的內(nèi)生細(xì)菌與昆蟲的性別、發(fā)育階段以及昆蟲所處的外界環(huán)境條件密切相關(guān)(Beharetal., 2008; Sharonetal., 2010)。由于實驗所用的橘小實蠅成蟲的發(fā)育階段一致且來自同一采樣地點(diǎn),具有相似的發(fā)育階段和外界條件。因此,本研究橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)內(nèi)生細(xì)菌的屬種變化,可能與橘小實蠅的性別有關(guān)。

    橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)均含有不動桿菌屬、蒼白桿菌屬、金黃桿菌屬和芽孢桿菌屬,其中不動桿菌屬為優(yōu)勢可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌屬。除橘小實蠅外,研究證實不動桿菌屬在南瓜實蠅B.tau(駱米娟等, 2016)和按實蠅Anastrephaludens腸道(Lyudmilaetal., 2001)、澤蘭實蠅Procecidocharesutilis幼蟲體內(nèi)(蘭明先等, 2018)、番石榴實蠅B.orrecta成蟲體內(nèi)(戴陽等, 2020)等多種雙翅目昆蟲中具有分布。因此,可認(rèn)為不動桿菌屬在雙翅目實蠅科昆蟲中普遍存在。有報道,蒼白桿菌屬在番石榴實蠅成蟲體內(nèi)具有分布(戴陽等, 2020);芽孢桿菌屬在澤蘭實蠅幼蟲體內(nèi)具有分布(蘭明先等, 2018);但未查到相關(guān)文獻(xiàn),金黃桿菌屬在相關(guān)實蠅昆蟲體內(nèi)具有分布。

    橘小實蠅雌成蟲特有的細(xì)菌有無色桿菌屬、鞘脂桿菌屬、微桿菌屬、細(xì)球菌屬和劍菌屬。其中,無色桿菌屬和細(xì)球菌屬在瓜實蠅B.cucurbitae體內(nèi)有分布(姚明燕等, 2017);鞘脂桿菌屬、微桿菌屬和細(xì)球菌屬在多種鱗翅目昆蟲棉鈴蟲Helicoverpaarmigera、稻縱卷葉螟Cnaphalocrocismedinalis、菜青蟲Pierisrapae和甜菜夜蛾Spodopteraexergual腸道中發(fā)現(xiàn),鞘脂桿菌屬能夠誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生程序性死亡(楊焊, 2012);劍菌屬多在植物尤其是豆科植物中廣泛分布,與植物固氮作用有關(guān)(陳文峰, 2016),昆蟲中未查到相關(guān)文獻(xiàn)。雄成蟲特有的細(xì)菌屬有假單胞菌屬和擬桿菌屬。研究證實,假單胞菌屬在墨西哥實蠅(Lyudmilaetal., 2001)和南瓜實蠅雄成蟲(駱米娟等, 2016)體內(nèi)亦有分布,能抵御有害病原真菌的侵入與危害(Indiragandhietal., 2007);擬桿菌屬在100 Gy137Cs輻照后的瓜實蠅腸道亦有發(fā)現(xiàn)(姚明燕等, 2017)。至于這些特異性細(xì)菌屬種在橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)中所起的作用,目前仍不清楚。

    本研究從橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng),分離出不同性狀的細(xì)菌15株,分屬4門,11屬,明確雌雄間內(nèi)生細(xì)菌屬種存在差異。仍需要從二方面進(jìn)行研究,一方面是需要根據(jù)細(xì)菌屬種的營養(yǎng)需求和生化特點(diǎn),來設(shè)計針對性的培養(yǎng)基類型,從而分離純化更多可培養(yǎng)的細(xì)菌屬種;另一方面需要對分離純化的各細(xì)菌屬種的生化特點(diǎn)和生物學(xué)功能進(jìn)行研究、探索。本研究對橘小實蠅雌雄成蟲生殖系統(tǒng)可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌屬種的比較研究,為優(yōu)化培養(yǎng)基質(zhì)和培養(yǎng)條件、探索生殖系統(tǒng)相關(guān)細(xì)菌的代謝和功能提供信息。

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