馬蜂內生酵母種群結構分析及Metschnikowia pulcherrima的分離和鑒定

余 蔓，雷勇輝，孫燕飛，熊 杰，李 楊*

(1.石河子大學生命科學學院，新疆石河子 832003；2.石河子大學農(nóng)學院，新疆石河子 832003)

昆蟲體內棲息著一些特殊的內生微生物，在長期協(xié)同進化過程中，內生微生物有利于昆蟲的適應與生存，還對昆蟲的營養(yǎng)代謝、生長發(fā)育、生殖行為、免疫抗病等生命過程產(chǎn)生重要影響(王愛靜等，2000，張振宇等，2017)。

昆蟲內生酵母是昆蟲內生微生物中的常見類群之一。近年來，在介殼蟲等昆蟲體內先后發(fā)現(xiàn)許多內生酵母新種(Heetal.，2013；Oliveiraetal.，2014；Renetal.，2015；Liuetal.，2016)。在東亞飛蝗Locustamigratoriamanilensis體內發(fā)現(xiàn)有擲孢酵母屬Sporobolomyces和擬威爾嗜殺酵母屬Cyberlindnera(劉開平等，2018)。刺腿食蚜蠅IschiodonscutellarisFabricius體內含有的酵母種群也十分豐富(米桃桃等，2019)。這些昆蟲內生酵母菌具有特殊的生理生化特性，例如褐飛虱Nilaparvamlugens體內含有一種酵母可將尿酸轉化為氨基酸供給宿主昆蟲營養(yǎng)(侯云等，2013)，某些內生酵母還具有分解木聚糖的特性(Oliveiraetal.，2014)。

馬蜂VespavelutinaSmith是一種廣泛分布的群居社會性昆蟲。馬蜂主要以鱗翅目幼蟲為食，因而可被應用于有效防治棉鈴蟲HelicoverpaarmigeraHübner等農(nóng)業(yè)害蟲(李鐵生，1987)。最近有研究報道馬蜂腸道內含有可抑制反枝莧Amaranthusretroflexus的11種絲狀真菌(張?zhí)N等，2015)。然而，截止目前，關于馬蜂內生酵母的種類組成及多樣性研究，尚未見報道。本文以新疆石河子本地采集的馬蜂為材料，通過高通量測序技術分析了馬蜂內生酵母種群組成，并對菌株進行了分離純化和初步鑒定。本研究將為馬蜂內生酵母的生理功能研究及酵母菌資源開發(fā)和應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 馬蜂采集

2019年8月在新疆石河子西公園草坪上，用捕蟲網(wǎng)捕獲得30頭馬蜂，將捕獲的馬蜂裝入含乙醚的離心管中，帶回實驗室，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 培養(yǎng)基

(1)馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基：馬鈴薯20.0%，葡萄糖2.0%，瓊脂2.0%，pH6.0(瑪依古麗·庫爾班等，2015)。

(2)生理生化培養(yǎng)基：參照2011年《The Yeast:A taxonomic study》的方法配制碳源同化基礎培養(yǎng)基、糖類發(fā)酵基礎培養(yǎng)基、尿素培養(yǎng)基、無維生素培養(yǎng)基(周新麗等，2011)。

1.3 實驗方法

1.3.1馬蜂內生酵母高通量測序分析

挑選30頭馬蜂，浸泡在75%乙醇中30 min，在超凈工作臺用無菌水沖洗3次，加適量無菌水，用研缽研磨成勻漿，濾紙片過濾，再用0.45 μm過濾膜真空抽濾，最后將濾膜送至美吉公司測序。通過Illumina(MiSeq)平臺，以NL-1、NL-2測序引物進行26S rDNA高通量測序(Robnettetal.，2013)。在97%的相似度下，利用軟件QIIME(v.1.8.0)統(tǒng)計樣品中每個操作分類單位(operational taxonomic unit，OTU)物種豐富度信息，并對測序結果進行Alpha多樣性分析，其中包括Shannon多樣性指數(shù)(Shannon diversity index)、Simpson多樣性指數(shù)(The Simpson index)、Chao1豐富度估計指數(shù)(The Chao1 estimator)、ACE豐富度估計指數(shù)(The ACE estimator)(焦晶凱等，2014)。

1.3.2可培養(yǎng)酵母的分離純化

將蟲體研磨勻漿，吸取1 mL液體，按梯度稀釋，取適當稀釋度液體100 μL涂布于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2～3 d，挑取初步確認為酵母單菌落，平板劃線純化2～3次。將分離純化的酵母菌株置4℃斜面保藏。

1.3.3菌株鑒定

(1)觀察菌株菌落和細胞形態(tài)，并參照2011年《The Yeast :A taxonomic study》進行生理生化指標測定(糖發(fā)酵、碳同化、無維生素培養(yǎng)試驗等)。

(2)菌株經(jīng)液體培養(yǎng)后，收集菌體，采用buffer快速抽提法提取基因組DNA(郭奕惠等，2006)，以基因組DNA為模板，PCR擴增26S rDNA序列。PCR擴增體系：ddH2O 14.75 μL，10×Taq buffer 2 μL，dNTP 1.5 μL，MgCl21 μL，上游引物NL-1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGG AAAAG-3′)1 μL，下游引物NL-4(5′-GGTCCG TGTTTCAAGACGG-3')1 μL，模板DNA 2.5 μL，Taq酶0.25 μL。PCR條件：94℃ 10 min，94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1.5 min，30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測條帶正確后，送至上海生工生物公司進行測序，將測序所得26S rDNA序列與GenBank中的序列進行比對，利用MEGA-X軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析并構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 馬蜂內生酵母高通量測序多樣性分析及Alpha多樣性分析

通過Illumina(MiSeq)平臺對馬蜂樣品中提取的DNA進行26S rDNA高通量測序分析并優(yōu)化，通過OTU聚類分析，真菌的OTU數(shù)分別為11個門、25個綱、42個目、49個科、54個屬、60個種，未分類2個；與2011年《The Yeast :A taxonomic study》和GenBank數(shù)據(jù)庫新種對比后，并進一步優(yōu)化分類鑒定，內生酵母含有3個門、6個綱、7個目、8個科、10個屬、10個種(表1，表2)，酵母類OUT數(shù)在真菌OTU總數(shù)的所占比例大于或等于0.5%。

表1 各OTU上酵母類群統(tǒng)計結果

表2 馬蜂內生酵母類群屬水平分布情況

在屬的水平上，Cutaneotrichosporon為內生酵母菌的優(yōu)勢屬，占70.05%，孢圓酵母屬Torulaspora占19.78%，Sporidiobolales-unclassified占5.88%，畢赤酵母屬Pichia占1.34%，而酵母菌屬Saccharomyces、Pseudozyma、擬威爾嗜殺酵母屬Cyberlindnera、黑粉菌屬Filobasidium、Pleurostylic和金擔子菌屬Aureobasidium占比例都小于1%。

在種的水平上，馬蜂內生酵母共有10個種，其中，Cutaneotrichosporoncutaneum和Torulasporadelbrueckii及Sporidiobolalessp.為優(yōu)勢種，所占比例依次為54%、30%和9%，其余7個種所占比例較小，都小于2%(表3)；而Sporidiobolalessp.屬于未鑒定的種，很可能是一種酵母新種?？傮w上，馬蜂體內內生酵母種群組成多樣，且分布不均。

表3 馬蜂內生酵母類群種水平分布情況

通過軟件QIIME(v.1.8.0)對樣品進行Alpha多樣性分析，結果如表4所示。ACE指數(shù)84.38456，Chao1指數(shù)76，表明馬蜂內生酵母種群多樣性較高，豐富度較大；Shannon指數(shù)為0.619215，Simpson指數(shù)為0.681265，顯示內生酵母種群均勻度適中。

表4 馬蜂內生菌群微生物多樣性

2.2 可培養(yǎng)酵母菌株形態(tài)特征與生理生化特征

通過稀釋平板分離純化，獲得一株酵母菌，命名為MF-17菌株，經(jīng)菌落、細胞形態(tài)特征觀察，菌株MF-17菌落紅色圓形狀奶油質地，邊緣整齊，表面光滑濕潤，側面凸起，細胞大小為5～10 μm，細胞形態(tài)呈卵圓形，無性生殖為單端芽殖(圖1)。

圖1 MF-17菌株的菌落和細胞形態(tài)

菌株MF-17的糖類發(fā)酵及其它生理生化指檢測結果如表5所示。在無維生素培養(yǎng)基上菌株MF-17不能生長；菌株最高生長溫度可達40℃；菌株因不產(chǎn)生尿素酶而不能分解利用尿素。糖發(fā)酵試驗結果顯示，菌株MF-17可分解利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣，而在以乳糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉等6種糖為碳源的培養(yǎng)基中卻不能產(chǎn)酸產(chǎn)氣。

表5 MF-17菌株生理生化測定結果

碳源同化結果如表6所示，在有氧條件下，菌株MF-17可以利用半乳糖、麥芽糖、蔗糖、松三糖及甘油，而不能利用鼠李糖、棉子糖和阿拉伯糖。在無氧發(fā)酵和有氧狀態(tài)下，菌株對麥芽糖、蔗糖的分解利用能力存在差異，表明菌體在不同條件下對同一底物的分解利用可能存在多種不同的分解機制。對照菌種鑒定手冊，綜合形態(tài)特征及生理生化特征檢測結果，初步鑒定菌株MF-17屬于Metschnikowia。

表6 MF-17菌株碳源同化結果

2.3 基于26S rDNA D1/D2區(qū)序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析

以MF-17菌株基因組DNA為模板，以通用引物擴增26S rDNA的D1/D2區(qū)，獲得序列為516 bp，測序結果與GenBank數(shù)據(jù)庫已知序列比對，結果顯示，MF-17菌株與菌株Metschnikowiapulcherrima(KY108494.1)序列同源性高達98.785 %。

利用MEGA-X構建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖2所示，MF-17菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹上與M.pulcherrima(KY108494.1)菌株處于同一進化分支，與基于生理生化特征的鑒定結果基本相符。綜合形態(tài)、生理生化特征及分子系統(tǒng)發(fā)育分析結果，可確定菌株MF-17為M.pulcherrima。

圖2 MF-17菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結論與討論

迄今為止，高通量測序技術是研究特定生境微生物群落組成及物種多樣性的有效方法。本研究利用高通量測序技術測定新疆石河子的馬蜂內生酵母種群組成及豐度，內生酵母共10個屬，內生酵母種類組成多樣，但具體種屬豐度相差較大。其中Cutaneotrichosporon為優(yōu)勢屬，占比70.05%。此外，在樣品中測得一種未能鑒定到種的酵母Sporidiobolalessp.，可能為潛在的酵母新種資源。

理論上，通過稀釋平板分離方法可分離昆蟲體內的大多數(shù)或部分內生酵母(米桃桃等，2019)，但本研究從馬蜂體內未能分離獲得高通量分析結果顯示的酵母優(yōu)勢種?？赡艿脑蚴莾?yōu)勢種內生酵母對昆蟲體內環(huán)境依賴性較強，在與自然生境條件明顯不同的實驗室培養(yǎng)條件下，酵母菌不能離體生長(廖麗花，2018)；此外，也可能因為內生酵母對營養(yǎng)、溫度、pH、氧氣等可能有復雜而特殊需求，而用常規(guī)的PDA培養(yǎng)基分離方法不能獲得酵母菌培養(yǎng)物；再者，內生酵母在離體培養(yǎng)條件下由于環(huán)境不適而生長緩慢，導致在一定短時間內無法形成肉眼可見的單菌落，因而可能被忽略。

本研究從馬蜂體內分離了一株內生酵母MF-17菌株，鑒定為M.pulcherrima。菌株MF-17最高生長溫度比對照菌株M.pulcherrima(KY108494.1)稍高，可能與長期適應昆蟲體內特殊環(huán)境有關。據(jù)研究報道，M.pulcherrima屬于一種非釀酒酵母，分泌胞外酶能力強，多附生于植物體表，有拮抗植物病害的作用，也是使釀酒增香或變質的因素(Esteve-Zarzosoetal.，1998；Schenaetal.，2000；Spadaroetal.，2002；Jollyetal.，2006)。也有少數(shù)報道在昆蟲或其它動物體分離到M.pulcherrima，例如，果蠅體內也含有梅奇酵母屬Metschnikowia，且兩者有密切的聯(lián)系，利用這種關系可以研發(fā)引誘劑并參與到農(nóng)業(yè)病蟲害防治中(Hamby，2012)。本研究從馬蜂體內也分離出了此屬酵母，后續(xù)可深入研究，挖掘其在植物病蟲害防治或果酒釀造方面可能的應用潛力。

然而，平板分離獲得的M.pulcherrima并不存于先前的高通量測序結果顯示的10個酵母種之中。據(jù)推測，在高通量測序時，因PCR擴增過程的微量堿基錯配，高通量測序結果出現(xiàn)偏差，可能導致某些酵母菌種未能檢測到(張帆等，2019)。此外，由于不同馬蜂個體內生酵母種類存在差異或采樣批次不同，可能導致高通量測序樣品和分離樣品存在差異。其實，平板分離純化獲得菌與高通量分析結果不一致的情況，在其他類似研究也屢次被報道。最近有研究揭示在二月蘭Orychophragmusviolaceus、龜甲飲片中分離真菌與高通量測序分析結果不盡相符(張帆等，2019，肖博文等，2020)。高通量測序分析法與平板分離法相結合，才可能相對較全面準確地認識昆蟲內生微生物種群構成及豐富度分布特點。嚴格地說，由于本研究采集的馬蜂樣品有限，實驗結果雖然并不能全面準確地反映馬蜂內生酵母的種群組成實際情況，但在一定程度上，也體現(xiàn)了馬蜂內生酵母組成的多樣性特點。本研究通過平板分離方法只分離得到的一株內生酵母菌株，在后續(xù)研究中，可考慮模擬內生菌自然生境條件，通過對培養(yǎng)基、生長溫度、pH等條件優(yōu)化，有望分離到更多的內生酵母。