不同濃度殼聚糖對S 型變形鏈球菌抑菌性能影響對比研究*

王從 劉新慶

（1 浙江省中西醫(yī)結合醫(yī)院 杭州310003；2 江西省人民醫(yī)院 南昌330006）

在以往的抗齲制劑研究以及臨床應用中，氟化物的抗齲作用已得到廣泛認可[1~4]。臨床上最常用的氟化物為氟化鈉（NaF），但由于其生物活性不高，通常需要較大劑量才能達到臨床防齲抑菌的效果。然而，高劑量的氟化物容易導致耐氟菌株的出現(xiàn)以及嬰幼兒氟中毒[5]。因此，當務之急是找到安全有效的生物防齲制劑。

本實驗主要研究純天然生物制劑殼聚糖（CTS）的抑菌性。通過對比不同濃度CTS 與NaF 對S 型變形鏈球菌（S.Mutans）的影響，評估 CTS 對 S.Mutans的抑制作用，為CTS 作為口腔抑菌劑使用提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報道如下：

1 材料和方法

1.1 材料 實驗菌株：S.Mutans ATCC25175 菌株由廣東省微生物菌種保藏中心提供。主要實驗試劑的配制：（1）腦心浸液肉湯（BHI）液體培養(yǎng)基的配制。用電子天平稱取38.5 g BHI 粉末，而后溶于1 000 ml 蒸餾水，高壓滅菌后備用。（2）CTS 溶液的配置。用乙酸溶液溶解CTS 粉末，用1 mol/L NaOH溶液調節(jié)pH 至5.4 并定容至100 ml，121℃高壓滅菌15 min 進行二次稀釋，得到濃度為0.01%、0.03%、0.05%、0.10%、0.30%、0.50%的 CTS 溶液。（3）NaF 溶液的配置。用5 g 無水NaF 粉劑和50 ml雙蒸水配制10% NaF 溶液，二次稀釋至0.01%、0.03%、0.05%、0.10%、0.30%、0.50%。S.Mutans 復蘇培養(yǎng)：用75%酒精棉球擦拭S.Mutans 凍干菌種管表面，進行消毒，在無菌條件下打開，吸取0.5 ml BHI，并將所有凍干粉末加入裂解液凍干管中，重復移液幾次以完全溶解并混合細菌粉末。用無菌移液管吸取溶解后的菌種懸液，接種于BHI 平板內，并在80%N2、20%CO2、10%H2條件下，37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，使之成為菌落。隨后進行涂片，革蘭染色，油鏡下觀察。S.Mutans 傳代培養(yǎng)：將待復蘇細菌鑒定為純培養(yǎng)后，傳33 代培養(yǎng)第一代細菌，通過轉接2~3 代恢復凍干細菌的整個生命活力，此時細菌處于性能穩(wěn)定的對數(shù)生長期，各項指標均可充分表達。S.Mutans 菌懸液制備：挑取第3 代菌落并接種到BHI 液體培養(yǎng)基中，常規(guī)環(huán)境培養(yǎng)48 h。離心細菌培養(yǎng)液，分離細菌，稀釋至 5×106個 /ml，待用。S.Mutans 的長期保存：將0.85 ml 細菌菌懸液加入0.15 ml 高壓滅菌甘油中，搖動混合液使二者混合均勻，并在-80℃下冷凍。

1.2 CTS 與 NaF 對 S.Mutans 增殖作用影響檢測（1）細菌接種：根據(jù)不同的實驗藥物將實驗分成兩組，每組用96 孔板覆蓋。首先，用藥物種類和濃度標記孔板，然后按照設定的濃度梯度將S.Mutans 懸液依次加入孔板，每孔加入100 μl 菌液，確保細菌濃度的一致性。接種完成后，順時針輕輕旋轉并敲打孔板的邊緣，靜置4~5 min，在37℃恒溫的無氧環(huán)境中孵育。（2）細菌培養(yǎng)與呈色：厭氧培養(yǎng)48 h 后，細菌進入對數(shù)生長期，加入噻唑藍（MTT）20 μl，孵育4 h，離心，分離細菌。然后用移液管小心地從孔中取出液體，在黑暗中操作每孔加入150 μl 二甲基亞砜（DMSO），搖動 10 min，靜置 10 min。（3）比色：在進行下一步實驗操作前，確認每個孔中沒有氣泡。重復測3 次490 nm 波長下的光密度值（OD 值），取平均值，以濃度（橫坐標）和OD 值（縱坐標）繪制S.Mutans 生長曲線。

1.3 CTS 與 NaF 對 S.Mutans 產(chǎn)酸能力影響檢測（1）將 130 支 10 ml 無菌培養(yǎng)管分為 CTS 六組、NaF六組、對照組，每組10 支。將BHI 營養(yǎng)肉湯、細菌懸浮液和不同濃度的藥液按比例添加到每個管中，搖動混合物，使各實驗組培養(yǎng)液中CTS 與NaF 的濃度梯度均為 0.01%、0.03%、0.05%、0.10%、0.30%、0.50%。等量的無菌雙蒸水作為對照組。（2）根據(jù)濃度梯度對各組進行編號，并用復合pH 電極記錄每組的初始pH。（3）常規(guī)培養(yǎng)，測量每組的終末pH。計算pH 差值（ΔpH），評估細菌生長狀況。

1.4 統(tǒng)計學分析 用SPSS17.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。以P＜0.05 表明差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CTS 與 NaF 對 S.Mutans 增殖作用影響比較恒溫培養(yǎng)48 h 后應用MTT 法檢測不同濃度CTS與 NaF 作用于 S.Mutans 時的吸光度值（OD490）。結果顯示在不同的濃度條件下，兩種藥物作用于S.Mutans 測得的OD 值不同。隨著藥物濃度增加，OD 值表現(xiàn)為下降趨勢。藥物干預下的細菌活性低于陰性對照組，抑菌效果呈濃度依賴性。OD 值比較，NaF 組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；CTS 組與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；NaF 組與 CTS 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表 1、表 2 和圖 1。

表1 不同濃度CTS 與NaF 對S.Mutans 增殖影響比較（）

表1 不同濃度CTS 與NaF 對S.Mutans 增殖影響比較（）

組別 n NaF濃度（%）OD 值nCTS濃度（%）OD 值對照組實驗組10 10 10 10 10 10 10 0.00 0.01 0.03 0.05 0.10 0.30 0.50 1.656±0.043 0.685±0.043 0.451±0.047 0.356±0.021 0.311±0.059 0.185±0.037 0.129±0.031 10 10 10 10 10 10 10 0.00 0.01 0.03 0.05 0.10 0.30 0.50 1.586±0.043 0.336±0.012 0.215±0.036 0.210±0.016 0.201±0.078 0.158±0.011 0.129±0.089

表2 三組OD 值比較

圖1 CTS 與NaF 對S.Mutans 增殖作用影響趨勢圖

2.2 CTS 與 NaF 對 S.Mutans 產(chǎn)酸能力影響比較實驗組ΔpH 通常小于對照組，表明對照組培養(yǎng)管內變形鏈球菌的數(shù)量較大而且產(chǎn)酸代謝活躍。在含有抑菌制劑的實驗組中，培養(yǎng)管內變鏈菌的產(chǎn)酸能力受到顯著抑制。見表3、表4 和圖2。

圖2 CTS 與NaF 對S.Mutans 產(chǎn)酸作用影響趨勢圖

表3 不同濃度CTS 與NaF 對S.Mutans 產(chǎn)酸能力影響比較（）

表3 不同濃度CTS 與NaF 對S.Mutans 產(chǎn)酸能力影響比較（）

組別 n NaF濃度（%）ΔpHnCTS濃度（%）ΔpH對照組實驗組10 10 10 10 10 10 10 0.00 0.01 0.03 0.05 0.10 0.30 0.50 3.225±0.093 2.257±0.090 2.091±0.035 1.855±0.143 1.440±0.144 1.235±0.091 0.114±0.010 10 10 10 10 10 10 10 0.00 0.01 0.03 0.05 0.10 0.30 0.50 3.225±0.093 1.478±0.145 1.279±0.068 0.234±0.047 0.204±0.018 0.184±0.017 0.124±0.010

表4 三組ΔpH 比較

3 討論

近年來，隨著口腔保健意識的提高，接受正畸治療的人群比例越來越高。然而正畸治療會帶來一系列并發(fā)癥。托槽類正畸附件的存在影響正畸患者口腔衛(wèi)生措施的實施，致使細菌數(shù)量顯著增加，從而加大患齲風險。研究發(fā)現(xiàn)，一名患者戴固定矯治器一個月后牙面上牙菌斑中S.Mutans 的數(shù)量可增加至治療前的2 倍[6~7]。細菌的聚集和持續(xù)存在會導致齲齒的發(fā)生，從而影響正畸治療的效果和患者的健康。因此，選擇一種天然無毒、安全有效的抑菌制劑已成為近年來的研究熱點。

諸多國內外學者都試圖從天然產(chǎn)物中分離和提取能夠預防齲齒的有效成分，并取得了可喜的成果。例如從玉米、甘蔗和其他植物中提取木糖醇以制造糖替代品，但由于其使用方式與大多數(shù)糖醇相同，因此用量有限。目前主要應用在口香糖中，用作糖替代品[8]。然而，木糖醇的成功開發(fā)和應用也證實了使用天然產(chǎn)物作為生物制劑的可行性。

近年來，天然產(chǎn)物甲殼素及其衍生物CTS 逐漸成為多個領域的研究熱點[9]。甲殼素來源豐富、方便獲取，廣泛存在于甲殼類動物、藻類和真菌細胞壁中，具有優(yōu)異的性能，如無刺激性、不與體液反應、可生物降解性、生物相容性良好及對細胞具有親和性等，因此特別適合于應用在醫(yī)藥保健領域[10]。近年來，關于口腔治療方面的研究報告也逐漸增加。

本實驗中選擇同等濃度條件下的NaF 作為實驗對照組，更有利于為CTS 作為抑菌劑使用可行性提供依據(jù)。通過MTT 法測定細菌吸光度值，測定ΔpH 的方法檢測CTS 對S.Mutans 的影響，以綜合評價殼聚糖的防齲作用。

MTT 法檢測原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT 還原為水不溶性的藍紫色結晶甲臜，并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。在本次實驗中，使用DMSO 溶解細胞中的甲臜，并且使用酶標儀在490 nm 波長下測定其OD 值[11]?；跍y得的OD 值判斷細菌數(shù)量。OD 值越大，細菌活性越強。MTT 結果顯示，殼聚糖組的OD 值小于對照組，差異顯著（P＜0.05），殼聚糖組和氟化鈉組OD值比較，無顯著性差異（P＞0.05）。這表明殼聚糖有一定抑制細菌繁殖作用。

細菌作用的一個主要特點為產(chǎn)酸繼而使周圍pH 值降低[12]。根據(jù)這一特點，本研究設計檢測不同濃度藥物作用后培養(yǎng)基pH 的變化，計算ΔpH，評估細菌活性從而判斷藥物抑菌作用。研究結果表明，CTS 和NaF 均能夠抑制實驗菌的產(chǎn)酸，抑制pH 降低，再次驗證CTS 的抑菌作用。

本實驗從基礎研究層面證實了CTS 的抑菌作用，后期研究將會以此為基礎研究口腔條件下不同濃度殼聚糖的抑菌效果。